全 文 ：口腔颌面外科杂志 2007年3月 第17卷 第1期
JournalofOralandMaxilofacialSurgeryVol.17No.1March,2007
收稿日期:2006-12-20
基金项目:国家教委留学人员回国启动基金
作者简介:李晋芳(1977-),女,山西太原人,硕士研究生.
E-mail:snow9876@126.com
通讯作者:廖建兴,主任医师.E-mail:Ljx@mail.tongji.edu.cn
Tel:021-66315175
岩黄连是我国传统名贵中药材,现代医药发现
岩黄连具有抗菌消炎、抗肿瘤等药理作用。许多临床
研究表明岩黄连对各种肿瘤有明显的抑制作用[1,2],
但对其抑瘤作用的机制研究较少。端粒酶活性变化
程度与细胞衰老、永生化和癌变相关,其活性增强是
细胞恶性转化的重要环节[3-5]。据统计85%以上恶性
肿瘤中被检出具有端粒酶活性。本文研究了岩黄连
总碱(yanhuangliantotalalkalions,YHL-TA)对端粒
酶活性的影响并探讨其抑瘤作用机制。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
岩黄连总碱抑制Tca8113细胞及其端粒酶活性的实验研究
李晋芳 1,廖建兴 1,李慧梁 2,张卫东 2
(1.同济大学附属口腔医院口腔颌面外科,上海 200072;2.第二军医大学天然药物化学研究所,上海 200433)
[摘要]目的:研究中草药岩黄连总碱(yanhuangliantotalalkalions,YHL-TA)对人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞增殖和
端粒酶活性的影响及其抗癌机制。方法:采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测YHL-TA浓度分别为0.200、0.100、0.050、
0.025g/L和空白对照组Tca-8113细胞增殖的情况,同时用以 PCR为基础的 TRAP-ELISA法检测 Tca8113细胞端粒
酶活性的改变。所有数据采用SPSS13.0进行统计学分析。结果: 岩黄连总碱能明显抑制Tca8113细胞增殖,且呈浓
度和时间依赖性。72h时,0.200、0.100、0.050、0.025g/L岩黄连总碱组细胞增殖抑制率分别为 (66.0±4.0)%、(57.5±
3.2)%、(45.3±3.3)%、(37.9±5.5)%。72h时,0.100、0.050g/L组端粒酶活性低于空白对照组(P<0.05)。结论: 岩黄连总
碱可以明显抑制Tca8113细胞株的增殖及其端粒酶活性,抑制端粒酶活性可能是岩黄连总碱抗舌癌的机制之一。
[关键词]舌癌;端粒酶;岩黄连总碱
[中图分类号]R739.86;R285.5 [文献标识码]A [文章编号]1005-4979(2007)01-0032-04
InhibitionofYanhuanglianTotalAlkalionsonCelProliferationandTelomerase
ActivityofTca8113CelLines
LIJin-fang1,LIAOJian-xing1,LIHui-liang2,ZHANGWei-dong2
(1.DepartmentofOralandMaxilofacialSurgery,HospitalofStomatology,TongjiUniversity,Shanghai
200072;2.DepartmentofNaturalMedicineChemistry,SecondMilitaryMedical
University,Shanghai200433,China)
[Abstract]Objective:Toinvestigatetheefectsofyanhuangliantotalalkalions(YHL-TA)oncelproliferationandhuman
telomeraseactivityofhumanTca8113cellines.Methods:Tca8113cellinesweretreatedbyYHL-TAinconcentration
of0.025、0.050、0.100、0.200g/Lrespectivelyandcomparedwithblankcontrolgroups.Celproliferationinhibitionratio
wasassayedwithMTT,andtelomeraseactivitywasdetectedbytelomericrepeatamplificationprotocalenzymelinked
immunosorbentassaybasedonPCR(TRAP-ELISAassay).Datawereanalyzedbyone-wayANOVA.Results: Cel
proliferationofTca8113weresignificantlyinhibitedbyYHL-TA. TheproliferationinhibitingrateofYHL-TAin
concentrationof0.200,0.100,0.050,0.025g/LonTca8113celat72hourswere(66.0±4.0)%,(57.5±3.2)%,(45.3±3.3)%,
(37.9±5.5)%respectively(F=158.108,P<0.05).ResultofELISAassayshowedthattelomeraseactivitywasdecreasedafter
treatedbyYHL-TAfor72hours.Conclusion:YHL-TAshowsthecapabilitytoinhibittheproliferationofTca8113cels
andtelomeraseactivityofTca8113cellines.ThismaybeoneofthemechanismsforanticancerfunctionofYHL-TA.
[Keywords] tonguecarcinoma;telomerase;yanhuangliantotalalkalions(YHL-TA)
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李晋芳,等.岩黄连总碱抑制 Tca8113细胞及其端粒酶活性的实验研究
LIJin-fang,etal.InhibitionofYanhuanglianTotalAlkalionsonCel
ProliferationandTelomeraseActivityofTca8113CelLines
人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞 (上海交
通大学口腔医学院生物研究室惠赠),采用含 10%
小牛血清 (杭州四季青生物公司,中国)的RPMI-
1640培养基(Gibco公司,美国),于37℃、体积分数为
5%CO2饱和湿度孵箱(Nuair公司,美国)中培养。
1.2 主要试剂
岩黄连总碱 (第二军医大学药学院天然药化教
研室提供,纯度>98%),用生理盐水溶解成 1g/L,保
存于-20℃下,用时稀释成所需浓度。主要 TRAP-
ELISA试剂:端粒酶活性检测试剂盒 S7750-KIT
(Chemicon公司 美国)。核酸凝胶染料为 SYBR
GreenINucleicAcidGelStain(invitrogen公司,美
国)。蛋白浓度测定用Bradford工作液(Sigma公司,
美国),血清白蛋白(上海华舜生物工程有限公司)。
1.3 噻唑蓝比色法检测细胞增殖抑制
采用噻唑蓝(Sigma公司,美国)比色法(MTT法)
检测细胞增殖能力。将对数期Tca8113细胞单细胞
悬液以1×104个/孔接种于96孔板,每孔180μL,设
空白培养基为对照。每孔加入岩黄连总碱20μL,使
终浓度分别为0.200、0.100、0.050、0.025g/L,每个浓
度平行3孔,留一组孔加入 20μL空白培养基为对
照。加药后第24、48、72h分别加5g/L噻唑蓝溶液
20μL/孔;4h后,加入 200μL二甲亚砜(Sangon公
司,加拿大),置酶标仪(BIO-RAD公司)检测A490nm
的吸光度值,计算各组均值。并按下式计算:生长抑
制率公式=[1-(给药-本底)/(对照-本底)]×100%。
1.4 端粒酶活性检测方法
1.4.1 PCR-ELISA测定 端粒酶添加端粒重复序列
(TTAGGG)到生物素标记、人工合成的PI(TS)引物的3′
端,经PCR反复扩增PI(TS)和PⅡ(RP)引物间的特异
产物,产生含端粒酶特异6-核苷酸的PCR产物。将
PCR产物变性后,与地高辛标记的端粒特异性重复序
列检测探针杂交,杂交产物通过生物素标记探针固定
到生物素亲和蛋白包被的微孔板上。固定的PCR产
物被过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体(Anti-DIG-POD)
检测。最后,过氧化物酶使反应底物 TMB(Tet-
ramethylbenzidine)产生有色反应,使探针得以显示。
1.4.2 端粒酶提取 将106个细胞放入加有200μL
预冷的裂解液的灭菌反应管中。置冰上30min后,
在4℃、12000g离心20min,小心取出上清于DEPC
处理过的离心管,Bradford法检测抽提液中蛋白质
含量,调整各标本蛋白浓度为1g/L,-80℃下冻存备用。
1.4.3 端粒重复扩增 50μL反应体系中包括
dNTP、Taq酶、内参引物、生物素标记的引物Ⅰ(TS)
为5′-AATCCGTCGAGCACAGTT-3′、生物素标记的
引物Ⅱ(RP)、用抽取液 1μL进行引物延伸:置 30℃
下 30min,循环 1次;PCR扩增:置 94℃下 30s、
55℃下30s,循环33次。
1.4.4 电泳分析 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶,
SYBRGreenI核酸凝胶染料染色,电泳条件为垂直
电 泳 槽 (BIO-RAD公 司 ),0.5×TBE(Tris-Borate-
EDTA)缓冲液,凝胶电泳仪(BIO-RAD公司),电压
400V、90min。GDS-800型凝胶成像系统成像。
1.4.5 扩增产物进行杂交和ELISA过程 5μLPCR
扩增产物、20μL变性试剂在室温上保温10min,加
入225μL杂交液 (含地高辛标记的检测探针 DIG-
labeledprobe),充分混匀后,取其中的 100μL混合
液于抗生物素蛋白包被好的微孔板上,置于 37℃、
速度为300r/min的摇床上保温 2h。经洗涤后,加
入抗DIG-POD100μL,18～22℃、30mim。最后加入
100μLPOD的底物TMB显色10min,加终止液终
止反应,用酶标仪测 450nm和 690nm的吸光度,
计算每样本值 A=A450-A690计算,如吸光度差值
Δ%高于0.150,则判为阳性。Δ%=A样本-A灭活样本。
1.5 统计学处理
所得实验数据以x±s表示,所有数据应用
SPSS13.0windows统计软件进行处理,组间差异比较
采用ANOVA单因素方差分析检验法,以P<0.05认
为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 岩黄连总碱对Tca8113细胞增殖的抑制作用
岩黄连总碱作用于Tca8113细胞后72h,倒置
荧光显微镜下实验组贴壁细胞出现明显的皱缩、变
圆、脱落等细胞凋亡现象(图1)。MTT法测24h时,
0.200、0.100、0.050、0.025g/L岩黄连总碱组细胞增
殖抑制率分别为(34.7±4.7)%、(25.5±3.7)%、(21.6±
2.6)%、(13.4±2.3)%;48h时为(44.2±2.0)%、(31.9±
4.3)%、(26.3±2.0)%、(17.4±2.2)%;72h时为(66.0±
4)%、(57.5±3.2)%、(45.3±3.3)%、(37.9±5.5)%。各时
间段实验组与对照组相比,增殖活性显著下降 (P<
0.05)。同一浓度岩黄连总碱组随作用时间增加,对
细胞增殖抑制作用增加(P<0.05)。表明岩黄连总碱
体外对Tca8113细胞有抑制其增殖作用,并存在时
间和浓度依赖性(图2)。
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口腔颌面外科杂志 2007年3月 第17卷 第1期
JournalofOraland MaxillofacialSurgeryVol.17 No.1 March,2007
2.2端粒酶活性表达
TRAP法检测样本提取物,位于36 bp处为内参
条带,从50 bp处开始每隔6 bp出现一个条带,形
成明暗相间的梯状条带产物,表示端粒酶活性为阳
性。如果仅出现内参,表示端粒酶活性为阴性。岩黄
连总碱作用于Tca8113细胞端粒酶活性检测凝胶电
泳如图3所示,明暗相间的条带亮度随药物浓度增
高和作用时间延长变暗。尤其是0.100 g/L组,72 h
样本 (条带7)显示条带亮度明显暗于阳性对照条
带。表明YHL-TA对Tca8113细胞端粒酶活性具有
一定的抑制作用。
2.3 ELISA半定量检测端粒酶活性
空白对照组和岩黄连总碱0.050、0.100 g/L组3
组的端粒酶活性表达呈逐渐下降趋势;24 h岩黄连
总碱 0.100 g/L组端粒酶活性即受到抑制;72 h时,
岩黄连总碱组端粒酶活性明显低于对照组 (P<0.05)。
同一浓度岩黄连总碱组,随岩黄连总碱作用时间的
延长,对端粒酶活性抑制作用增强(表1,图4)。
3 讨论
端粒酶存在于大部分肿瘤细胞中,而在正常细
胞是检测不到端粒酶活性的。端粒酶活化是细胞永
生化的必须途径,而获得永生是肿瘤恶变的重要一
步。因此有学者提出了恶性肿瘤发生的端粒酶理论[6]。
从中药提取的抗肿瘤有效成分日益得到人们的
图1 岩黄连总碱(0.025 g/L)作用72 h后对照组和实验组Tca8113
细胞(×100)
A:实验组; B:对照组
Figure 1 Tca8113 cell lines of control group and experimental
group after been treated byYHL-TA (0.025g/L) for 72
hours (×100)
A:experimental group; B:control group
A
B
图2 岩黄连总碱对Tca8113细胞增殖的抑制作用
Figure 2 YHL-TA Inhibition on cell proliferation of Tca8113 cell
lines
8 7 6 5 4 3 2 1
图 3 不同时间及不同浓度 YHL-TA作用下 Tca8113细胞端粒酶
活性表达(10%凝胶电泳图)
1:阳性对照(0g/L);2:0.050 g/L、24 h;3:0.050 g/L、48 h;4:0.050 g/L、
72 h;5:0.100 g/L、24 h;6:0.100 g/L、48 h;7:0.100 g/L、72 h;8:阴性
对照(加热灭活)
Figure 3 Telomerase activity of Tca8113 cell lines treated with
YHL-TAin different concentration and different period
(10%PAGE analysis)
1:positive control(YHL-TA 0 g/L);2:0.050 g/L, 24 h;3:0.050 g/L, 48 h;
4:0.050 g/L, 72 h;5:0.100 g/L, 24 h;6:0.100 g/L, 48 h;7:0.100 g/L, 72 h;
8:heat-inactive control
作用时间(h)
岩黄连总碱分组浓度
对照组(0g/L)
0.100g/L 0.050g/L
24 1.72±0.04* 1.82±0.06 1.91±0 02
48 1.44±0.04*# 1.78±0.04* 1.93±0.03
72 1.32±0.03*# 1.61±0.04*# 1.91±0.03
表1 不同时间及不同浓度YHL-TA作用下Tca8113细胞端粒酶活
性表达(x±s)
Table1 Telomeraseactivity of Tca8113 cell lines treated byYHL-
TA in different concentration and different period(x±s)
注:*与同时间空白对照组比较,P<0.05;﹟与24 h同一浓度组比较,
P<0.05
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重视。据不完全统计,来源于植物药的抗癌制剂,占
总抗癌药的32.25%。近年来研究发现,植物药物中
有很多化学成分都具有抗肿瘤活性,归纳起来主要
有以下几大类:生物碱、甙类、黄酮类、多糖等。随着
端粒、端粒酶研究的不断深入,以抑制端粒酶活性为
靶点的肿瘤治疗研究越来越多,研究证实许多天然
草药成分具有端粒酶抑制作用。先后有学者发现板
蓝根二酮 B[7],茶多酚[8],榄香烯[9]具有端粒酶活性抑
制作用。由于天然小分子抑制端粒酶活性不同于普
通的具有细胞毒性的抗肿瘤治疗,将有望成为更有
效更安全的肿瘤治疗新方案。
岩黄连总碱系用罂粟科紫堇属植物石生黄堇
(corydalis saxicola bucting,又称岩黄连 yanhuanglian)
经提取其有效生物碱而成[10]。岩黄连具有抗肝炎病
毒、抗菌、止痛镇静、提高免疫功能、抗肿瘤等作用,
临床上用于治疗急慢性肝炎、肝硬化、肝腹水、肝癌
及其他肿瘤的辅助治疗。岩黄连中的有效成分通过
体外、半体内及体内法抗肿瘤试验,发现其对小白鼠
肉瘤 180、艾氏腹水癌及肝瘤、腹水癌大鼠肉瘤 256
均有抑制作用,对瘤细胞呼吸亦有抑制作用,能显著
增强腹腔巨噬细胞吞噬功能[11]。另外,岩黄连总碱可
抑制癌组织增生,在肝癌临床治疗中已被证实[4,5],但
它对舌癌的作用及机制尚未得到证实。
本实验所用岩黄连总碱由上海第二军医大学药
学院天然药化教研室提供[12],是在系统的化学成分研
究的基础上,选用重结晶法制备的。该方法制备得到
的总生物碱经紫外分光光度法测定含量在 90%以
上,总生物碱的成分也比较明确,主要含有5个化合
物:其中以脱氢卡维丁(dehydrocavidine)含量最高,达
40%,另外还有脱氢阿卟卡维丁(dehydroapocavidine)、
脱氢异阿卟卡维丁(dehydroisoapocavidine)、脱氢斯氏
紫堇碱(tetradehydroscoulerine)和黄连碱(coptisine)。
本研究显示,岩黄连总碱能够抑制舌癌细胞的
增殖,同时随作用时间和浓度的增加,端粒酶活性受
到抑制。由此可望通过抑制端粒酶活性表达,导致细
胞失去无限增殖能力,阻断舌癌的发生、发展。针对
端粒酶这一抗癌治疗的分子生物学靶点,岩黄连总
碱是良好的候选药物。
(致谢:感谢上海交通大学口腔医学院生物研究
室陈万涛教授,为本实验提供人舌鳞状细胞癌系
Tca8113细胞。)
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图4 TRAP-ELISA法检测Tca8113细胞端粒酶活性的表达
Figure 4 Expression of telomerase of Tca8113 cell lines treated
bydifferent concentration ofYHL-TAfor different time
李晋芳,等.岩黄连总碱抑制 Tca8113细胞及其端粒酶活性的实验研究
LI Jin-fang, et al. Inhibition of Yanhuanglian Total Alkalions on Cell
Proliferation and Telomerase Activity of Tca8113 Cell Lines35· ·