全 文 ：第 18卷　第 4期
2000年 12月 　　　　　
广西师范大学学报 (自然科学版 )
JOURNAL OF GU ANGXI NO RM AL UN IV ERSITY
　　　　　 Vo l. 18　　 No. 4
Decembe r　 2000
收稿日期: 2000-07-12
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 ( 39760007)
作者简介: 杨继华 ( 1935— ) ,男 ,广西桂林市人 ,广西师范大学教授
沙田柚花柱 S-糖蛋白的分离及鉴定
杨继华 1　李红艳 2　薛妙男 1
( 1. 广西师范大学生物学系 ,广西桂林 541004; 2.桂林医学院生化教研室 ,广西桂林 541001)
摘　要: 采用层析和电泳相结合的技术 ,分离和鉴定沙田柚花柱中与自交不亲和相关的蛋白质 .结果表明:自
交沙田柚花柱蛋白质提取液的 35% ( NH4 ) 2 SO4盐析级分 ,经 Sephadex G-50层析 ,可得 2个峰 ,其中峰Ⅰ 具有
抑制自交花粉管生长的活性 .峰Ⅰ 含 2种蛋白质 ,且均为糖蛋白 ,蛋白质 A相对分子质量为 32. 10 ku,等电点
为 p H7. 2;蛋白质 B相对分子质量为 25. 12 ku,等电点为 p H6. 4.峰Ⅰ 还具有核酸酶活性 ( 63. 7 U /mg ) .我们
认为峰Ⅰ 的 2种蛋白质可能就是与沙田柚自交不亲和相关的糖蛋白 ( S-糖蛋白 ) .
关键词: 沙田柚 ;花柱 ; S-糖蛋白
分类号: Q946. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001 -6600( 2000) 04 -0066 -05
近 20年来 ,国外在配子体型自交不亲和性机理研究方面取得了很大的进展 ,目前已从花烟草、矮牵
牛、马铃薯、秘鲁番茄等多种植物中分离出 20多种 S基因 [1～ 4 ] ,大量实验证据表明 ,控制自交不亲和的 S
基因在花柱中的表达产物是一种核酸酶 ( S-RNase) [5 ] ,此外 ,对 S基因的克隆分离 , S-RNase的活性 ,糖
蛋白 N-端氨基酸序列分析 ,糖链的组成及性质等方面也有报导 [ 6, 7] .本实验采用的材料——沙田柚 ,属
配子体型自交不亲和品系 , 1990年以来 ,薛妙男、杨继华等对沙田柚自交不亲和性的细胞学和分子基础
进行了一系列的研究 ,确定了沙田柚自交不亲和类型和花粉管在花柱中生长受阻的部位 [8, 9 ] ,并用双向
电泳分离、鉴定了沙田柚花柱 S-糖蛋白等 [10 ] ,在此基础上 ,我们进一步采用葡聚糖凝胶柱层析和电泳相
结合的技术 ,分离、纯化和鉴定沙田柚自交不亲和花柱中相关的 S-糖蛋白 ,并对其生物学活性 ,生化性
质及核酸酶活性进行研究 ,以加深对沙田柚自交不亲和机理的认识 .
1　材料和方法
1. 1　材料
采自桂林市广西柑桔研究所 10～ 12年生酸砧沙田柚结果树 ,取自交授粉后 3 d的花柱为材料 .
1. 2　方法
1. 2. 1　蛋白质的分离
1. 2. 1. 1　粗提 .参照 Broo thaerts等 [6, 7 ]和 Jahnen等 [ 11]的方法 ,略有改动 .取自交授粉后 3 d的花柱 (距
柱头端约 1 /2部位 ) ,按质量体积比 1∶ 8加入蛋白质粗提缓冲液 ( 0. 1 mol /L Tris-HCl( pH7. 8) ,其中含
10 mmol /L NaCl , 1 mmol /L CaCl2 , 1 mmo l /L DTT, 1 mmol /L PM SF, 10 mmol /L EDT A-2Na) ,冰浴
中充分研磨 ,静置浸提 30 min,冷冻离心 ( 12 000 r /min, 15 min) ,取上清液备用 .
1. 2. 1. 2　盐析 .蛋白质粗提液加入固体 ( N H4 ) 2 SO4至 35%饱和度 ( 0. 194 g /mL) , - 4°C静置过夜 ,次
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2000. 04. 015
日离心 ( - 4°C, 12 000 r /min, 10 min) ,沉淀溶于少量磷酸缓冲液 ( p H7. 8) ,而后双蒸水透析 2 d,中间
换水 3～ 4次 .
1. 2. 1. 3　 PAGE电泳检测 .平板电泳装置 ,不连续系统 .凝胶大小为 13 cm× 11 cm× 0. 1 cm,分离胶浓
度 10% ,交联度 2. 6% , pH= 8. 9,浓缩胶浓度 3% , pH= 6. 7.电极缓冲液为 Tris-Gly缓冲液 , pH= 8. 3,
稳流 20 mA.
1. 2. 1. 4　全蛋白染色 (考马斯亮兰 R250) .
1. 2. 1. 5　糖蛋白染色 (阿尔新兰法 ) .
1. 2. 1. 6　蛋白质含量测定按 Bradfo rd法 [ 12] .
1. 2. 1. 7　葡聚糖凝胶柱层析 [ 13] .选用 Sephadex G-50 ( Pha rmacia产品 ) ,用前先在沸水浴中溶胀 2 h,
冷至室温后装柱 .柱长 21 cm ,直径 1 cm.装柱后用洗脱缓冲液平衡 1～ 2 h.层析样液为花柱蛋白提取液
35% ( N H4 ) 2 SO4级分的透析液 ,加样量为 2 m L( 0. 35 g /L ,约 0. 7 mg ) .梯度洗脱 ,洗脱液为磷酸缓冲液
0. 02 mol /L pH7. 8,其中 cNaCl= 0～ 0. 2 mol /L,洗脱流速为 1 mL /min.洗脱液经 WZ-97-1型核酸蛋白
检测仪 ,并由记录仪记录层析结果 .
1. 2. 2　自交不亲和生物活性的检测
采用花粉离体萌发方式进行 .萌发介质为 BKS-15培养液 ( 15%蔗糖、 0. 01%硝酸钾、 0. 02%硫酸
镁 , 0. 01%硼酸、 0. 003%硝酸钙 , 25 mg /L氯霉素 , 0. 1%明胶 , pH5. 6)将经 Sephadex G-50收集的 2个
峰 ,用 PEG-400浓缩 5～ 6倍体积 ,即为 1号和 2号浓缩液 ,萌发时 ,用微量进样器分别吸取 100μL1
号 , 2号液与 100μL BKS-15培养液混合后 ,均匀涂布于载玻片上 ,将沙田柚花粉分散其中 , 32°C恒温 ,
一定湿度下 ,萌发 7 h,取出镜检 .
1. 2. 3　有效抑制物 ( 1号液 )生化性质测定
1. 2. 3. 1　 PAGE电泳检测 .同上法 .
1. 2. 3. 2　蛋白质相对分子质量测定 .用 SDS-PAGE法测定相对分子质量 .标准蛋白质相对分子质量范
围 14. 4 ku～ 97. 4 ku,由 6种蛋白质组成: 兔磷酸化酶 B( 97. 4 ku) ,牛血清蛋白 ( 66. 2 ku) ,兔肌动蛋白
( 43 ku) ,牛碳酸酐酶 ( 31 ku) ,胰蛋白酶抑制剂 ( 20. 1 ku) ,鸡蛋清溶菌酶 ( 14. 4 ku) .
1. 2. 3. 3　等电聚集电泳测定蛋白质的等电点 .凝胶长 8 cm ,直径 0. 1 cm.凝胶浓度 4% ,两性电解质
pH范围 3. 5～ 10.负极缓冲液 0. 02 mo l /L NaOH,正极缓冲液 0. 01 mo l /L H3 PO4 .先进行预电泳
200 V 15 min, 300 V 15 min, 400 V 30 min.更换负极缓冲液后 ,加样 (每管 40μL) ,进行正式电泳 ,
450 V 8 h, 800 V 1 h.电泳结束后 ,取出胶条 ,用考马斯亮兰 R250染色 .
1. 2. 3. 4　核酸酶活性的检测 .按 Brown and Ho方法 [ 14] .酶单位定义: 一个核酸酶单位相当于在 37°C
pH7. 5波长为 260 nm条件下 ,使吸光度增大 1. 0所需的酶量 .
2　结果
2. 1　自交花柱蛋白质的分离
花柱蛋白质粗提液 ,经盐析 ,透析后 , Bradford法检测 ,蛋白质含量为 0. 35 g /L.样液做单向
PAGE,结果表明 , 35%级分中共有 9条蛋白质带 ,近正极端的 A, B 2带 ,全蛋白染色较深 .糖蛋白特异
性染色 , A, B 2带染色呈阳性 ,证明它们是糖蛋白 (图 1) .样液经 Sephadex G-50柱层析 ,分出Ⅰ和Ⅱ 2
个峰 (图 2) .
2. 2　自交不亲和生物活性检测
1号 , 2号浓缩液 100μL分别加入 BKS-15培养液中 ,进行花粉离体萌发试验 ,结果表明 ,它们均不
抑制花粉管的萌发 ,而 1号液明显具有抑制自交花粉管伸长生长的活性 .镜检结果表明 ,花粉管长度 , 1
号液为 30～ 50μm; 2号液及对照为 90～ 250μm(图 3 A, B, C)
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图 1　自交花柱蛋白质 35%盐析级分的 PAGE图谱　　　　　　　　　图 2　自交花柱蛋白质 35%级分过
　　　　　　 A.考马斯亮兰 R250染色　　 B.阿尔新兰染色 Sephadex G-50柱层析图谱
2. 3　 1号液部分生化性质的测定结果
1号液经单向 PAGE检测 ,仅含 2条蛋白质带 ,且这 2条蛋白质带与 35%级分中的 A, B蛋白质带
迁移率相同 ,从而证明 1号液中 2条蛋白质带即是 35%级分中的 A, B糖蛋白质带 (图 4 A) .单向 SDS-
PAGE结果表明 , 1号液也只有 2条带 ,说明蛋白质 A, B均为单亚基蛋白 ,相对分子质量分别为:
32. 10 ku, 25. 12 ku(图 4 B) .等电聚焦结果 , 1号液仅有的 2条蛋白质带位于近碱性端 , A蛋白质的 pI
= 7. 2, B蛋白质的 pI= 6. 4(图 4 C) . 1号液稀释 80倍测定核酸酶活性 ,对照组及试验组在紫外光
260 nm处测吸光值 ,分别为 0. 26, 0. 285.酶活性最终计算结果: 63. 7 U /mg.
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A　　　　　　　　　　　　　　　　 B　　　　　　　　　　　　　　　　 C
图 4　沙田柚自交花柱蛋白质的电泳图谱
A　 35%盐析级分及过 Sephadex G-50第Ⅰ 峰 PAGE图比较 ( 1. 35%盐析级分 ; 2. 第Ⅰ 峰 )
B　 Sephadex G-50层析第Ⅰ 峰 SDS-PAGE图 ( 1. 第Ⅰ 峰 ; 2. 标准蛋白质 )
C　第Ⅰ 峰的 IEF图
3　讨论
目前已在包括茄科在内的几种植物中发现了含量丰富并与 S基因座在遗传上连锁的花柱蛋
白 [6, 11, 15 ] ,这些蛋白质多为碱性的胞外糖蛋白 ,其相对分子质量约为 24～ 32 ku.我们用葡聚糖凝胶柱层
析分离到的峰Ⅰ的 2种单亚基糖蛋白 ,经 SDS-PAGE和 IEF检测 ,蛋白质 A M rA= 32. 10 ku, pI= 7. 2;
蛋白质 B M rB= 25. 12 ku, pI= 6. 4,与上述报道的结果相近 . 1988年 Horiuchi等 [16 ] , Kaw ata等 [17 ]由
DNA序列推测从花烟草、矮牵牛、秘鲁番茄等多种茄科植物分离的 S基因蛋白质产物 ,与真菌类的核酸
酶 Rh与 T2有很大的同源性 ,它们都含有同样的活性部位 .而后 , 1989年 McClure等 [5 ]证明 , S基因编
码的蛋白质也具有核酸酶活性 ,因此将这些蛋白质称为 S-核酸酶 ( S-RNase) . 1991年 Broothaerts[7 ]报
道 ,矮牵牛中 4种 S蛋白的核酸酶活性变化幅度为 30～ 1 000 U /mg.本实验测定 ,从葡聚糖柱层析分离
的峰Ⅰ 所收集到的 1号液的浓缩液也具有核酸酶活性 ,酶活性为 63. 7 U /mg ,基本上在变化幅度范围
内 .具有上述生物化学特性的 2种单亚基 S糖蛋白 ,加入花粉离体培养基中 ,可明显地观察到 ,离体培养
条件下 ,它们能抑制同源花粉管的伸长生长 ,但却不影响花粉粒的萌发 .薛妙男等 1995年 [8 ]实验证明 ,
沙田柚自交花粉萌发后 ,花粉管在花柱道内缘通道细胞生长 ,当花粉管伸长到花柱 1 /2部位左右处 ,生
长速度明显减慢 ,花粉管壁胼胝质沉积多而且端化 ,生长至花柱 1 /2处 ,生长停滞 .我们的检测表明 ,自
交授粉后 3 d的花柱 1 /2部位处分离的蛋白质 ,具有明显地抑制花粉管伸长生长的效应 ,正是由于花柱
S糖蛋白在花柱 1 /2处积累达到一定的阈值后 ,对花粉管的伸长起到阻抑的作用 .我们认为峰Ⅰ 的 2种
蛋白质可能就是与沙田柚自交不亲和相关的 S-糖蛋白 .我们将进一步对分离到的 2个单亚基糖蛋白进
行 N-末端氨基酸序列分析和糖基测定 ,以对其有更为完整的认识 .
参　考　文　献
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THE PU RIFICATION AND IDEN TIFICAT ION O F S-GLYCOPRO TEIN
IN THE STYLE O F CI TRUS GRAN DIS V AR. S HA T IN YU HORT.
YANG Ji-hua
1　 LI Hong-yan2　 XUE Miao-nan1
( 1. Depar tment of Bio log y , Guangxi Normal Univ er sity , Guilin 541004 China;
2. Depar tment of Biochemistry , Guilin Medical Colleg e, Guilin 541001 China )
Abstract: By gel chromatog raphy and electrophoresis, the stylar proteins rela ted to self-incompa tibili ty
o f sha tinyu (Citrus grandis var. shat inyu Hort. ) are isolated and identified. The results showed that
35% ( N H4 ) 2 SO4 sal t f raction of ex t racts in the self-pollinated style of sha tinyu had two peaks by
Sephadex G-50 chromatog raphy. The peak I had the activ ity o f inhibiting the g row th o f self-pollinated
pollen-tube and its tw o pro teins are g lycoprotein. The mo lecular w eigh t o f protein A and pro tein B are
32. 10 ku and 25. 12 ku, and their iso-elet ric point is pH7. 2 and pH6. 4. The peak I show ed the activi ty
o f nuclease. The autho rs thought that th e tw o pro teins could be g lycoproteins rela ted to self-
incompa tibili ty of sha tinyu.
Key words: shatinyu; style; S-glycopro tein (责任编辑　马殷华 )
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