全 文 ：间标定特征指纹峰 ,对 10批供试品 HPLC-FPS测定
结果进行比较分析 ,发现 10个特征峰是十批供试品
共有的 ,因此确定这 10个峰为特征指纹峰 。相对保
留时间 /m in(特征峰序号):0.3451(1), 0.5151(2),
0.6059(3), 0.6470(4), 0.9472(5), 1.000 (S),
1.213(7), 1.260(8), 1.291(9), 1.314(10);绞股蓝
总黄酮的指纹图谱应有 10个特征峰 (图 2)。
2.6.3　特征指纹峰相对峰面积:见表 3。 10个特
征指纹峰相对峰面积 (特征峰序号 ):0.0805(1),
1.4141(2), 0.0569(3), 0.1607(4), 0.1082(5),
1.000(S), 0.5336(7), 0.1900(8), 0.0408(9),
0.0781(10)。
根据药典委员会颁布的 “中药色谱指纹图谱相
似度评价系统 2004A版 ”,计算了 10批药材的相似
度 ,结果分别为 0.985, 0.978, 0.981, 0.928, 0.995,
0.947, 0.979, 0.996, 0.973, 0.972。
3 　小结与讨论
3.1 　制样方法的研究　在制样的过程中 ,为了使
黄酮类成分提取完全 ,除去影响测定的干扰性成分 ,
曾采用过不同极性的溶剂 (不同浓度的甲醇和乙
醇 )和不同的提取方式 (超声 、回等流 )进行提取 ,并
对提取时间进行了单因素试验 ,其中以石油醚回流
除去脂溶性较大的干扰性成分 ,再以甲醇回流提取
(3 h)效果最好 。
3.2 　流动相选择的研究　曾采用乙腈-水 、乙腈-甲
醇-水 、甲醇-水 、甲醇-0.4%磷酸流动相进行等度及
梯度洗脱 ,结果芦丁及槲皮素的色谱峰对称性差且
各色谱峰分离度不好 ,最后根据分离情况和色谱峰
的对称性选择以 0.4%磷酸水溶液-甲醇-乙腈进行
梯度洗脱 ,多数色谱峰达到基线分离 ,因此 ,最后决
定采用文中所用流动相 。
3.3　色谱柱选择研究　色谱柱是影响 HPLC指纹
图谱质量优劣的一个重要因素 ,在对 TURNER K ro-
masil
TM (250×4.6 mm , 5μm)、Lichroso rb(250×4.6
mm , 10 μm)(大连依利特公司)、D iamasil(200×4.6
mm , 5μm)(迪马公司)、Lichrosphe r 250×4.6mm , 5
μm(默克公司 )及 Ag ilent ZOBAX SB-C18(250×3.0
mm , 5 μm )(安捷伦公司 )的比较试验中 , 采用
TURNER K rom asil
TM (250×4.6mm , 5 μm)色谱柱得
到的色谱峰在出峰数 、分离度 、峰形及峰分布等方面
均达到理想的效果 。
3.4　不同产地药材指纹图谱相似度评价　十批不
同产地绞股蓝药材样品的指纹图谱面貌基本一致 ,
由各产地绞股蓝药材指纹图谱与对照指纹图谱相似
度计算结果可见 ,各产地绞股蓝样品指纹图谱相似
度性良好 (r>0.90),反应了药材的同源性 ,可以用
来作定性鉴别 。本方法稳定 、可靠 、重现性好 ,可为
绞股蓝原药材及其制剂质量标准的拟定提供参考依
据 ,也为含绞股蓝的中药方剂物质基础研究与配伍
规律提供分析方法 。
参 考 文 献
[ 1] 广西科学院广西植物研究所 .广西植物志(第 1卷).
南宁:广西科学技术出版社 , 1991:716.
[ 2] 薛祥骥 , 李华池 .绞股蓝中皂苷和黄酮的含量分析 .中
国中药杂志 , 1994, 19(3):142.
[ 3] 国家药品监督管理局 . 中药注射剂指纹图谱研究的技
术要求(暂行).中成药 , 2000, 22(10):671-675.
(2006 - 12 -14收稿)
基金项目:国家科技部基础性工作专项资助项目(2003DIATH 031)*通讯作者:李先端 , Te l:(010)84036552, Em ail:m aoshu jie@ 163. com。
香橼药材高效液相指纹图谱研究
毛淑杰 ,朱景宁 ,顾雪竹 ,李先端* ,林淑芬
(中国中医科学院中药研究所 ,北京 100700)
　　摘要　目的:采用高效液相色谱法 , 研究并建立香橼 2个品种药材的指纹图谱。方法:采用 HPLC方法 ,用 K ro-
m asil C18(4.6 mm ×250 mm , 5μm)色谱柱 , 甲醇和冰醋酸-水(3.1∶100, v /v)梯度洗脱;流速 1. 0 m l /m in;检测波长
284 nm。结果:运用梯度洗脱得到的色谱图各色谱峰分离较好 , 达到中药指纹图谱研究的技术要求。 结论:采用
HPLC指纹图谱分析 , 可对香橼 2个品种药材的质量作出评价。
关键词　香橼;指纹图谱;高效液相色谱法
中图分类号:R282.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)08-0932-05
932 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牱牣牥牳牣牥牪牪
TheHPLC F ingerpr intAnalysis of Fruc tus C itr i
MAO Shu-jie, ZHU Jin-ning, GU Xue-zhu, L I X ian-duan, LIN Shu-fen
( Institute of Ch ineseM a te riaMedica, China Academy o f Chine seM ed icine Sciences, Be ijing 100700, China)
Abstrac t　Objective:To study and e stablish the fingerprin t o f raw F ructu s C itri by phased high perfo rmance liqu id ch rom a tog ra-
phy.M ethod:The chrom atographic conditions w ere as fo llow s:a K rom asil C18 co lum n was used; the m ob ile phase was composed of
m ethanol and acetic-w a te r(3. 1∶100, v /v)w ith g radien t e lution;the flow ra tew as 1.0 m l /m in and the UV absorbance de tection w as se t
at 284 nm. Resu lt:Under the se lected ch rom a tog raphic conditions, good H PLC finge rprin ts o f F ructus C itri w ere obtained. Conclu-
sion:Qua lity o f raw F ructu s C itri can be controlled effective ly by HPLC fingerprint.
K ey words　F ruc tus C itri;F ingerprin t;H PLC
　　中国药典 2005年版一部记载 ,香橼为芸香科柑
桔属植物枸橼 C itrusmedica L.与香圆 Citrusw ilson ii
Tanaka的干燥成熟果实 ,是常用理气药之一 。具有
舒肝理气 、宽中化痰之功效 。中医用于治疗肝胃气
滞 、胸胁胀痛 、脘腹痞满 、呕吐噫气 、痰多咳嗽等
症 〔1〕。由于目前药材市场上两个品种的药材与同
科同属药材如枳壳 、柚子等混用现象严重 ,且未见有
该药的指纹图谱方面的研究报道。我们得到科技部
项目资助 ,对香橼药材的质量进行系统研究 。本文
报道建立香橼药材的指纹图谱的研究结果 。本研究
按照国家药典委员会关于 “中药注射剂指纹图谱研
究的技术要求 (暂行 )的通知 ”〔2〕要求的方法 ,参照
香橼同科同属药材的相关文献 , 以高效液相
(HPLC)梯度洗脱法对香橼 2个品种的药材进行了
指纹图谱研究 。实验证明 ,运用梯度洗脱得到的色
谱图各色谱峰分离较好 ,达到指纹图谱研究的技术
要求 。该方法准确 、重复性好。为香橼药材的质量
控制标准的建立积累研究数据 ,为评价香橼药材质
量的优劣及确定香橼药材 GAP生产基地的范围提
供了依据 。
1　仪器与试药
1.1　仪器　W atersA lliance高效液相色谱仪 ,包括
2695 Sepa ra tionsM odu le四元泵 、在线真空脱气机 、
自动进样器 、柱温箱 ,W ate rs 2996二极管阵列 PAD
检测器 , M illennium 32色谱工作站。
1.2　试剂与样品　柚皮苷 、橙苷皮对照品购于中
国药品生物制品检定所 。提取用甲醇为分析纯;液
相色谱用甲醇为色谱纯 ,用水为高纯水 。香橼药材
　　表 1 　实验用香橼药材样品
编号 名称 收集(采集地) 产地 收集时间 原植物 鉴定人
1 香圆 北京 四川 2005. 5 Citrusw ilson ii 张丹彦
2 香圆 安国 广西 2005. 4 Citrusw ilson ii 张丹彦
3 香圆 四川 湖北 2005. 9 Citrusw ilson ii 张丹彦
4 香圆 湖北 湖北 2005. 10 Citrusw ilson ii 毛淑杰
5 香圆 湖南 云南 2005. 10 Citrusw ilson ii 毛淑杰
6 香圆 浙江 温州 2005. 10 Citrusw ilson ii 毛淑杰
7 香圆 合肥 安微 2005. 10 Citrusw ilson ii 毛淑杰
8 香圆 安徽安庆市(鲜品) 安微 2005. 11 Citrusw ilson ii 胡世林
9 香圆 湖南 湖南药检所 2005. 11 Citrusw ilson ii 湖南药检所
10 香圆 广西医药公司 广西 2005. 11 Citrusw ilson ii 广西
11 香圆 如皋市健康园艺场(鲜品) 江苏 2005. 11 Citrusw ilson ii 李春风
12 枸橼 四川 四川 2005. 7 Citrusm edica 张丹彦
13 枸橼 重庆(鲜品) 重庆 2005. 10 Citrusm edica 江东
14 枸橼 昆明菊花药材市场 1批 云南 2005. 11 Citrusm edica 胡世林
15 枸橼 昆明菊花药材市场 2批 云南 2005. 11 Citrusm edica 胡世林
16 枸橼 永德县(鲜品) 云南 2005. 11 Citrusm edica 毛淑杰
17 枸橼 龙陵县(鲜品) 云南 2005. 11 Citrusm edica 毛淑杰
　　注:毛淑杰鉴定为根据薄层等鉴定结果
933 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
分别为湖北 、云南 、安徽 、江苏 、广西 、四川 、浙江 、湖
南等八个省市的市售及自采鲜品共 17批 ,均经中国
中医科学院中药所胡世林研究员 、广州中医药大学
鉴定教研室张丹彦教授鉴定为香橼(见表 1)。其中
包括香圆 C itrus w ilson ii Tanaka 11批 ,枸橼 C itrus
m edica L. 6批 ,实验用样品粉碎过 80目筛备用 。
　表 2 　HPLC梯度洗脱条件
t(m in) A泵(M eOH) B泵(冰醋酸-H2O =3. 1∶100)
　0 1 99
10 10 90
30 35 65
50 45 55
70 60 40
90 95 5
100 95 5
2 　实验方法与结果
2.1 　色谱条件　K rom asil-C18(4.6mm ×250 mm , 5
μm)色谱柱;流速 1.0m l /m in;检测波长 284 nm;柱
温 30℃;分析时间 100m in;进样量 20 μl;梯度条件
如表 2。
2.2　对照品及供试品溶液的制备
2.2.1 　对照品溶液的制备:分别精密称取柚皮苷
对照品 1.19 mg,橙皮苷对照品 1.03 mg,用 50%甲
醇定容至 25 m l,再分别各取 5 m l,制备成混合的对
照品溶液 。
2.2.2 　供试品溶液的制备:分别取香橼药材样品
粉末 (过 80目筛 )各约 500 mg,精密称定 ,置 100 m l
锥形瓶中 ,精密加入甲醇 25m l,称定重量 ,水浴加热
回流 60m in,放冷后补足重量 ,摇匀 ,滤过 ,精密量取
续滤液 20 m l,置于梨形瓶中蒸干 ,再用 50%甲醇定
容至 10 m l,摇匀 ,过 0.45 μm微孔滤膜 ,续滤液作
为供试品溶液 。进样量 10 μl。
2.3　参照峰的选择　从香橼的含量测定高效液相
色谱图谱中我们发现香圆中柚皮苷峰与相邻峰分离
良好 ,故香圆选柚皮苷峰作为参照峰 s,枸橼中橙皮
苷与相邻峰分离良好 ,且不含柚皮苷 ,故选橙皮苷作
为参照峰 s。见图 1、2。
图 1　香圆药材 HPLC指纹图谱
图 2　枸橼药材 HPLC指纹图谱
2.4 　方法学考察　取香圆与枸橼样品进行指纹图
谱预试验 ,发现香圆和枸橼在上述流动相洗脱程序
条件下 ,可得分离度较好 、各峰分布较均匀的指纹图
谱 (见图 1、2),并着重选择了香圆峰面积较大的 11
个峰(见图 1),将柚皮苷的峰 (6号峰 )作为标准峰 ,
其他各峰与其比较 ,计算相对数据 , 进行方法学研
究 。
2.4.1　重复性试验:取同一批次 (3号四川产湖北
购)香圆药材 5份 ,精密称定 ,按供试品溶液的制备
方法 ,制备成供试品溶液 ,检测指纹图谱 。结果表
明 ,各色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值基本
一致 , RSD均小于 5%,符合指纹图谱的要求 。
2.4.2 　稳定性试验:取同一批次 (3号四川产湖北
购)香圆供试品溶液 ,分别于 0、3、6、9、12、24 h进行
指纹图谱测定 ,结果表明 ,各共有峰相对保留时间基
本一致 ,各共有峰单峰面积 RSD均小于 5%,符合指
纹图谱要求。
2.4.3 　精密度试验:取同一批次 (3号四川产湖北
购)香圆供试品溶液 , 连续进样 5次 ,检测指纹图
谱 ,各色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值基本
一致 , RSD均小于 5%,符合指纹图谱要求。
934 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
图 3　11批香圆药材指纹图谱纵向叠加图
图 4　6批枸橼药材指纹图谱纵向叠加图
　　表 3 　香圆 HPLC指纹特征共有峰相对保留时间
峰号 样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
s 1. 0000 1. 0000 1.0000 1. 0000 1.0000 1. 0000 1. 0000 1.0000 1. 0000 1.0000 1. 0000
1 0. 6781 6. 6773 0.6770 0. 6780 0.6782 0. 6780 0. 6780 0.6779 0. 6678 0.6780 0. 6781
2 0. 7701 0. 7696 0.7689 0. 7702 0.7701 0. 7702 0. 7700 0.7703 0. 7700 0.7695 0. 7702
3 0. 7822 0. 7821 0.7817 0. 7830 0.7827 0. 7824 0. 7826 0.7827 0. 7828 0.7826 0. 7823
4 0. 8785 0. 8782 0.8784 0. 8790 0.8786 0. 8782 0. 8791 0.8788 0. 8786 0.8784 0. 8659
5 0. 8891 0. 8898 0.8893 0. 8900 0.8892 0. 8891 0. 8890 0.8894 0. 8888 0.8891 0. 8890
7 1. 1977 1. 1976 1.1959 1. 1980 1.1981 1. 1981 0. 1983 1.1980 1. 1982 1.1979 1. 1976
8 1. 2956 1. 2959 1.2959 1. 2975 1.2968 1. 2971 1. 2960 1.2956 1. 2949 1.2959 1. 2958
9 1. 7787 1. 7779 1.7776 1. 7790 1.7789 1. 7792 1. 7788 1.7790 1. 7788 1.7765 1. 7777
10 2. 3596 2. 3587 2.3553 2. 3608 2.3568 2. 3573 2. 3608 2.3639 2. 3590 2.3559 2. 3572
11 2. 4471 2. 4469 2.4438 2. 4483 2.4445 2. 4458 2. 4488 2.4510 2. 4479 2.4428 2. 4444
935 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月
　　表 4 　香圆 HPLC指纹特征共有峰相对峰面积
峰号
样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
s 1. 0000 1. 0000 1.0000 1. 0000 1.0000 1. 0000 1. 0000 1.0000 1. 0000 1.0000 1. 0000
1 0. 0041 0. 0081 0.0020 0. 0038 0.0038 0. 0037 0. 0026 0.0098 0. 0012 0.0055 0. 0062
2 0. 0055 0. 0078 0.0042 0. 0041 0.0044 0. 0049 0. 0041 0.0099 0. 0179 0.0069 0. 0089
3 0. 0176 0. 0452 0.0060 0. 0067 0.0183 0. 0103 0. 0052 0.0222 0. 0173 0.0142 0. 0131
4 0. 0026 0. 0003 0.0027 0. 0035 0.0023 0. 0026 0. 0025 0.0002 0. 0064 0.0068 0. 0062
5 0. 0043 0. 0061 0.0039 0. 0049 0.0044 0. 0045 0. 0046 0.0106 0. 0054 0.0048 0. 0062
7 0. 0065 0. 0057 0.0058 0. 0068 0.0054 0. 0065 0. 0065 0.0166 0. 0318 0.0105 0. 0110
8 0. 1200 0. 1690 0.0872 0. 0598 0.1270 0. 0924 0. 0913 0.0014 0. 0039 0.1920 0. 0027
9 0. 0020 0. 0022 0.0051 0. 0015 0.0023 0. 0017 0. 0021 0.0006 0. 0061 0.0025 0. 0006
10 0. 0009 0. 0017 0.0019 0. 0007 0.0011 0. 0010 0. 0009 0.0035 0. 0022 0.0016 0. 0018
11 0. 0017 0. 0028 0.0008 0. 0013 0.0012 0. 0011 0. 0014 0.0014 0. 0028 0.0012 0. 0004
　表 5　　枸橼 HPLC指纹特征共有峰相对保留时间
峰号 样品
12 13 14 15 16 17
s 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1.0000 1. 0000
1 0. 5153 0. 5134 0. 5153 0. 5141 0.5146 0. 5140
2 0. 6012 0. 5999 0. 6006 0. 5996 0.5992 0. 5988
3 0. 7981 0. 7957 0. 7987 0. 7979 0.7984 0. 7982
4 0. 9581 0. 9579 0. 9574 0. 9580 0.9582 0. 9580
6 1. 0187 1. 0195 1. 0184 1. 0184 1.0183 1. 0187
7 1. 1972 1. 1941 1. 1967 1. 1978 1.1970 1. 1982
8 2. 4252 2. 4248 2. 4929 2. 4245 2.4280 2. 4285
　表 6 　枸橼 HPLC指纹特征共有峰相对峰面积
峰号 样品
12 13 14 15 16 17
s 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1. 0000 1.0000 1. 0000
1 0. 0104 0. 4131 0. 0512 0. 0151 0.3458 0. 0851
2 0. 0304 0. 2385 0. 0250 0. 0165 0.0471 0. 0183
3 0. 2499 0. 4112 0. 3165 0. 2658 0.2627 0. 1252
4 0. 2110 0. 2472 0. 0099 0. 0898 0.1435 0. 0254
6 0. 0868 0. 7549 0. 2919 0. 0868 0.4995 0. 1834
7 0. 0559 0. 4329 0. 0375 0. 3942 0.4018 0. 1931
8 0. 0404 0. 2251 0. 0221 0. 0227 0.0724 0. 0291
2.5 　样品测定 　取不同批次香橼药材粉末 (80
目 ),精密稳定 ,按供试品溶液的制备方法 ,制备成
供试品溶液 ,精密量取各供试品溶液 10 μl,注入液
相色谱仪 ,记录 100 m in色谱图即得。 11批香圆药
材与 6批枸橼药材的指纹图谱见图 3、4。其中香圆
选择柚皮苷峰作为标准峰 、枸橼选择橙皮苷峰作为
标准峰 ,并分别计算其他各峰的相对保留时间和相
对峰面积比值 ,见表 3、4、5、6。利用 “中药色谱指纹
图相似度值评价系统 2004A版”软件 ,分别对 11批
香圆药材及 6批枸橼药材指纹图谱纵进行匹配 ,相
似度范围分别在 0.99 ～ 1.00 , 0.90 ～ 1.00。可见所
采用的香圆药材和枸橼药材整体上相似 ,说明本实
验方法可靠稳定。
3　讨论
3.1　提取溶媒的选择　曾采用乙醇提取 、制成甲
醇供试品溶液及甲醇提取 、制成甲醇供试品溶液 ,进
行试验 ,结果以甲醇提取溶液得到的指纹图各色峰
之间分布均匀 ,主要峰分离度较好 ,所以我们选择甲
醇作为提取溶剂。
3.2　流动相梯度洗脱程度各溶剂比例选择　曾选
择其他 3种梯度洗脱程序的各溶剂比例 ,对香圆供
试品溶液进行指纹图谱试验 ,结果以表 1的梯度洗
脱程序条件为好 ,并选择指纹图中峰面积比例较大
各主要峰 (共有峰 )进行稳定性 、精密度 、重复性试
验考察 ,得到的试验数据均符合指纹图谱要求。
3.3　香圆与枸橼指纹图谱的区别　从 11批香圆
药材与 6批枸橼药材的指纹图谱的结果来看 ,二者
图谱差异明显 。经 “中药色谱指纹图谱相似度评价
系统 2004A版 ”软件计算 ,两者差异非常显著。可
见两个品种来源的香橼 ,利用其指纹图谱的差异 ,完
全能够达到评价质量及鉴别的目的。
3.4　利用 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统
2004 A版”软件 ,分别对 11批香圆药材所指认的 11
个峰及 6批枸橼药材所指认的 8个峰指纹图谱分别
进行匹配 ,相似度值范围分别在 0.99 ～ 1.00, 0.90
～ 1.00。可见所采用的不同产地的香圆药材和枸橼
药材整体上相似 ,表明本研究所制定的指纹图谱符
合要求。
参 考 文 献
[ 1] 卫生部药典委员会 .中国药典 .一部 .北京:化学工业
出版社 , 2000:182.
[ 2] 周玉新 ,等 .中药指纹图谱研究技术 .北京 .化学工业
出版社 , 2002:131-168.
(2007 - 01 -29收稿)
936 中药材 Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 8期 2007年 8月