全 文 ：第 29卷　第 5期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol. 29　 No. 5
　 2009年 10月 Journal o f Central South Univ er sity o f Fo rest ry& Techno log y Oct. 2009　
文章编号: 1673- 923X ( 2009) 05- 0091- 04
细叶桉遗传多样性的 ISSR分析
张党权1 ,田　华 1 ,谢耀坚 2 ,谭晓风 1 ,黄青云 1 ,谷振军 1 ,曹家光 2 ,曾艳玲 1
( 1.中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 ,湖南 长沙 410004; 2.国家林业局桉树研究开发中心 ,广东湛江 524022)
摘　要:　利用 IS SR分子标记技术对细叶桉的遗传多样进行了分析 .从 100条随机引物中筛选出 10条特异的用于细叶桉
ISSR- PCR扩增引物 ,扩增出 101条清晰可重复的条带 ,其中 89条是多态条带 ,多态带百分率为 86. 1% .采用 PO PGENE软
件 ,计算了种间的 Nei氏遗传距离 ,并用 UPGM A法构建了聚类分析树形图 ,分析了它们的遗传多样性和亲缘关系 .
关键词:　生物技术 ;细叶桉 ; ISSR;遗传多样性 ;聚类分析
中图分类号:　 Q754　　　　　文献标志码: 　 A
Genetic Diversity of Eucalyptus tereticornis by ISSR
ZHANG Dang-quan
1 , T IAN Hua
1 , XIE Yao-jian
2 , TAN Xiao-feng
1 ,
HU ANG Qing-yun
1 , GU Zhen-jun
1 , CAO Jia-guang
2 , ZEN G Yan-ling
1
( 1. Th e Key Labo ratory of Non-w ood Fores t Products of State Forest ry Adminis t rat ion,
Cen tral Sou th Universi ty of Fores t ry and Tech nology, Ch ang sha 410004;
2. China Eucalyptus Research Cen t re, S FA, Zhanjiang 524022)
Abstract: The genetic diversi ty of E ucalyptus teret icorn is was analyzed by ISSR technolog y. According to th e improved
ISSR-PCR sys tem, 10 primers were s elected out of 100 random ones to yield speci fic band s wi th moderate band num bers ,
clear backg round and g ood reproducibi li ty. Totally, 101 speci fic and reproducible DN A bands w ere ob tained , of w hich 89
are polymorph ic bands ( 86. 1% of polymo rphism ) . Bio-sof tw are POPGEN E 1. 31 and N T SYS-pc w ere used to calculate the
Nei g enetic distance and produce th e U PGM A dend rog ram of genetic diversi ty and simi larit y.
Key words: bio-tech nology; Eucalyp tus teret icornis; IS SR; gen etic diversi ty; clus tering
桉树 Eucalyptus spp.是桃金娘科桉属的总称 ,原产于澳大利亚的高大乔木 .桉树以其生长快、适应性强、用
途广而被世界上 120多个国家和地区广泛引种栽培 ,近年来跃居为世界人工林的第二大类造林树种 ,是目前世
界上最重要的木纸浆原材料之一 [1 ] .桉树栽培在我国已有一百多年的历史 ,是我国南方热带、亚热带地区最为
重要的速生丰产林造林树种 ,在我国造纸的木浆生产中有着极其重要的地位 .基于它的特殊地位及作用 ,世界
上很多国家和地区为提高桉树产量和增强桉树的抗冻、抗旱、抗虫等抗性 ,做了大量的基础性研究工作 ,桉树生
物技术育种研究也广泛开展起来 . 20世纪 90年代以来 ,现代生物技术在桉树的遗传改良、抗性育种等方面的应
用 ,得到迅速发展 [2 ] .
细叶桉是较为耐寒的桉树种之一 ,适于酸性红壤 ,对土壤要求不严 ,在粗砂土、深厚的冲积土亦能生长 ,同
时 ,细叶桉能耐受一定的干旱与轻霜 ,是亚热带速生树种之一 ,可作山坡造林和林带用 ,亦可作行道树 ,在我国
南方的广东、广西、湖南、福建等省份有大量栽培 .除作为优良的造纸用材外 ,细叶桉的根和叶还可提取高品质
的芳香油 ,全身都是宝 ,开发价值巨大 [ 1] .然而 ,我国从澳大利亚等国家引进的细叶桉在历经多年的栽培推广
后 ,种源关系较为混乱 ,品种良莠不齐 ,对细叶桉的快速健康发展不利 .因而 ,有必要对我国的细叶桉进行分子
收稿日期: 2009-02-27
基金项目: 长沙市科技计划项目重点课题 ( K069083- 22) ,湖南省教育厅科学研究项目 ( 08C931) .
作者简介: 张党权 ( 1976- ) ,男 ,江西抚州人 .副教授 ,博士 ,硕士生导师 ,研究方向为植物分子生物学与基因工程 .
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 2009. 05. 026
水平上的遗传多样性分析 ,为建立细叶桉种质资源库打下基础 .
ISSR( Inter-Simple Sequence Repeat Po lymo rphic DN A,简单重复序列区间 )是一种近年来应用较为广泛
的分子遗传标记技术 ,它来源于植物基因组中丰富的简单序列重复 ( SSR) ,由 2～ 4个随机的核苷酸锚定在微
卫星序列的 3′或 5′端 ,由此组成的单引物进行重复序列间 DNA的 PCR扩增 [ 3] . ISSR现已广泛应用于林木遗传
学研究的各个方面 ,如品种的分子鉴定 [4, 5 ]、遗传关系的确定 [ 6] ,遗传多样性分析 [7 ]、以及遗传连锁图谱的构建
等 [8, 9 ] .本文中采用 ISSR标记 ,从分子水平上探讨我国细叶桉不同种源的亲缘关系和遗传多样性 ,为有效利用
DNA分子标记评价细叶桉种质资源提供理论依据 .
1　材料和方法
1. 1　材料
采取原中南林学院于 1988年从澳大利亚引种成功的 4个细叶桉种源的 14个单株的叶片 .将采集的叶片洗净
后 ,于- 70℃超低温冰箱保存 .所用主要试剂 dN TP、 Taq DN A聚合酶购自大连 TaKaRa公司 , GeneRuler 100
bp plus DN A Ladder和 1 kb DN A Ladder购自 Fermentas公司 ,引物参照哥伦比亚大学 ( UBC)设计的 100条随
机引物序列 [10 ] ,由上海博尚生物技术有限公司合成 ,其它生化试剂和常规试剂均为分子生物学纯或分析纯 .
1. 2　基因组总 DNA提取
采用改良 CTAB法 [11 ]提取桉树叶片的基因组总 DNA.
1. 3　 ISSR-PCR扩增
在 20μL的总反应体系中 ,模板 DNA浓度梯度为: 5、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70 ng /μL等 8个浓度 , Taq DN A
聚合酶使用量梯度为: 0. 25、 0. 50、 0. 75、 1. 00 U; Mg2+ 浓度分别为 2. 25、 2. 5、 2. 75、 3. 0、 3. 25 mmol /L; dN TPs
分别为 60、 80、 100、 120μmol /L;引物浓度设置了 0. 5、 0. 6、 0. 7、 0. 8、 0. 9μmo l /L 5个梯度 .
ISSR-PCR扩增程序为: 94℃ , 3 min; 94℃ , 30 s; 52℃ , 45 s; 72℃ , 1 min, 40个循环 ; 72℃ , 10 min.退火
温度设置 50、 52、 53、 54和 56℃共 5个梯度 .扩增结果于 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测 .
1. 4　数据分析
根据各分子标记在相同电泳迁移率 (相同分子量片段 )的有无统计得到所有位点的二元数据 ,有 DNA扩增
带记为 1,无带记为 0.并将“ 0”、“ 1”数据输入 Excel表格中用于下一步分析 .应用 PO PGEN E 1. 31软件 ( Yeh et
al. , 1997) Nei s遗传距离和遗传一致度 ,绘制遗传关系进化树 .最后统计数据 ,应用软件 PO PGEN E 1. 31对
所得数据进行总结分析 ,从而建立遗传关系图 .
表 1　不同 I SSR随机引物的序列及扩增结果
Table 1　 Sequence and amplif ication eff iciency of dif ferent
ISSR random primers
引物编号 序列 总条带数 多态带数 多态带百分率 /%
811 ( GA) 8C 12 10 83. 3
814 ( C T) 8A 9 7 77. 8
826 ( AC) 8C 10 9 90
827 ( AC) 8G 17 17 100
828 ( TG) 8A 7 7 100
829 ( TG) 8G 10 8 80
850 GAGTG TAGATGT GTGTYC 11 11 100
881 ( GGGT) 3G 8 5 62. 5
895 AGAGT TGGTAGCTCT TGATC 10 10 100
900 ACTT CCCCACAGGT TAACACA 6 5 83. 3
2　结果与分析
2. 1　多态性分析
利用优化的桉树 ISSR-PCR扩增体
系 [12 ] ,对 100条合成的 ISSR随机引物进
行扩增 ,结果筛选出 U BC811、 U BC814、
UBC826、 UBC827、 U BC828、 U BC829、
UBC850、 UBC881、 UBC895、 UBC900
共 10条适合 14个细叶桉样品 ISSR-PCR
扩增反应的 ,且扩增条带清晰、背景清
晰、反应稳定的引物 (见表 1) .
10条引物对 14个细叶桉总共扩增出 101条清晰可重复的条带 ,其中 89条是多态条带 .每个引物可扩增的
多态条带数目为 5～ 17条 ,平均 8. 9条 ,总多态带百分率为 86. 1% ,其中引物 UBC827, U BC828, UBC850,
UBC895扩增的多态带百分率为 100% ,最低的 UBC881也有 62. 5% .扩增片段长度范围为 240～ 3 000 bp,完全
符合分子标记对扩增条带的要求 .可见 , ISSR检测细叶桉遗传多样性的效率很高 ,也表明细叶桉的遗传多样性
92 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 29卷
极为丰富 .
图 1　引物 UBC827对 14个细叶桉的 ISSR图谱
Fig. 1　 Electrophoresis diagram of ISSR analysis on fourteen species
of Eucalyptus terett icornis by random primer UBC827
2. 2　聚类分析
遗传距离 (g enetic distance)和遗传一
致度 ( genetic identity )是来衡量两个种群
之间的遗传分化程度的重要指标 .采用 Nei
的遗 传距离 和遗传一 致度 , 并通过
POPGENE分析软件对细叶桉的 14个品
种间进行分析 ,其结果见表 2.从表 2中看
出 , 14个品种间的遗传一致度的变化范围
在 0. 505 6～ 0. 876 4之间 ,遗传距离的变
化范围在 0. 131 9～ 0. 682 0之间 . 6和 9具
有最高的遗传一致度 ,它们之间的遗传距
离也最小 ( 0. 131 9) ; 10和 5、 12的遗传距
离最大 ,为 0. 682 0,相应的最低遗传一致
度为 0. 505 6(见表 2) .
表 2　细叶桉 14个品种间的遗传一致度 (对角线上方 )和遗传距离 (对角线下方 )
Table 2　 Nei s Original Measures of Genetic Identity ( above diagonal ) and Genetic distance ( below
diagonal) among the 14 species of Eucalyptus teretticornis
pop ID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 * * * * 0. 7191 0. 6404 0. 6742 0. 6854 0. 6742 0. 6292 0. 6180 0. 6854 0. 5955 0. 6854 0. 6854 0. 6742 0. 6854
2 0. 3298 * * * * 0. 6966 0. 6404 0. 7640 0. 6404 0. 6629 0. 7191 0. 6966 0. 5843 0. 6517 0. 6292 0. 6854 0. 6067
3 0. 4456 0. 3615 * * * * 0. 7191 0. 5730 0. 5843 0. 6517 0. 7303 0. 6404 0. 5955 0. 5506 0. 5281 0. 6742 0. 5506
4 0. 3943 0. 4456 0. 3298 * * * * 0. 6517 0. 6404 0. 6629 0. 7191 0. 6517 0. 5618 0. 5843 0. 5618 0. 6629 0. 6517
5 0. 3778 0. 2691 0. 5568 0. 4282 * * * * 0. 6517 0. 7640 0. 7079 0. 7079 0. 5056 0. 6629 0. 6180 0. 6067 0. 7079
6 0. 3943 0. 4456 0. 5374 0. 4456 0. 4282 * * * * 0. 5955 0. 6966 0. 8764 0. 5618 0. 5843 0. 6067 0. 6180 0. 5843
7 0. 4633 0. 4111 0. 4282 0. 4111 0. 2691 0. 5183 * * * * 0. 7865 0. 6742 0. 5393 0. 5843 0. 5169 0. 5955 0. 6067
8 0. 4813 0. 3298 0. 3142 0. 3298 0. 3455 0. 3615 0. 2401 * * * * 0. 7528 0. 5506 0. 6180 0. 6180 0. 6517 0. 6404
9 0. 3778 0. 3615 0. 4456 0. 4282 0. 3455 0. 1319 0. 3943 0. 2839 * * * * 0. 5730 0. 5955 0. 5955 0. 6517 0. 6404
10 0. 5183 0. 5374 0. 5183 0. 5766 0. 6820 0. 5766 0. 6174 0. 5968 0. 5568 * * * * 0. 5281 0. 5056 0. 6517 0. 5281
11 0. 3778 0. 4282 0. 5968 0. 5374 0. 4111 0. 5374 0. 5374 0. 4813 0. 5183 0. 6385 * * * * 0. 6854 0. 6067 0. 6854
12 0. 3778 0. 4633 0. 6385 0. 5766 0. 4813 0. 4997 0. 6600 0. 4813 0. 5183 0. 6820 0. 3778 * * * * 0. 6742 0. 6629
13 0. 3943 0. 3778 0. 3943 0. 4111 0. 4997 0. 4813 0. 5183 0. 4282 0. 4282 0. 4282 0. 4997 0. 3943 * * * * 0. 6517
14 0. 3778 0. 4997 0. 5968 0. 4282 0. 3455 0. 5374 0. 4997 0. 4456 0. 4456 0. 6385 0. 3778 0. 4111 0. 4282 * * * *
图 2　细叶桉 14个品种的遗传距离 U PGM A树状图
Fig. 2　 Dendrogram of Nei s genetic distances among 14 samples
of Eucalyptus teretticornis
利用 N TSYS-pc软件对 Nei的遗传距离使
用 U PGM A聚类分析 ,结果见图 2.图 2表明 ,本
研究中的 14个细叶桉品种之间的亲缘关系中 ,
11、 12、 13、 14号细叶桉样品亲缘关系较近 ; 2、
5、 7、 8号之间的亲缘关系较近 ,聚为一类 ; 1、 4、
6、 9之间的亲缘关系比较近 ,聚为一类 ;另外 ,
亲缘关系较近的 2、 5、 7、 8和 1、 4、 6、 9又与 3号
聚为一类 ,但是遗传距离较大 ;其中 10号样品
单独为一类 .
3　讨　论
与 RFLP、 RAPD、 STS、 SSR等分子标记相
比 , ISSR具有重复性高、多态性位点丰富等优
点 ;与 AFLP等分子标记相比 , ISSR具有技术
93第 5期 张党权等:细叶桉遗传多样性的 ISSR分析
难度降低、可操作性强、使用经费减少等优势 ,因而是一种已完全成熟、可广泛推广的分子标记技术 .特别是近
年来在植物分子分类研究中 ,得到了广泛的应用 ,已成为植物遗传多样性的分子研究中的首选分子标记技术 .
桉树在澳大利亚及其附近岛屿广泛分布及被引种到世界 120多个国家和地区 ,根据这一事实我们可以推想:桉
树的遗传结构和遗传多样性是何等的丰富 .因而对其遗传结构和遗传多样性的研究既广泛又深入 .因此 ,本研
究中采用 ISSR分子标记技术对湖南省株洲市的 14个细叶桉样品进行分子水平上的遗传多样性分析 ,根据
N TSYS-pc软件对 Nei的遗传距离使用 U PGM A聚类分析图可以看出: 细叶桉 10号样品与其它 13个样品最小
遗传一致度达 0. 505 6,相对的最大遗传距离 0. 682 0,这说明 10号样品与其它样品间的亲缘关系较远 ,而其他
的 13个样品都有远近不同的亲缘关系 .
利用 RFLP、 RAPD、 AFLP、 SSR等分子标记技术进行桉树品种鉴定、分析种质间的遗传多样性、品种间的
亲缘关系等方面在国内尚处于研究起始阶段 [13～ 15 ] ,本研究应用 ISSR分子标记技术进行的细叶桉亲缘关系与
遗传多样性实验 ,为后续的将桉树 ISSR标记转换成 SCAR标记的研究打下基础 ,将对桉树的分子遗传学研究
乃至分子生物学研究起着积极的推动作用 .
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[本文编校:谢荣秀 ]
94 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 29卷