全 文 ：收稿日期:2006-05-26。
基金项目:国家 “十五 ”科技攻关子课题 2001BA510B08。
作者简介:孙红阳(1982～ ),男 ,在读硕士研究生;研究方向为种苗培育理论与技术。
通讯作者:沈海龙;E-mail:shenli@public.hr.hl.cn。
离体胚培养途径探索东北刺人参种子的休眠原因
孙红阳　　张　鹏　　沈海龙
(东北林业大学林学院　黑龙江哈尔滨　150040)
摘要:为深入探索东北刺人参(OplopanaxelatusNakai)种子休眠的原因 , 在 WPM培养基上对经过不同处理的东北刺人
参种子胚进行离体萌发试验。结果表明:由于胚乳的存在 ,即使种胚已经完成了形态后熟 , 胚仍然不能萌发;种子胚在尚
未分化完全时处于休眠状态 ,在离体条件下不能萌发;当胚完成分化以后 , 胚本身不是休眠的 ,在适宜的离体条件下能正
常萌发 ,而且胚发育越接近成熟其萌发力就越强。在一定的范围内 ,外源激素对离体胚萌发有促进作用 。
关键词　东北刺人参　种子休眠　离体胚　萌发
SeedDormancyCauseofOplopanaxelatusRevealedbyinvitro
CultureofExcisedEmbryos
SunHongyang, ZhangPeng, ShenHailong
(SchoolofForestry, NortheastForestryUniversity, Harbin150040)
Abstract:ForsearchingafterthedormancycauseofOplopanaxelatusseeds, thegerminationtestbyexcised
embryosinvitroculturedonWPMmediumwasconducted.Theresultsshowedthat:theexcisedembryoscould
notgerminatebecauseoftheexistingofendosperm, eveniftheyhadfinishedthemorphologicalafter-ripening;
theembryosweredormantandcouldnotgerminateunderexcisedconditionwhentheyhadnotfinishedmor-
phologicaldiferentiation;whenembryoshadfinishedmorphologicaldiferentiation, theywerenotdormantand
couldgerminateunderfavourableexcisedcondition, themorematuredoftheembryo, thebeteritgerminated.
Incertainrange, exogenoushormonecouldaccelerategerminationofexcisedembryos.
Keywords　OplopanaxelatusNakai　Seeddormancy　Excisedembryo　Germination
东北刺人参(OplopanaxelatusNakai)为五加科刺人参属的落叶灌木。主要产于吉林省东南部和辽宁省东部
的长白山区 ,生于海拔 1 400 ～ 1 800m的针阔叶树混交林下。朝鲜 、前苏联也有少量分布[ 1 ～ 3] 。是一种珍贵的药
用 [ 4 ～ 6] 、观赏和保健食品植物 [ 7] 。目前 ,东北刺人参已经处于濒危状态 ,被列为国家二级保护植物 [ 8] 。为了开发
东北刺人参资源 ,做到可持续利用 ,合理 、有效地扩大东北刺人参资源便成为亟待解决的问题。
过去的少量栽培研究 [ 9 ～ 12]认为 ,东北刺人参种子结实率低 ,偶尔能采到种子 ,但发芽很困难 ,应采用分株 、压
条或扦插等无性繁殖方法 。采用压条 、扦插等无性繁殖方法能够获得一定量的植株 ,但这些方法都受到资源数量
限制 ,甚至要破坏野生资源 ,不适合于大规模应用。金英善等 [ 13]进行了东北刺人参的组织培养探索 ,诱导出了愈
伤组织 ,但没有获得组织培养苗 ,因此也没有建立起完整的组织培养技术体系。刘继生等 [ 14]研究发现 ,东北刺人
参通过种子繁殖是可行的 ,但是种子发芽和出苗状况并不理想。为此 ,对东北剌人参种子休眠的原因和机理进行
了深入的探索 ,旨在通过东北刺人参离体胚萌发试验为揭示其休眠机理提供依据 。
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1　材料和方法
1.1　材料
东北刺人参种子于 2002年 8月下旬采集于吉林省长白县海拔 1 300m处针叶林下的自然居群。果实用水浸
泡并搓洗去果皮和果肉 ,挑出饱满种子 ,自然干燥后用玻璃瓶密封存于冰箱中备用。试验用种子包括以下 2种:
(1)经过 4个月暖温(15 ～ 20℃)和 3个月低温(4℃)处理的裂口种子(胚已充满胚腔);(2)只经过 4个月暖温
(15 ～ 20℃)处理未经低温处理的未裂口种子(胚处于不同发育状态 ,有的胚尚未分化完全 ,有的胚已经分化完
全 ,但大小不一)。
1.2　方法
(1)培养基的配制:基本培养基采用 WPM配方;加入蔗糖 20g/L;加入激素 2iP(异戊烯基腺嘌呤),共设置 3
种激素浓度:0、1、、10μM/L;pH值调节到 5.8;固化剂为琼脂和洁冷胶(Gelrite)混用 ,琼脂 3g/L, Gelrite1.1g/L。
然后加热溶解 、分装(每瓶 30ml),在 121℃下高压灭菌 20min后取出冷却定型。
(2)外植体表面消毒:经过层积处理的裂口种子和未裂口种子 ,先用自来水浸泡 24h,将外种皮剥去 ,流水冲
洗 2h,用蒸馏水浸泡 24h,经 70%酒精处理 30s后 ,用 10%H2O2消毒 10min,在超净工作台上用无菌水冲洗 3次 ,
然后置于盛有无菌水的烧杯中备用。
(3)接种:将两种已消毒种子 ,带胚乳和不带胚乳(将胚取出)两种处理分别接种到含不同浓度激素(0、1、10
μM/L2iP)的 WPM培养基上进行胚培养 ,每种处理 5次重复(接种 5瓶 ,由于东北刺人参种子较稀少 ,非常珍贵 ,
所以每瓶接 1粒种子)。对于种胚极小(未分化完全)的可在解剖镜下将胚取出 ,再接种到培养瓶中。
(4)培养条件:接种后放入培养室中培养 ,每天光照 16h,光照强度为 1 000 ～ 1 600lx,培养室的温度控制在
22 ～ 24℃,湿度为 60% ～ 70%。
2　结果与分析
2.1　胚乳对离体胚萌发的影响
从东北刺人参离体胚培养的结果(表 1)可以看出 ,无论是裂口种子还是未裂口种子 ,只要是带胚乳的其种胚
在不同激素浓度的培养基上进行培养 ,离体萌发率均为 0 ,即不能萌发;而在去除胚乳后(除胚未分化完全之外)
在不同浓度的培养基上进行培养 ,其萌发率均为 100%,即完全萌发。这说明胚乳是离体培养条件下胚不能萌发
的限制因素 ,当胚生长发育到一定程度后 ,只要有胚乳存在 ,离体胚的萌发就会受到限制 ,去除胚乳则种胚能够顺
利萌发 。
2.2　胚的发育状况对离体胚萌发的影响
由表 1可见 ,当胚已充满胚腔(种子已裂口)或胚已完成分化时 ,去除胚乳后进行离体胚培养 ,在不同激素浓
度的培养基上 ,胚的萌发率均为 100%,但胚尚未分化完全时 ,去除胚乳后离体胚的萌发率为 0。这表明 ,种子胚
在尚未分化完全时处于休眠状态 ,不能萌发 ,当胚完成分化以后 ,胚本身不是休眠的 ,在适宜的离体条件下不加激
素也能正常萌发 。另外 ,从离体胚培养时的萌发状况(表 2)可见 ,无论在哪种激素浓度下 ,当胚已充满胚腔时 ,接
种后子叶 、胚轴和胚的生长变化都比胚未充满胚腔时要快 ,而且胚体积越大的萌发越快 ,这说明胚发育越接近成
熟其萌发力越强 。
表 1　东北刺人参胚培养的萌发率(%)
材料 2ip浓度(μM/L)
0 1 10
裂口种子 无胚乳 100 100 100带胚乳 0 0 0
未裂口种子
无胚乳(胚已分化完全) 100 100 100
无胚乳(胚未分化完全) 0 0 0
带胚乳 0 0 0
2.3　激素浓度对离体胚萌发的影响
虽然完成分化的种胚在不同激素浓度的
培养基上都能够萌发 ,但从东北刺人参离体
胚的萌发状况(表 2)可见 ,无论是裂口种子
还是未裂口种子 ,其离体胚在不同激素浓度
的培养基上表现均不同。在未添加激素的培
养基上 ,胚虽然可以萌发 ,但其萌发的速度较
慢 ,萌发力弱 。在激素浓度为 17μM/L的培养基上 ,胚的萌发速度较未添加激素培养基上的要快 ,但不如激素浓
度为 10μM/L培养基上的快。即在一定范围内 ,随着激素浓度的提高 ,离体胚的萌发速度加快 ,萌发力增强。这
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说明在一定的范围内 ,外源激素对东北刺人参种胚萌发有促进作用 。
表 2　东北刺人参离体胚培养萌发状况
2ip浓度
(μM/L)
材　　料
裂口种子(胚已充满胚腔) 未裂口种子(胚已完成分化 ,但未充满胚腔)
0
接种 1天后子叶全变绿 ,胚轴无变化;2天后胚轴弯曲 ,
胚有所生长。
接种 1天后部分子叶变绿 , 3天后胚轴弯曲 ,
胚有所生长。
1 接种 1天后子叶全变绿 ,部分胚轴弯曲 ,部分胚有所生长。 接种 1天后子叶变绿 , 2天后部分胚轴弯曲 ,部分胚有所生长。
10 接种 1天后子叶全变绿 ,胚轴全弯曲 ,胚都有所生长。 接种 1天后子叶变绿 ,胚轴无变化;
2天后胚轴弯曲 ,胚有所生长。
3　结论与讨论
东北刺人参种子离体培养时 ,形态已分化完全的胚在脱离胚乳的环境下能够正常萌发 ,由于胚乳的存在 ,即
使种胚已经完成了形态后熟 ,胚仍然不能萌发 。这说明胚乳在种子休眠中起着重要的作用 。对于裂口种子 ,不存
在透水性 、透气性问题 ,也不存在覆被物(种皮或胚乳)的机械阻碍问题 。另外的研究 [ 15]结果表明 ,东北刺人参种
皮和胚乳中均存在萌发抑制物质 ,且胚乳中抑制物质的抑制作用更强。由此可以说明 ,胚乳中存在萌发抑制物与
东北刺人参种子的深休眠有密切关系 ,胚乳中抑制物的存在也是造成离体胚萌发受到抑制的主要原因 。赵沛基
等 [ 16]对云南红豆杉离体胚培养结果表明 ,不带胚乳培养 ,胚的萌发率极低 ,而带胚乳培养时胚的萌发率大大提
高 。这与我们的结论恰恰相反。黄玉国 [ 17]对刺楸种子胚休眠的研究发现 ,胚乳的抑制作用与抑制物质有密切关
系 ,只经过暖温处理的胚乳能抑制胚的萌发 ,经过先暖温后低温处理的胚乳 ,对胚生长无任何抑制作用 ,相反还有
一定的促进作用 。看来胚乳对离体胚萌发的作用因种子休眠原因和休眠程度而异。对于非胚乳存在抑制物质引
起休眠的种子 ,在胚离体培养时 ,由于胚乳能够提供给胚生长所必需的营养和激素 ,所以促进了胚的萌发和生长。
对于胚乳中抑制物质与休眠密切相关的种子 ,当其休眠尚未解除时 ,胚乳中的抑制物对离体胚的萌发起抑制作
用;当种子已解除休眠时 ,胚乳则能够提供给胚营养和激素 ,从而促进胚的萌发和生长 。
东北刺人参种子胚在尚未分化完全时处于休眠状态 ,在离体条件下也不能萌发 ,当胚完成分化以后 ,胚本身
不是休眠的 ,在适宜的离体条件下能正常萌发 ,而且胚发育越接近成熟其萌发力就越强。由于种子成熟时胚尚未
分化完全 ,需要经历很长时间的暖温过程才能完成形态成熟 ,而且不同种子完成形态成熟的时间也有很大差异 ,
这就导致东北刺人参种子在很长时间内保持深休眠的状态 ,再加上胚发育的不同步性 ,又导致催芽结束后种子发
芽率极低 ,且发芽不整齐。因此应设法采取有效措施促进胚的发育趋于一致 ,在暖温处理结束后使绝大部分种子
的胚都完成形态成熟 ,以期在低温处理结束后获得较高的发芽率和整齐一致的发芽效果。
东北刺人参种子在完成形态成熟后仍然不能萌发 ,还需要经过一段时间的低温来解除生理后熟 。需要低温
后熟解除休眠的种子多数有内源激素的平衡和消长变化 ,激素的平衡由抑制占优势向刺激占优势的变化是打破
休眠的决定因素 [ 18] 。东北刺人参离体胚萌发试验表明 ,在一定的范围内 ,外源激素对离体胚萌发有促进作用。
这在一定程度上也反映出东北刺人参种子休眠的解除与种子内激素之间相互作用的状态有关 ,且外源激素对促
进种子解除休眠有一定的作用 。有关外源激素促进种子解除休眠的报道很多 ,据目前研究成果 ,能有效解除种子
休眠的植物激素有:赤霉素 、激动素 、乙烯利 、壳梭孢素 、吲哚乙酸等 。可以通过外源激素处理东北刺人参种子试
验 ,进一步探索植物激素对缩短种子休眠时间 、促进种子萌发的作用和机理 。
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