全 文 ：收稿日期:2000　01　24
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39760007)
作者简介:李　红(1957—),女 ,河北景县人 ,广西师范大学实验师
第 18卷　第 2 期 广西师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　Vol.18　No.2
　2000年 6 月 JOURNAL OF GUANGXI NORMAL UNIVERSITY June　2000
沙田柚花柱蛋白提取液的生化特性研究
李　红　李　楠　薛妙男
(广西师范大学生物学系,广西 桂林 541004)
摘　要:通过血凝活性和糖基抑制实验方法 , 对沙田柚不同发育时期 1/ 2 花柱蛋白提取液进行测定.实验结
果揭示 ,花柱蛋白提取液中存在一种能与伴刀豆球形蛋白(ConA)相结合的糖蛋白 , 具血凝活性.提取液中的
糖蛋白的血凝活性能被甘露糖 、N-乙酰葡萄糖 、阿拉伯糖所抑制 ,说明糖蛋白中的单糖成分主要是甘露糖和
乙酰葡萄糖类物质.随着花柱发育成熟 , 1/2 花柱提取液血凝活性反应强度有一明显变化梯度———单核期不
明显 ,开花期次之 , 自交授粉后 2～ 3 d 最明显 ,与提取液对自交花粉管生长抑制作用的变化梯度相一致.
关键词:沙田柚;花柱;血凝活性;糖基抑制
分类号:Q946.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-6600(2000)02-0073-05
近年来 ,在研究自交不亲和植物中花粉管萌发生长受抑制机理方面取得了一些进展 ,发现糖蛋白凝
集素等雌蕊分泌物可能参与这种抑制作用[ 1 , 2] .体外实验也证实凝集素可以降低花柱提取液对花粉管
的生长抑制作用 ,主要由于凝集素可以特异地与某种多糖或糖蛋白结合 ,使糖蛋白识别能力降低或丧
失[ 3].近年来 ,我们在对沙田柚自交不亲和荧光显微镜观察研究中发现:花粉管生长受阻是在授粉后 2
～ 3 d花柱 1/2处 ,属配子体型自交不亲和型[ 4] ;用辣根过氧化物酶标 ConA电镜细胞化学方法证实 ,花
柱通道细胞中存在与 ConA相结合的糖蛋白颗粒 ,并定位于纤维壁上[ 5].为揭示沙田柚自交不亲和花柱
识别产物的生化特性及产生的时空关系 ,我们对沙田柚不同发育时期 1/2花柱提取液进行血凝活性测
定 ,以及糖基抑制和花粉离体萌发生长抑制实验 ,寻找不亲和基因产物在花粉中高效表达的时间 ,为进
一步分离纯化 S基因表达产物 ,克服自交不亲和途径提供实验依据.
1　材料和方法
1.1　材料
采自桂林广西柑桔研究所沙田柚实验园地的成年沙田柚结果树和授粉树中酸柚结果树.
1.2　实验方法
沙田柚雌雄蕊发育及相关性研究结果表明:沙田柚雌雄蕊发育时间基本上是同步的[ 6] ,因此采用花
粉发育阶段作为花柱发育阶段的形态指标进行标本采集 ,分别取单核期 、开花期和自交授粉后 2 ～ 3 d
的1/2花柱段进行花柱蛋白提取 ,用 Tris-Hcl(0.1 mol/L pH=7.2)匀浆 、提取 、离心(12 000 r/min)15min ,
取上清液经35%和 60%的硫酸铵分级沉淀 ,取沉淀部分 ,用双蒸水透析 ,再离心(8 000 r/min)10 min ,取
沉淀部分备用.另取自交授粉后 2 ～ 3 d的酸柚1/2花柱蛋白提取液作对照 ,处理方法和步骤同上 ,另一
对照加PBS 液.
1.2.1　血凝活性测定
DOI :10.16088/j.issn.1001-6600.2000.02.017
按文献[ 7]的方法进行处理 ,在微量 U型血凝板上进行 12种处理 ,每孔内加 25 μL PBS(0.1 mol/L
pH=7.2).在第 1孔内加入 25μL待测样品 ,用微量吸器稀释至倍比 28 ,分别依次加入第 1孔下面的各
孔中 ,振荡混匀后置 30℃温箱 ,取出后各加入兔血红细胞 ,浓度为 2%,每孔加入 25 μL ,振荡 1 min ,于
30℃温箱 1 h ,肉眼观察结果并拍照.
1.2.2　花柱提取液的糖基抑制实验
将授粉 2 ～ 3 d花柱提取液 ,按本文 1.2.1方法 ,在微量U型血凝板进行 8种处理 ,加样方法和培养
方法同1.2.1 ,每种处理多加0.4 mol/L的各种糖溶液(见表 2).
1.2.3　花粉离体培养
取单核期和开花期授粉 2 ～ 3 d的 35%硫酸铵级分的花柱提取物沉淀0.1 g加 10mL PBS(pH=7.2)
与花粉萌发培养液(0.4 mol/L PEG+0.01%硼酸)等量混合 ,加入沙田柚花粉 ,振荡 6 h ,镜检观察拍照.
2　实验结果
2.1　花柱提取液中识别蛋白产生的时间
为了解沙田柚花柱中识别蛋白产生的时间 ,我们对不同发育时期的沙田柚花柱提取液进行血凝活
性测定.结果见表1和图 1.
表 1　沙田柚不同发育时期花柱提取液的血凝活性
序　号 样　　　　品 处　理 结　果
1 单核期的花柱提取液 35% 2%兔血红细胞 +
2 单核期的花柱提取液 60% 同　　上 +
3 开花期花柱提取液 35% 同　　上 +
4 开花期花柱提取液 60% 同　　上 +
5 授粉 2 ～ 3 d花柱提取液 35% 同　　上 +
6 授粉 2 ～ 3 d花柱提取液 60% 同　　上 +
7 1 mg/mL PBS ConA 液 同　　上 +
8 授粉 2 ～ 3 d花柱提取液 35%+ConA 同　　上 -
9 授粉 2 ～ 3 d花柱提取液 60%+ConA 同　　上 -
10 酸柚自交授粉 2 ～ 3 d提取液 35% 同　　上 -
11 酸柚自交授粉 2 ～ 3 d提取液 60% 同　　上 -
12 20 mol/ L PBS液(对照)pH=7.2 同　　上 -
　　　　　　注:35%和 60%为花柱蛋白质提取液的 35%和 60%(NH4)2SO4 离析级分　　　“ +”表示有血凝活性 , “ -”表示无血凝活性
图 1　沙田柚不同发育时期花柱提取液的血凝活性
从图中可以观察到沙田柚不同发育时期
花柱提取液都具有血凝活性(图 1序号
1 ～ 6)在图A 序号 7处只加入了伴刀豆
球蛋白 ConA 凝集素也有明显血凝反
应 ,但当 ConA 与沙田柚花柱蛋白提取
液同时加入时 ,则未见有血凝活性(图 1
序号 8 , 9);对照中 ,酸柚花柱提取液中
无血凝活性(图 1序号10 ,11),加PBS中
也无血凝活性(图 1序号 12);还可以观
察到沙田柚花柱提取液血凝活性反应在
不同发育时期有一个明显梯度 ,单核期
不明显(图 1序号 1 ,2),开花期次之(图
1序号2 , 3),自交授粉后 2 ～ 3 d最明显(图 1序号 5 ,6),说明花柱中识别蛋白形成量最多时间是在开花
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授粉后2 ～ 3 d ,但提取液在 35%与 60%硫酸铵级分中血凝活性强度差异不明显.
2.2　花柱提取液中识别蛋白的单糖成分
为了解自交授粉后 2 ～ 3 d花柱提取液中的识别蛋白的单糖成分 ,进行了血凝活性的糖基抑制实
验 ,结果见表 2和图 2.
表 2　沙田柚自交授粉 2 ～ 3 d花柱提取液血凝活性的糖基抑制实验
序　号 样　　　　　　品 处　理 结　果
1 自交授粉 2～ 3 d 35%(NH4)2SO4级分的花柱提取液+兔血红细胞 PBS 液 pH=7.2 +
2 同　　　上 乳糖 +
3 同　　　上 果糖 +
4 同　　　上 岩藻糖 +
5 同　　　上 阿拉伯糖 -
6 同　　　上 甘露糖 -
7 同　　　上 N-乙酰葡萄糖 -
8 同　　　上 木糖 -
　　　“ +”表示有血凝活性 , “ -”表示无血凝活性
图 2　沙田柚自交授粉 2～ 3 d 花柱提取液
血凝活性的糖基抑制实验
1.对照　2.乳糖　3.果糖　4.岩藻糖
5.阿拉伯糖　6.甘露糖　7.N-乙酰葡萄糖　8.木糖
从图 2和表 2可以看出 ,在糖基抑制实验中 ,阿拉伯糖 、甘露
糖 、N-乙酰葡萄糖 、木糖能抑制花柱提取液中的血凝活性 ,而
乳糖 、果糖 、岩藻糖等糖类没有抑制作用.
2.3　沙田柚不同发育时期花柱提取液对花粉管生长抑制的
影响
随着花柱发育成熟 ,提取液对花粉管生长抑制强度增加 ,
单核期的花柱提取液对花粉生长几乎无抑制作用 ,花粉管生
长长度和对照无差异(图 3a , b),开花期的花柱提取液对花粉
管生长具有明显抑制作用(图 3c),开花授粉后 2 ～ 3 d后 ,花
粉管生长抑制更明显 ,花粉管变得较为短粗 ,尖端膨大或弯曲
(图 3d).
3　讨　论
凝集素无论在动物或植物体内 ,对各种识别现象都起着重要作用 ,生物体内的许多重要生理功能
(如花粉与雌蕊的受精识别等)都是通过凝集素与细胞表面多糖或糖蛋白相互作用完成.沙田柚花柱提
取液具有血凝活性 ,说明提取液中存在着凝集素类物质 ,而 ConA 能抑制沙田柚花柱提取液的血凝活
性 ,主要是 ConA能特异性地与花柱提取液中的糖蛋白结合所致 ,所以我们认为沙田柚花粉和在花柱中
生长抑制受阻的原因 ,是由于花柱中凝集素与花粉管壁上的糖蛋白结合 ,干扰壁的形成而引起.糖基抑
制实验揭示了沙田柚花柱提取液中糖蛋白中单糖成分为甘露糖 ,N-乙酰葡萄糖和阿拉伯糖.
实验表明 ,沙田柚花柱提取液中糖蛋白随着雌蕊成熟逐步形成 ,单核期很少 ,开花期迅速增加 ,授粉
后2 ～ 3 d达最高值 ,说明沙田柚自交不亲 S基因高效表达是在授粉后 2 ～ 3 d ,表达位置在花柱 1/2处 ,
恰好和沙田柚花粉管在花柱生长受阻抑制的时间和部位一致[ 4].
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图 3　沙田柚不同发育时期花柱提取液对花粉管抑制的影响
a.沙田柚花粉在酸柚花柱提取液中萌发生长正常(对照);b.在单核期花柱提取液对沙田柚花粉萌发生长无明显抑制作用;c.在开花
期提取液中的沙田柚花粉能正常萌发花粉管 ,生长明显抑制;d.在自交授粉 2～ 3 d花柱提取液中 ,沙田柚花粉能正常萌发 ,花粉管生
长抑制;更明显 ,花粉管尖端膨大和弯曲
参 考 文 献
1　Clark A E , Anderson M A , Basic T ,Harris P J.Molecular basis of cell recognition , during fertilization in higher plants[ J] .J Cell Sci
(suppl), 1985 , 2:261～ 285
2　Sharma N , Shivarnak R C.Overcoing self-incompatibility though the use of lectins and sugars in petunin and Eruca[ J] .Ann Bot ,
1985 , 55:139～ 141
3　阙求登 ,唐锡华.南瓜雌蕊与自花及远源花粉的相互作用[ J].植物学报 , 1987 , 13(4):378～ 385
4　薛妙男 ,陈腾土 , 杨继华.沙田柚自交和异交亲和性观察[ J].园艺学报 , 1995 , 22(2):127～ 132
5　薛妙男 ,杨继华 , 李　楠.沙田柚自交不亲和性结构基础研究[ J] .植物学通报 , 1996 , 13(专辑):89～ 90
6　薛妙男 ,张　莹.沙田柚雌雄蕊发育及相关性[ J].广西植物 , 1993 , 13(2):170 ～ 173
7　孙　册 ,唐锡华.稻种萌发各组织中凝集素的分布[ J].植物生理学报 , 1981 , 7(4):385 ～ 387
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THE RESEARCHES ON THE BIOCHEMICAL FEATURES OF PROTEIN
EXTRACTION SOLUTION FROM STYLE OF SHATINYU
LI Hong　LI Nan　XUE Miao-nan
(Department of Biology , Guangxi Normal University , Guilin 541004 China)
Abstract:By hemagglutination activity determination and glycosyl inhibition , the protein extraction solution from 1/2
style in the various developing stages of Shatinyu(Citrus grandis var.Shatinyu Hort.)was determined.The results
showed that there was a kind of glycoprotein which could bind with ConA-FITC in the sylar solution and the glyco-
protein had hemagglutination.The activity was inhibited by D-mannose ,N-acetyl-D-giucosamirce and L-ara binose.
This showed that the monosaccharides of glycoprtein were D-amnnose and N-acetyl-D-glucosamirce.The reaction in-
tensity of hemagglutination activity of the solution was an obvious gradual change from the uninucleate stage to anthe-
sis and was most obvious in the 2 ～ 3 day after pollination.The result was unanimous with the changing steps of in-
hibition of the solution to the growth of self-pollinated pollen tube.
Key words:Shatiyu(Citrus grandis var.Shatinyu Hort.);style;Hemagglutination activity;glycosyl inhibition
(责任编辑　马殷华)
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