全 文 :第27卷第2期
2 0 1 2年6月
河 北 林 果 研 究
HEBEI JOURNAL OF FORESTRY AND ORCHARD RESEARCH
Vol.27No.2
Jun.2 0 1 2
文章编号:1007-4961(2012)02-0157 -04
山杏叶桦木酸、齐墩果酸和熊果酸的研究
彭艳芳,李 洁,李 旺,杜继昱,于文清
(河北民族师范学院 生物系,河北 承德067000)
摘要:我国山杏资源十分丰富,是绿化荒山的优良树种。采用 HydersirBDS C18色谱柱(150×4.6mm,
5μm),流动相体积比为90∶10的0.3‰硫酸甲醇溶液-3‰硫酸水溶液,检测波长210nm,建立了山杏叶中
三萜酸测定的高效液相色谱法。结果表明:桦木酸、齐墩果酸与熊果酸的浓度在30~2 000μg/mL(r桦=
0.997 1,r齐=0.998 6,r熊=0.997 8)范围内与色谱峰面积呈良好线性关系;平均加标回收率分别为99.9%、
101.1%和98.9%。以山杏叶为材料,采用高效液相色谱法和紫外可见分光光度法分别对山杏叶中的三萜酸
成分进行分析,结果表明,山杏叶富含三萜酸,落叶期山杏叶中总三萜酸(17 078μg/g)、桦木酸(1 842μg/g)、
齐墩果酸(2 536μg/g)和熊果酸(5 706μg/g)含量均高于非落叶期。本研究首次建立了山杏叶中桦木酸、齐
墩果酸和熊果酸同时测定的反向高效液相色谱法(HPLC),发现落叶期山杏叶富含三萜酸,为山杏叶综合开
发利用提供了基础数据。
关键词:山杏叶;HPLC;总三萜酸;桦木酸;齐墩果酸;熊果酸
中图分类号:S 662.2 文献标志码:A
Study on the betulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid in
leaf of Prunus sibirica L.
PENG Yan-fang,LI Jie,LI Wang,DU Ji-yu,YU Wen-qing
(Department of Biology,Hebei Teachers College for Nationalities,Chengde 067000,China)
Abstract:Prunus sibirica L.germplasm resources is abundant in China.Prunus sibirica L.
tree is an excelent tree for greening barren hils.A RP-HPLC method for determination of
betulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid in Prunus sibirica L.leaf was established.A
Hydersir BDS C18column(150×4.6mm,5μm)was used with Methanol:H2O:H2SO4
(90:10:0.3‰)as the mobile phase,and UV-detection wavelength was set at 210nm.The
linear range was 30~2 000μg/mL(rb=0.997 1,ro=0.998 6,ru=0.997 8)for betulinic
acid,oleanolic acid and ursolic acid,respectively.The average recoveries(n=5)were 99.9%,
101.1%and 98.9%,respectively.The methods of high-performance liquid chromatography
and ultraviolet and visible spectrophotometry were used to analyze the triterpenoid acid com-
position in the Prunus sibirica L.leaves in this study.The results show that Prunus sibirica
L.leaf is rich in triterpenoid acid,and the total triterpenoid acid(17 078μg/g),betulinic
acid(1 842μg/g),oleanolic acid(2 536μg/g)and ursolic acid(5 706μg/g)respectively
收稿日期:2012-02-29;修改稿收期:2012-05-09
作者简介:彭艳芳(1975-),女,河北承德人,副教授,主要从事植物资源和天然产物研究。
通迅作者:李 洁(1962-),女,河北承德人,教授,主要从事植物资源和生物化学方向研究。
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higher in abscissionperiod leaf than in non-abscissionperiod leaf.The method of HPLC anal-
ysis for betulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid in Prunus sibirica L.leaf is established
firstly,and the triterpenoid acid is the highest in the abscissionperiod leaf.Which provides
some evidences for the reasonably exploitationand utilization.
Key words:Prunus sibirica L.leaf;HPLC;total triterpenoid;betulinic acid;oleanolic acid;
ursolic acid
山杏(Prunus sibirica)属蔷薇科(Rosaceae)杏
属(Armeniaca),分布在华北、华南、塞北等地。灌
木或小乔木,高2~5m,叶卵形或近圆形,长(3-)5
~10cm,宽(2.5-)4~7cm。花单生,直径1.5~2
cm;萼片长圆状椭圆形,先端尖;花瓣近圆形或倒卵
形,白色或粉红色。果实扁球形,直径1.5~2.5
cm,两侧扁,果肉薄而干燥,熟时开裂,味酸涩,不能
吃。核易与果肉分离,基部一侧不对称,平滑。花期
3-4月,果期6-7月。其种子为传统中药苦杏仁;
其叶片在农村多用来喂猪,猪食用后表现为不易得
病,生长快。已有文献对苦杏仁的营养成分进行了
研究,但对山杏叶的营养成分研究尚未见报道。本
试验对山杏叶中的桦木酸、齐墩果酸和熊果酸进行
了研究,以期为山杏叶的综合开发利用提供依据。
1 材料与方法
试验于2010-2011年进行,试验用山杏叶采自
河北省承德市,金丝小枣全红果采自河北省保定市。
1.1 样品采集与处理
选择6棵生长势中庸的野生杏树,分别从东南
西北4个不同的方向各采摘约50g山杏叶,装进冰
盒带回试验室。将山杏叶样品均匀铺在鼓风干燥箱
中,先于105℃杀青5min,然后再于60℃烘干,粉
粹,过30目筛。取1g山杏叶样品加10mL甲醇超
声提取1h,过滤,滤渣再重复提取2次,合并滤液,
待测。金丝小枣枣果样品采集与处理同山杏叶。
1.2 仪器和设备
高效 液 相 色 谱 仪 为 Waters 1525 (Binary
HPLC Pump)、Waters 2487(DualλAbosorbance De-
tector)及Breeze色谱工作站等部分组成。色谱柱为
Hydersir BDS C18(250mm×4.6mm,5μm)。
紫外可见分光光度仪为北京普析T6新世纪。
1.3 试验方法
山杏叶、金丝小枣枣果总三萜含量测定采用紫
外可见分光光度法[1]。
2 试验结果与分析
2.1 山杏叶桦木酸、齐墩果酸、熊果酸反向高效液
相色谱法的建立
2.1.1 检测波长的选择 在190~600nm范围内
对桦木酸、齐墩果酸和熊果酸标准品溶液的紫外吸
收波长扫描,可知它们的最大吸收波长均在紫外吸收
区。桦木酸、齐墩果酸和熊果酸标准品的最大吸收波
长分别为208.50nm、212.00nm和211.00nm,三者
综合考虑,本试验选择210nm作为检测波长。
2.1.2 流动相的选择 根据已有资料表明检测三萜
酸的流动相主要采用乙腈∶水∶酸或者甲醇∶水∶酸。
试验结果表明流动相甲醇-水比乙腈-水的分离结果好,
甲醇∶水(90∶10)时基本上能把桦木酸、奇墩果酸、
熊果酸三者分开。
2.1.3 酸的选择 由于被分析组分呈弱酸性,在中
性流动相中三萜酸可电离,从而使保留时间缩短,且
有脱尾现象,使分离效果变差。用磷酸调节流动相
的pH值,使其pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、
5.5时观察试验结果,pH值在3~4范围内分离效
果较好。
2.1.4 流速的选择 流速分别选择0.4mL/min、
0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min。结果表明,
流速为0.6mL/min时分离效果最好。
2.1.5 方法精密度检测 取山杏叶样品,重复取样
平行分析5次,RSD分别为3.84%、3.369%和3.86%。
2.1.6 加标回收率分析 取山杏叶样品重复测定
桦木酸、齐墩果酸和熊果酸的含量(n=5),同时再作
加标样品分析(n=5),加标水平为200μg/g干重。
统计分析结果表明,计算加标回收率分别为99.9%、
101.1%和98.9%,说明方法准确可靠。
2.1.7 桦木酸、齐墩果酸和熊果酸含量标准曲线
配制不同浓度的标准液,以进样量(μg/mL)为横坐
标,峰面积(mV·s)为纵坐标,计算回归方程的回归
系数及截距,并以3倍信/噪比时的进样量估计最低
检出限。在进样量30~2 000μg/mL范围内求得
第2期 彭艳芳等:山杏叶桦木酸、齐墩果酸和熊果酸的研究 159
桦木酸、齐墩果酸与熊果酸的线性回归方程分别为:
Y桦=946.44 X-119 782;Y齐=1 007.8 X-57 928;
Y熊=872.74 X+83 321,线性相关系数分别为
r桦=0.997 1,r齐=0.998 6,r熊=0.997 8以此绘制
标准曲线。
本研究建立了同步测定山杏叶中桦木酸、齐墩
果酸、熊果酸的反相高效液相色谱方法,在此条件下
三者得到了良好分离(图1,图2)。
图1 桦木酸、齐墩果酸、熊果酸色谱图
Fig.1 Betulic acid,oleanolic acid and ursolic acid chromatographical graph
图2 山杏叶桦木酸、齐墩果酸、熊果酸色谱图
Fig.2 Betulic acid,oleanolic acid and ursolic acid chromatographical graph in Prunus sibirica L.leaf
注:1桦木酸;2齐墩果酸;3熊果酸。
2.2 山杏叶不同时期三萜酸含量分析
山杏叶不同时期三萜酸含量见图3。由图3可
以看出,山杏叶中桦木酸、熊果酸和齐墩果酸含量均
较高。山杏叶生长周期中熊果酸含量呈直线上升趋
势,桦木酸含量呈高-低-高变化趋势;齐墩果酸含
量呈缓慢上升趋势。熊果酸含量落叶期(10月份)
最高,含量为5 706μg/g。齐墩果酸和桦木酸含量
也为落叶期(10月份)最高,含量分别为2 536μg/g、
1 842μg/g。不同时期山杏叶中熊果酸含量始终保
持最高,其次为齐墩果酸,再次为桦木酸。
图3 不同时期山杏叶桦木酸、齐墩果酸和熊果酸含量
Fig.3 Triterpenoid acid content of different
growth phrase in Prunus sibirica L.leaf
注:幼叶期杏叶(05-10);山杏成熟期杏叶(06-28);落叶期杏叶(10-10)。
由图4可知,山杏叶中总三萜酸含量呈直线上
升趋势,落叶期(10月份)山杏叶中总三萜酸含量最
高,为17 078μg/g。
落叶期山杏叶中总三萜酸含量最高,而落叶期
山杏叶桦木酸含量+齐墩果酸含量+熊果酸含量=
1 842μg/g+2 536μg/g+5 606μg/g=9 984μg/g,说
明山杏叶中三萜酸的种类不止桦木酸、齐墩果酸和熊
果酸,还含有其他种类的三萜酸,这有待进一步研究。
图4 山杏叶不同时期总三萜酸含量
Fig.4 Total triterpenoid acid content of different
growth phrase in Prunus sibirica L.leaf
注:幼叶期杏叶(05-10);山杏成熟期杏叶(06-28);落叶期杏叶(10-10)。
3 结论与讨论
3.1 山杏叶与金丝小枣枣果三萜酸含量的比较
枣树是我国特有的有着诸多独特性的民族果
树,金丝小枣是红枣的一种,含有丰富的营养价值。
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有句谚语“一日吃仨枣,终年不见老”,可见其营养价
值。枣的药理作用极其广泛,中医认为:枣性平味
甘,补脾和胃,益气生津,调营养,解药毒,有保护肝
脏、增加肌力、驻颜防衰、抗癌之功效。现代医学表
明:红枣对气血不足、贫血、肺虚、咳嗽、神经衰弱、失
眠、高血压、败血症和过敏性紫癫等均有很好的疗
效,是被国内外医药界极为重视的营养滋补剂。研
究表明:富含桦木酸的枣提取物可有效地抑制肿瘤
细胞中蛋白激酶C的活性,同时还可通过增加游离
核小体、减量调节抗凋亡蛋白bcl-2,致使肿瘤细胞
凋亡;以及抑制血管内生长因子或成纤维细胞生长
因子阻止血管生成,从而抑制肿瘤细胞的增殖[2]。
为了探讨山杏叶的有效生物活性成分及作用机
理,以金丝小枣为对照物,对山杏叶和金丝小枣枣果
的三萜酸进行了比较分析。由图5可见,山杏叶和
金丝小枣枣果均含有桦木酸、齐墩果酸和熊果酸,且
山杏叶中总三萜酸、桦木酸、齐墩果酸和熊果酸的含
量均显著高于金丝小枣枣果,分别是金丝小枣枣果
的2.4倍、3.9倍、9.9倍和9.6倍;而山杏叶是未被
开发的废弃物,如果用于在抗癌药物研制,将更具优
势,有着广阔的开发前景。
图5 山杏叶、金丝小枣果三萜酸含量
Fig.5 Triterpenoid acid content in Prunus sibirica L.leaf
and in Ziziphus Jujuba MILL.‘Jinsixiaozao’leaf
3.2 山杏叶具有较大的开发利用价值
我国山杏资源丰富,分布广泛,据调查,全国山
杏有142.78万hm2,河北省有43.72万hm2,承德市
有20万hm2,资料表明,仅承德市山杏资源就占全
国总资源的七分之一。山杏种子苦杏仁几千年来即
可食用又可药用,目前杏壳也已经被开发利用。只
有山杏叶尚无开发利用。每逢秋天,进入落叶期的
山杏叶,在完成了为山杏树及果实提供营养以及为
来年贮备营养的使命后变作为废弃物丢弃,造成极
大浪费。
研究结果表明,山杏叶中含有桦木酸、齐墩果酸
和熊果酸等三萜酸活性成分,含量明显高于金丝小
枣。而处于落叶期的山杏叶总三萜酸含量最高,其
中熊果酸含量几乎达到金丝小枣总三萜酸的78%。
研究显示,五环三萜类化合物是许多中草药的主要
有效成分,具有抗肿瘤、抗 HIV、抗菌等多种生物活
性[3]。目前,熊果酸被称为功能性食品因子,日本等
国家已将其作为天然抗氧化剂应用于食品中[4]。我
们以发酵的山杏叶为添加剂在蛋鸡、肉鸡饲料中应
用,发现少量山杏叶发酵物就能提高家禽的抗病能
力,促进生长,提高生产性能(文章待发),说明不会
是山杏叶中的蛋白质、糖等成分的作用,推测可能是
其中三萜酸等生物活性物质的作用。由此推断,山
杏叶能促进猪生长的原因也可能是通过三萜酸激发
调动牲畜机体内抗菌因子,调节机体免疫系统功能,
增强免疫力的,具体机理尚需进一步研究。
总之,山杏叶含有丰富的生物活性物质,是开发
药品、保健品和无公害饲料添加剂的尚好原料,极具
开发价值。
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(编辑 杨建肖)