全 文 ：安徽科技学院学报，2013，27(5) :45 ～ 49
Journal of Anhui Science and Technology University
虎杖叶浸提物对亚硝酸盐清除和亚硝胺生成阻断的最佳浸提工艺
余锡荣1，焦 娜1，李宏亚1，张玉洁1，李慧芳1，高 音1，张孝林1，2*
(1．安徽科技学院 食品药品学院，安徽 凤阳 233100;
2．农业部生物有机肥创制重点实验室，安徽 蚌埠 233030)
收稿日期:2013 － 06 － 20
基金项目:国家自然科学基金(81071306) ;安徽省自然科学基金一般项目(1308085MC43) ;安徽省教育厅重点项目(KJ2013A078) ;安
徽科技学院自然科学基金(ZRC2011318) ;安徽科技学院第十批大学生创新课题(13XSZ122)。
作者简介:余锡荣(1990 －) ，男，安徽省宿松县人，本科生，主要从事药物制剂研究。* 通讯作者:张孝林，讲师，E － mail:zhangxiaolin8@
126． com。
摘 要:目的:研究虎杖叶浸提物清除亚硝酸钠及阻断亚硝胺生成的最佳浸提条件，为虎杖叶开发为防癌
保健茶提供理论依据。方法:在模拟人体胃液( pH 为 3． 0，温度为 37 ℃ ) 条件下，采用盐酸萘乙二胺和 α
－奈胺法，探究虎杖叶浸提液对亚硝酸盐的清除及亚硝胺合成阻断的能力。结果:虎杖叶在 100℃、浸泡
15 min、料液比 1∶ 50 条件下的浸提液对亚硝酸钠的清除效果最好，最大清除率可达 86． 12%。虎杖叶在
100℃、浸泡 5 min、料液比 1∶ 50 条件下的浸提液对亚硝胺合成阻断最好，最大阻断率可达 90． 02%。结
论:虎杖叶浸提物具有较强清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的能力且受浸提工艺的影响。
关键词:虎杖叶;浸提物;亚硝酸盐;亚硝胺;清除率;阻断率
中图分类号:R931． 71 文献标识码:A 文章编号:1673 － 8772(2013)05 － 0045 － 05
The Optimum Extraction Process of Scavenging the Sodium Nitrite and
Disconnecting the Nitrosa Mine on Extract from Leaves of Polygonum cuspidatum
YU Xi － rong1，JIAO Na1，LI Hong － ya1，ZHANG Yu － jie1，LI Hui － fang1，GAO Yin1，ZHANG Xiao － lin1，2*
(1． College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China;
2． The Ministry of Agriculture Key Laboratory of Microbial Organic Fertilizer，Bengbu 233030，China)
Abstract:Objective:To study the best condition of extracts from Polygonum cuspidatum leaves for scavenging the
sodium nitrite and disconnecting the nitrosamine，and provide the theoretical basis for developing health tea of
protective effect on cancer risk with Polygonum cuspidatum leaves． Methods:Under a simulated human gastric
juice condition (pH =3． 0 and temperature at 37 ℃) ，the abilities of scavenging the sodium nitrite and discon-
necting the nitrosamine were studied by the extracts from Polygonum cuspidatum leaves using the methods of N －
ethylenediamine dihydrochloride and α － naphthylamine． Results:The best effects of scavenging the sodium ni-
trite and disconnecting the nitrosamine synthesis of the extracts from Polygonum cuspidatum leaves were that the
clearance rate and blocking rate reached 86． 12% and 90． 02% under the water extraction condition with the time
at 15 min，the temperature at 100℃，the ratio of material to liquid at 1∶ 50 and the time at 5min，the tempera-
ture at 100℃，the ratio of material to liquid at 1∶ 50，respectively． Conclusion:The extracts from polygonum cus-
pidatum leaves possess stronger abilities of scavenging the sodium nitrite and disconnecting the nitrosamine syn-
thesis and they are affected by extraction process．
Key words:Polygonum cuspidatum leaves;Extract;Nitrite;Nitrosamine;Clearance rate;Blocking rate
癌症已成为我国居民的重要死因，严重危害人民身心健康和社会和谐发展。在致癌物中，亚硝胺是
最令人关注的一类化学致癌物，其致癌性强，小剂量长期和大剂量一次给药即可致癌［1 － 3］。大量的实验证
明我们平时所食的某些食品中存在一定量的亚硝胺类物质及它的前体化合物，其中有的是食品中天然形
成，有的是生产过程需要添加的前体化合物亚硝酸钠等后反应生成的。亚硝胺易由前体仲胺和亚硝酸盐
在合适条件下合成，而且合成条件要求并不高，不但在实验室和自然条件下，而且在人体和动物体内均
能反应合成，尤其在人和动物胃环境条件更适于合成亚硝胺。因此，阻断亚硝胺合成或消除亚硝胺的前
体亚硝酸盐是防治癌症产生的有效途径之一［3］。研究已证实，很多果蔬和花茶都有一定的清除亚硝酸盐
和阻断亚硝胺合成的作用［4 － 6］。虎杖叶含有多种活性成分，虎杖叶对清除亚硝酸盐及亚硝胺合成阻断作
用国内外还鲜见报道。本研究采用模拟人体胃酸性环境条件，利用正交试验法探讨虎杖叶浸提物对亚硝
酸盐清除及亚硝胺合成阻断作用的最佳浸提条件，为把虎杖叶开发为防癌保健茶提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb． et Zucc．)叶(经安徽科技学院药学系时维静教授鉴定为真品，2013
年 4 月 25 日采自安徽科技学院植物研究基地)、亚硝酸钠、无水对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、α －萘胺、
二甲胺、磷酸氢二钠、柠檬酸、无水碳酸钠(均为 AR级) ，试验用水为蒸馏水。
1． 2 仪器
HH －8 数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、FA21048 电子天平(上海市精密科
学仪器总厂)、UV －5500 紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、超净工作台(苏州安泰技术有限
公司)。
1． 3 方法
1． 3． 1 样品的制备及考察的因素确定 采集的虎杖叶在 50℃烘箱中烘干，粉碎后备用。对虎杖叶活性
成分提取影响较大的因素是浸提温度、浸提时间和料液比。本研究以虎杖叶浸提物对亚硝酸盐的清除率
和亚硝胺生成的阻断率为指标，以上述三因素为考察对象，设计正交试验，确立虎杖叶浸提物对亚硝酸盐
的清除和亚硝胺生成的阻断作用的最佳浸提条件。
1． 3． 2 虎杖叶浸提液对亚硝酸盐清除率的测定———盐酸萘乙二胺法［7 － 8］ 亚硝酸钠在酸性条件下与对
氨基苯磺酸发生重氮化反应，重氮化反应物再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色的化合物，该化合物在 545nm
处存在最大吸光度值，通过测定吸光度值的大小确定亚硝酸钠含量的多少来反映虎杖叶浸提物对亚硝酸
盐的清除能力。亚硝酸钠含量减少，吸光度值变小，证明浸提液对亚硝酸盐的清除能力就强，反之则弱。
按照下列方法:取 6 支 10mL 的具塞试管并编号，分别加入准确吸取的 5μg /mL NaNO2 标准液 1．
0mL，分别吸取 pH3． 0 的柠檬酸 －磷酸氢二钠缓冲溶液 1． 0 mL，虎杖叶浸提液 1． 0mL(对照组试管加入 1．
0mL蒸馏水)充分混匀后，在 37℃恒温水浴 30min。再依次加入 0． 4%对氨基苯磺酸 1． 0mL，摇匀静置
5min后，加入 0． 2%盐酸萘乙二胺 0． 5mL，再加入蒸馏水至 10． 0mL，摇匀静置 15min，用紫外分光光度计在
已确定最大吸收波长 545nm处测得吸光度:对照组为 Ao，样品虎杖叶浸提液组为 A(平行 3 次求平均值)。
虎杖叶浸提液对亚硝酸盐的清除率按下列公式计算:
清除率(%)=(Ao － A)/ Ao × 100%
1． 3． 3 虎杖叶浸提物对亚硝胺生成阻断率的测定—α －奈胺法［7 － 8］ 人体代谢或胃肠道细菌代谢过程
会产生胺类物质，胺类物质可与亚硝盐特别在胃酸性条件下更易反应生成亚硝胺。本研究模拟人体胃液
的条件下(pH3． 0，温度 37℃) ，利用二甲胺与亚硝酸钠反应生成二甲基亚硝胺: (CH3)2NH + NaNO2 +
HCl→(CH3)2N － N = O + NaCl + H2O 在紫外灯的照射下，二甲基亚硝胺分解成二甲基仲胺和亚硝酸根:
H2O + (CH3)2N － N = O→ (CH3)2NH2
+ + NO2
－亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与 α －萘胺偶合
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生成红色化合物，该物质在 525nm处有最大吸光度。当二甲胺与亚硝酸钠同时存在情况下，向其中加入
虎杖叶浸提液，虎杖浸提液竞争地优先同亚硝酸钠作用，阻断二甲胺与亚硝酸钠反应，达到减少或抑制亚
硝胺生成的目的。据此可以通过比较相同条件下测得吸光度的大小与亚硝酸根的量成正比的关系，进而
推知生成亚硝胺量的多少来反映虎杖叶浸提液对亚硝胺生成的阻断能力的强弱。
按照下列方法:取 6 支 20． 0mL的具塞试管并编号，分别加入 pH3． 0 的柠檬酸 －磷酸氢二钠缓冲溶液
10． 0 mL，加入准确吸取的 1mmol /L NaNO2标准液 1． 0mL，1mmol /L 二甲胺 1． 0mL，虎杖叶浸提液 2． 0mL
(对照组试管加入 2． 0mL蒸馏水) ，用蒸馏水补充到 20． 0mL 充分混匀后，在 37℃恒温水浴 1h。用移液枪
吸取 1． 0mL 上述溶液加到 50mL烧杯中，加入质量分数 0． 5% Na2CO3 溶液 0． 5mL 终止上述反应，在紫外
灯下照射 15 min。取出后加入质量分数 1%对氨基苯磺酸 1． 5mL，摇匀后静置 3 min，再加入质量分数 0．
1% α －萘胺 1． 5mL，蒸馏水 0． 5 mL，摇匀后静置 15 min。用分光光度计在已确定的最大吸收波长 525nm
处测得其吸光度:对照组为 Ao，样品虎杖叶浸提液组为 A(平行 3 次求平均值)。
虎杖叶浸提液对亚硝胺生成的阻断率按下列公式计算:
阻断率(%)=(Ao － A)/ Ao × 100%
1． 3． 4 设计正交试验确定影响虎杖叶浸提物对亚硝酸盐清除和亚硝胺生成阻断作用的最佳浸提工艺考
察 根据现有袋泡茶大多数 3g，冲泡水温在 80 ～ 100℃，冲泡容器体积为 200 ～ 500mL，浸泡时间 5 ～
15min，设计下列正交试验各因素水平如表 1 所示和正交试验如表 2 和表 3。
表 1 正交试验各因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 浸提温度(℃) 料液比(g /mL) 浸提时间(min)
1 80 1(1∶ 100) 5
2 90 2(1∶ 50) 10
3 100 3(1∶ 25) 15
2 结果与分析
2． 1 虎杖浸提液对亚硝酸盐清除作用正交试验结果
按照 1． 3． 1 和 1． 3． 2 试验方法和正交试验 3 因素和 3 水平，测得虎杖叶浸提物对亚硝酸盐的清除作
用结果如表 2 所示。根据表 2 比较本试验三个因素的极差 R 可知:虎杖叶浸提物对亚硝酸盐清除作用在
3 因素中，A因素浸提温度影响最大，其次 B因素浸提物料液比影响较大，C 因素浸提时间在浸泡 5min 钟
后在 3 因素中影响较小。虎杖叶浸提物对亚硝酸盐清除作用的的最佳条件组合是 A3B2C3 ，即 100℃，浸
提 15min及料液比为 1∶ 50 浸提条件下虎杖叶浸提物对亚硝酸盐的清除效果最好。用 A3B2C3 最佳浸提
条件做验证试验测得虎杖叶浸提物对亚硝酸盐的清除率可达 86． 12%，证明本试验所得的虎杖叶最佳浸
提条件是正确的。
表 2 清除率正交试验结果
Table 2 The results of orthogonal test on clearance rate
试验号
因素
A B C
温度 料液比 时间
清除率(%)
1 1(80℃) 1(1∶ 100) 1(5min) 76． 44
2 1 2(1∶ 50) 2(10min) 79． 01
3 1 3(1∶ 25) 3(15min) 79． 16
4 2(90℃) 1 2 80． 56
5 2 2 3 85． 67
74第 27 卷第 5 期 余锡荣，等 虎杖叶浸提物对亚硝酸盐清除和亚硝胺生成阻断的最佳浸提工艺
试验号
因素
A B C
温度 料液比 时间
清除率(%)
6 2 3 1 80． 51
7 3(100℃) 1 3 81． 72
8 3 2 1 82． 89
9 3 3 2 85． 28
K1 234． 61 238． 72 239． 84
K2 246． 74 247． 57 244． 85
K3 249． 89 244． 95 246． 55
k1 78． 20 79． 57 80． 94
k2 82． 25 82． 52 82． 79
k3 82． 29 81． 65 81． 01
R 4． 09 2． 95 1． 85
2． 2 虎杖浸提液对亚硝胺生成阻断作用正交试验结果
同样按照 1． 3． 1 和 1． 3． 2 试验方法和正交试验 3 因素和 3 水平，测得虎杖叶浸提物对亚硝酸胺生产
的阻断作用结果如表 3 所示。根据表 3 比较正交试验 3 因素和 3 水平测得结果的极差 R可知:A 因素虎
杖叶浸提温度为对亚硝胺生成的阻断作用影响最大的因素，其次 B 因素浸提物料液比对亚硝胺生成阻断
作用影响较大，C因素浸提时间在三因素中影响较小。虎杖叶浸提物对亚硝胺生产阻断作用的的最佳条
件组合是 A3B2C1，即温度为 100℃，料液比为 1∶ 50 和浸提时间为 5min的浸提条件下虎杖叶浸提物对亚硝
胺生产的阻断效果最好达到 90． 02%。A3B2C1 条件正好也是本正交试验所得的虎杖叶最佳浸提条件无
需做进一步的验证试验。
表 3 阻断率正交试验结果
Table 3 The results of orthogonal test on blocking rate
试验号
因素
A B C
温度 料液比 时间
阻断率(%)
1 1(80℃) 1(1∶ 100) 1(5min) 78． 78
2 1 2(1∶ 50) 2(10min) 82． 05
3 1 3(1∶ 25) 3(15min) 79． 51
4 2(90℃) 1 2 85． 64
5 2 2 3 86． 06
6 2 3 1 87． 13
7 3(100℃) 1 3 88． 87
8 3 2 1 90． 02
9 3 3 2 85． 44
K1 240． 34 253． 29 255． 93
K2 258． 83 258． 13 253． 13
K3 264． 33 252． 08 254． 44
k1 80． 12 84． 43 85． 15
k2 86． 28 86． 04 84． 38
k3 88． 11 84． 03 84． 81
R 7． 99 2． 01 0． 77
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3 讨论
文献报道已证明亚硝胺对癌症的发生有直接相关性［1 － 2］，寻找一种天然植物对亚硝胺生成的前体亚
硝酸盐的清除和对亚硝胺生成的直接阻断作用对预防癌症的发生具有重要的价值［3 － 8］。虎杖叶浸提物的
急性和长期毒理试验研究(数据在另一篇论文)表明，虎杖叶浸提物急性毒理的限度实验最小致死剂量
(MLD)值大于 5000mg /kg。长期毒理实验对动物的常规指标检测采用统计学分析 P ＞ 0． 05 无明显差别
(n = 60)。说明虎杖叶浸提物长期口服是安全的。本研究结果表明，在模拟人体胃液酸性环境下，虎杖叶
浸提物对亚硝酸盐的清除及亚硝胺生成的阻断有非常强的作用，从上述实验结果还可以看出，浸提物的浸
提温度、料液比和浸提时间对清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺生成有一定影响，其中温度影响最大，其次是料
液比，在浸泡时间在 5min后，浸泡温度对两者的活性影响不大。虎杖叶中有效成分较多，对清除亚硝酸盐
及阻断亚硝胺合成作用的具体有效成分尚不明确，确定其具体的有效成分还需进一步研究，不同采收时期
和不同部位的及不同加工方法后虎杖叶的浸提物对清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺生成是否存在影响，确定
最佳采收时期和最佳采收部位及最佳加工方法，对后期将虎杖叶开发成防癌保健茶都具有重要意义，这些
还有待作进一步深入研究。
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(责任编辑:李孟良)
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