全 文 ：江 海 ,曹小勇 ,吴三桥 ,等.红花石蒜和黄花石蒜中加兰他敏含量分析比较 [ J] .江苏农业科学, 2011, 39(3):432-434.
红花石蒜和黄花石蒜中加兰他敏含量分析比较
江 海 1, 2 , 曹小勇 2 , 吴三桥 1 , 李新生2 , 石少福 2 , 陈玉玲 3
(1.陕西省资源生物重点实验室 ,陕西汉中 723000;2.陕西理工学院生物科学与工程学院 ,陕西汉中 723000;
3.陕西略阳县质量技术监督局 ,陕西略阳 724300)
摘要:分别采用微波和超声提取石蒜中加兰他敏 ,高效液相色谱检测其中加兰他敏含量 , 利用单因素方差分析比
较石蒜中加兰他敏含量的差异。采用微波提取和超声提取红花石蒜中加兰他敏含量分别为 0.248 mg/g和
0.274 mg/g。采用微波提取和超声提取黄花石蒜中加兰他敏含量分别为 0.249 mg/g和 0.282 mg/g。 红花石蒜和黄花
石蒜中的加兰他敏的含量无明显差异 , 利用超声处理对石蒜中加兰他敏含量有增强作用。
关键词:石蒜;加兰他敏;微波提取;超声提取;高效液相
中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2011)03-0432-03
收稿日期:2010-07-19
基金项目:陕西理工学院资助项目(编号:SLGJD0802)。
作者简介:江 海(1977—),男 ,四川西昌人 ,硕士 ,实验师 ,研究方向
为生物资源开发利用。 E-mail:jianghai0318@ 163.com。
石蒜(Lycorisradiata)别称老鸦蒜 、龙爪花 ,属于石蒜科石
蒜属 [1 ] ,为一种具鳞茎的花卉植物 ,广布于中国长江流域以
南各省区 。多年生草本 ,叶带状 ,深绿色带白霜粉 ,该属植物
喜生于林缘 、河岸阴湿处 ,花朵色泽鲜艳 ,品种众多 ,有红花 、
粉红花 、黄花 、淡红紫色 、百合型 、白长筒型等 [ 2 ] ,形态别致 ,
具有良好的观赏价值 。全草含石蒜碱 、加兰他敏等 。
石蒜属植物大多有重要的药用价值 。其鳞茎均含有石蒜
碱 、伪石蒜碱 、多花水仙碱 、高石蒜碱 、石蒜裂碱 、雨石蒜碱 、去
甲基雨石蒜碱 、去甲基高石蒜碱 、表雪花莲胺碱 、石蒜西定醇 、
石蒜西定等十余种生物碱 [ 3] ,具有祛风消肿 、解毒抗癌功效 。
大多数种类的鳞茎中还含有加兰他敏 [ 4 -5] 、力可拉敏 ,是治疗
小儿麻痹后遗症和老年痴呆症的重要药物 [ 6 -7] 。石蒜中加兰
他敏具有多种功效 ,目前主要采用分光光度法 [ 8 ] 、荧光分光
光度法 [ 9] 、薄层扫描法及 HPLC[ 10 -13 ]测定石蒜中加兰他敏
含量 。
陕西汉中是石蒜的适生地之一 ,石蒜作为一种民间药材
使用 ,已有悠久的历史 。本研究采用高效液相色谱法 [ 14 -16 ]对
汉中 2个石蒜代表品种中加兰他敏含量进行测定 ,旨在为汉
中地区开发利用这一生物资源提供依据 。
1 材料
1.1 仪器
高效液相色谱仪 Agilent1100(安捷伦科技有限公司 );
SK-120E超声波清洗机 (宁波科生仪器有限公司 );
G80D23YS2-Q6微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司);水
浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司);TD24-低速台式离心机
(长沙湘仪器有限公司);TTL-10A超纯水器(北京同泰联科
技发展公司);FA2004N万分之一电子天平(山海分析仪器公
司);AUW200D十万分之一电子天平(岛津公司)。
1.2 试剂
甲醇 、氯仿 、磷酸 、氨水为分析纯;乙腈为色谱纯;超纯水;
加兰他敏对照品(纯度为 99.8%, SIGMA公司)。
1.3 材料
红花石蒜和黄花石蒜样品于 2008年 8月采于陕西省西
乡县 ,经烘箱 80℃烘干 ,粉粹 ,过 60目分样筛 ,备用 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为 EclipseXDB-C18柱 (4.6 mm×150 mm,
5 μm);检测波长:289 nm;流动相:乙腈与 0.2%磷酸水溶液
混合液 , 梯度洗脱 , 0.2%磷酸溶液梯度为:0 min(98%)
-9min(80%)-12 min(78%)-15 min(98%);流速:
1 mL/min;柱温:25 ℃。
2.2 标准品溶液的制备
精确称取 5.0mg加兰他敏对照品 ,用超纯水溶解 ,定容
于 10mL容量瓶中 。制得加兰他敏对照品 0.5 mg/mL的标准
对照母液 。
2.3 线性范围考察
精确吸取加兰他敏对照品溶液对照母液 0.25、0.5、
0.75、1.0、1.25 mL用超纯水定容至 5.0 mL容量瓶 ,得到加
兰他敏浓度梯度为 25.0、50.0、75.0、100.0、125.0 μg/mL对
照品溶液 。经 0.45 μm微孔滤膜滤过 ,按色谱条件依次精确
进样 10 μL在高效液相色谱仪中测定各溶液峰面积 ,结果见
图 1。以进样量为横坐标 ,对照品峰面积为纵坐标 ,拟合绘制
标准曲线 , 其线性回归方程为:y=46.2x+296.9 , r=
0.999 81 ,表明加兰他敏在 0.25 ～ 1.25 μg范围内线性关系
良好 。
2.4 供试样品制备
2.4.1 微波提取法 称取干燥石蒜粉末 2 g于 80 mL烧杯
中 ,加入 25mL甲醇 ,在常压下进行微波提取 [ 17] 。每次微波
处理 30 s后取出用冷水冷至室温后重新进行微波提取 ,重复
操作直至累计提取时间达 15 min。待提取液冷至室温后 ,在
离心机上以 4 000r/min速度离心 5 min,取上清液于 50 ℃水
浴蒸干 ,残渣用 0.5 mol/L盐酸溶解 ,再次离心 ,上清液用氨
水调 pH值为 10 ,然后用氯仿萃取 3次 ,每次 10mL,合并氯仿
液 , 50℃水浴蒸干 ,残渣用 5 mL超纯水溶解 ,取出 3 mL用超
纯水定容于 5mL容量瓶中 。将定容好的样品过 0.45 μm的
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微孔滤膜后在试验设定的色谱条件下 ,取供试样品 10 μL进
样测定 。测定结果见图 2。
2.4.2 超声波提取法 称取干燥石蒜粉末 2g于 80 mL烧
杯中 ,加入 25mL甲醇 ,在常压下进行超声波提取 。每次超声
提取 5 min,提 3次 ,共 15 min,频率 90 Hz。在离心机上以
4 000 r/min速度离心 5 min,取上清液于 50 ℃水浴蒸干 ,残渣
用 0.5 mol/L盐酸溶解 ,再次离心 ,上清液用氨水调 pH值 =
10 ,然后用氯仿萃取 3次 ,每次 10mL,合并氯仿液 , 50 ℃水浴
蒸干 ,残渣用 5mL超纯水溶解 ,并取出 3 mL用超纯水定容于
5 mL容量瓶中。将定容好的样品过 0.45 μm的微孔滤膜后
在试验设定的色谱条件下 ,取供试样品 10μL进样测定 。
2.5 精确度试验
精确吸取上述供试样品溶液 10 μL,连续进样 5次 ,测定
加兰他敏峰面积 ,得结果分别为 4 907、4 951、4 946、4 915、
4 988 , RSD值为 0.65%(n=5)。
2.6 稳定性试验
精确吸取上述供试样品溶液 10 μL,分别在 2、4、8、24、
48 h进样测定加兰他敏的峰面积 , RSD值为 1.08%(n=5)。
结果表明供试品溶液中的加兰他敏在 48 h内稳定 。
2.7 重复性试验
取同一材料 ,按供试品溶液的制备方法平行制备 5份 ,依
法测定加兰他敏的峰面积 , RSD值为 1.48%(n=5)。
2.8 回收率试验
精确称取已知加兰他敏含量的石蒜样品 5份 , 每份
1.0g,加入 25 μg/mL的加兰他敏标准对照品 1mL,按 “2.4”
样品溶液制备的方法操作并在色谱设定条件下进行检测 。
微波处理测定结果见表 1 ,得加兰他敏的平均回收率为
表 1 微波处理样品加兰他敏回收率测定结果
样品号 测得量(μg/mL)
回收率
(%)
RSD(n=5)
(%)
1 91.1 100.8
2 90.85 99.76
3 90.98 100.3
4 91.0 100.4
5 90.95 100.2
平均 100.3 0.37
注:石蒜样品的加兰他敏含量为 65.91 μg/g,每份 1.0 g, 加入
25μg/mL加兰他敏标准对照品 1mL。
100.3%, RSD值为 0.37%(n=5)。
超声波处理测定结果见表 2,得加兰他敏的平均回收率
为 100.4%, RSD值为 4.19%(n=5)。
表 2 超声波处理样品加兰他敏回收率测定结果
样品号 测得量(μg/mL)
回收率
(%)
RSD(n=5)
(%)
1 91.8 103.5
2 90.5 98.36
3 92.1 104.8
4 89.5 94.36
5 91.2 101.2
平均 100.4 4.19
注:石蒜样品的加兰他敏含量为 65.91 μg/g,每份 1.0 g, 加入
25μg/mL加兰他敏标准对照品 1mL。
2.9 样品材料测定结果
按微波供试液制备方法及色谱条件分别提取和测定 3个
批次的红花石蒜和黄花石蒜样品 ,每批分别测定 5次 ,利用外
标法测定样品中加兰他敏的含量 ,结果见表 3。
表 3 微波处理样品材料测定结果(n=5)
石蒜
名称
样品
批号
加兰他敏含量
(mg/g)
RSD
(%)
红花石蒜 1 0.248
2 0.259
3 0.236
平均 4.61
黄花石蒜 1 0.254
2 0.252
3 0.242
平均 2.57
对微波处理供试样品测得数据进行单因素方差分析 ,结
果见表 4。
表 4 微波处理供试样品检测结果方差分析
差异源 SS df MS F P值 F0.05
组间 4.17×10-6 1 4.17×10-6 0.048 0.837 3 7.709
组内 0.000 347 4 8.68×10-5
总计 0.000 352 5
由 F=0.048
按超声供试液制备方法及色谱条件分别提取和测定 3个
—433—江 海等:红花石蒜和黄花石蒜中加兰他敏含量分析比较
批次的红花石蒜和黄花石蒜样品 ,每批分别测定 5次 ,利用外
标法测定样品中加兰他敏的含量 ,结果见表 5。
表 5 超声处理样品材料测定结果(n=5)
石蒜样品 批号 加兰他敏含量(mg/g)
RSD
(%)
红花石蒜 1 0.275
2 0.265
3 0.281
平均 2.95
黄花石蒜 1 0.285
2 0.272
3 0.289
平均 3.15
对超声处理供试样品测得数据进行单因素方差分析 ,结
果见表 6。
表 6 超声处理供试样品检测结果单因素方差分析
差异源 SS df MS F P值 F0.05
组间 0.000 104 1 0.000 104 1.443 0.295 9 7.709
组内 0.000 289 4 7.22×10-5
总计 0.000 393 5
由 F=1.443
花石蒜和黄花石蒜样品中的加兰他敏含量无明显区别 。
2.10 微波提取与超声提取比较
因为红花石蒜和黄花石蒜样品中的加兰他敏含量无明显
区别 ,将所得到的数据进行微波提取与超声提取单因素方差
分析 ,结果见表 7。
表 7 微波提取与超声波提取加兰他敏方差分析
差异源 SS df MS F P值 F0.01
组间 0.002 581 1 0.002 581 34.69＊＊ 0.000 15 10.04
组内 0.000 744 10 7.44×10-5
总计 0.003 326 11
由 F=34.68>F0.01 =10.04得 ,采用微波处理样品与采
用超声处理样品 ,加兰他敏测定含量差异极显著 ,采用超声处
理对含量测定有增强效果 。
3 结论与讨论
在加兰他敏的提取检测过程中 ,超声提取对石蒜中加兰
他敏的提取效果优于使用微波对加兰他敏的提取 。其原因可
能是超声提取过程中水由于高频振荡 ,温度升高 ,再通过振荡
也对溶液和样品有振摇的作用 ,温度和振荡共同作用 ,优于用
微波炉的单纯加热提取 。回收率测定结果可以看出采用微波
提取的测定结果相对标准偏差较小 ,重复性好。采用超声提
取的测定结果相对标准偏差较大 ,达到 4.19%,重复性略差 ,
也满足样品分析标准 。但综合考虑操作过程的繁杂程度 ,采
用超声提取效率更高 。该 3批样品测定结果显示红花石蒜和
黄花石蒜在不同处理方法下 ,加兰他敏含量无明显区别 。该
3批样品采集于同一生境 ,加兰他敏含量是与品种关系密切
还是与环境关系密切 ,还需进一步研究 。从样品色谱图上可
以看出 ,在该处理 ,检测色谱条件下 ,石蒜样品分离度很好 ,能
出很多色谱峰 ,除加兰他敏被标识外 ,其他色谱峰分别是何种
组分 ,还需进一步验证 。
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