全 文 :第36卷第3期 西 南 大 学 学 报 (自然科学版) 2014年3月
Vol.36 No.3 Journal of Southwest University(Natural Science Edition) Mar. 2014
文章编号:1673-9868(2014)3-0034-08
葱兰和韭兰花色色素种类和质量分数的研究
①
董 博, 刘 雪, 付 春,
陆俊杏, 王通明, 柴友荣
西南大学 农学与生物科技学院;南方山地农业教育部工程研究中心;
重庆市作物品质改良重点实验室;重庆400715
摘要:葱兰和韭兰背景性状相似,但花色一白一红,是园林绿化常用的一对姊妹花,有必要对其花色成分类型和
色差原因进行研究.该研究提取了葱兰和韭兰的花瓣色素,用特征颜色反应法、紫外-可见分光光度计法和薄层
色谱法进行了鉴定.结果表明:葱兰花瓣色素主要为黄酮类的木犀草素,不含花青素;韭兰花瓣色素既含有黄酮
类的木犀草素和另一种迁移率大的未知黄酮类成分,还含有花青素类的锦葵色素.韭兰花瓣中总类黄酮质量分
数为9.505mg/g,其中花青素(苷)的质量分数为1.375mg/g,葱兰花瓣总类黄酮质量分数为5.21mg/g.韭兰
的红色花色源于其比葱兰多出的锦葵色素或其糖苷.该结果将深入解析韭兰和葱兰花色物质的结构和生物合成途
径、克隆其相关功能基因和开展花色分子育种.
关 键 词:葱兰;韭兰;花色色素;种类;含量
中图分类号:Q949.71+8.25 文献标志码:A
葱兰Zephyranthes candida 别名葱莲、玉帘、白花菖蒲莲、韭菜莲、肝风草,韭兰Zephyranthes
grandiflora别名韭菜兰、红菖蒲莲、红菖蒲、假番红花、赛番红花,二者都原产南美洲,都是石蒜科Ama-
ryllidaceae葱帘属Zephyranthes Herb多年生球茎草本花卉.它们呈鳞茎卵状,叶数枚,线形,簇生,花茎
纤细,中空,花单生于花茎顶端,花漏斗状,花被片6,各片近等长,雄蕊6,花柱细长[1].葱兰和韭兰因为
花大(花被直径7.5~9.0cm),色泽艳丽,花期长,是受人喜爱的观赏植物,世界各国均引种栽培.二者叶
丛碧绿,闪烁着洁白和粉红色的花朵,美丽幽雅,适用于林下、边缘或半荫处作园林地被植物,也可作花
坛、花径的镶边材料,在草坪中成丛散植,可组成缀花草坪,饶有野趣,也可盆栽供室内观赏[2].
作为园林应用广泛的两种花卉,二者具亲缘关系,形态习性相近,栽培方法相同,是不折不扣的姐妹
花[3].自然界花卉颜色种类繁多,但葱兰和韭兰却分别只有乳白色和粉红色,颜色过于单调.目前国内外
对葱兰和韭兰的研究主要集中在药理学[4-5]、病虫害防治[6-8]、繁殖技术[9]及园林应用[10]等方面,对其花
色成色机理的研究未见报道,其花色分子育种更是无从开展.为了使葱兰和韭兰在园林景观中得到更好的
应用,本文首次以葱兰和韭兰的花瓣为研究材料,对其花色成色色素进行分析,确定决定其花色的因素,
为深入解析葱兰和韭兰花色的机理,进行分子育种提供参考.
① 收稿日期:2013-03-06
基金项目:重庆市科技攻关计划资助项目(CSTC2009AB1030);国家863计划专题课题资助项目(2006AA10Z110).
作者简介:董 博(1987-),男,陕西渭南人,硕士研究生,主要从事植物转基因工程研究.
通信作者:柴友荣,研究员,博士生导师.
1 材料与方法
1.1 试验材料
西南大学北区花园内种植的乳白色葱兰和粉红色韭兰,在盛花期,于晴天早晨露水刚干时取花瓣用于
试验.
槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素和异鼠李素标准品购自上海华壹生物科技有限公司;锦葵色素、矢
车菊素和飞燕草素购自Sigma公司;
1.2 葱兰和韭兰花色色素的定性鉴定和定量测定
1.2.1 色素化学成分的系统预试:特征颜色反应
称取0.100g花瓣,迅速用液氮研磨至粉末,分别加石油醚、10%盐酸和30%氨水约5mL提取,过
滤,观察滤液颜色并进行记录[11].
各取葱兰和韭兰花瓣0.100g,迅速用液氮研磨至粉末,分别用甲醇和盐酸化甲醇溶液(HCL∶MeOH
=1∶99,V/V)提取24h[12-13],过滤,定容至25mL,各取2mL提取液,进行下列显色反应[14-16].
1)浓盐酸-镁粉反应:加入镁粉少量,然后加入浓盐酸5滴,摇匀,静置1h.
2)浓盐酸-锌粉反应:加入锌粉少量,然后加入浓盐酸10滴,摇匀,静置1h.
3)醋酸铅反应:加1.0%Pb(CH3COO)·3H2O 2mL,摇匀,静置2h.
4)三氯化铁反应:加5.0%FeCl3·6H2O 2mL.
5)三氯化铝反应:加1.0% AlC13·6H2O甲醇溶液1mL.
6)浓硫酸反应:加1.5mL浓 H2SO4,摇匀,再置沸水浴5min.
7)四氢硼钠反应:加NaBH48mg,再加1.0% 盐酸2mL,摇匀,静置2h.
8)碱性试剂反应:加5% Na2CO33mL,摇匀,密闭静置30min,通空气10min.
9)氨性氯化锶反应:取甲醇10mL,加氨水定容至25mL,成为被氨气饱和的甲醇液;向样品液中加
入0.01mol/L SrC12.6H2O甲醇液10滴,再加被氨气饱和的甲醇液10滴,摇匀,静置1h.
10)硼酸反应:加1.0% H2C2O4·2H20 10滴,再加2.0% H3BO33mL.
1.2.2 花色素成分的紫外-可见光谱分析
(1)花瓣中的叶绿素检测
取花瓣0.100g,迅速用液氮研磨至粉末,用90%的丙酮∶乙醇(4∶1,v/v)提取,定容至10mL,用
紫外-可见分光光度计在200~700nm范围内扫描,比色皿光径为1cm[17].
(2)花瓣中的类胡萝卜素检测
取花瓣0.100g,迅速用液氮研磨至粉末,用石油醚∶丙酮(1∶1,V/V)提取,定容至10mL,
在200~700nm范围内扫描.
(3)花瓣中的类黄酮检测
取花瓣0.100g,迅速用液氮研磨至粉末,葱兰加盐酸化甲醇(pH=3)2mL置于4℃冰箱中提取
24h;韭兰加盐酸∶甲醇(1∶99,v/v)放在常温下避光提取24h,然后定容至10 mL,在220
~600nm范围内扫描[12,18].
(4)色素的紫外-可见光谱分析
取花瓣0.100g,迅速用液氮研磨至粉末,葱兰用盐酸化的甲醇提取,韭兰用含1%浓盐酸的甲醇提
取,定容至50mL,立刻在200~700nm范围内扫描.
1.2.3 葱兰和韭兰花色色素的薄层色谱
(1)色素萃取
53第3期 董 博,等:葱兰和韭兰花色色素种类和质量分数的研究
称量1.000g葱兰和韭兰花瓣,葱兰用40mL的甲醇萃取,韭兰分别用40mL 1%的甲醇盐酸(97mL
甲醇+3mL 36%盐酸)和甲醇萃取,4℃条件下萃取24h
(2)萃取物浓缩与水解
将萃取液过滤,放在100mL的异形瓶里,用旋转蒸发仪在真空条件下将萃取液蒸发,然后用1mL甲
醇溶解浓缩物,获得浓缩的萃取液.
萃取物的水解:取300μL浓缩萃取液,加300μL 2mol/L盐酸,90℃水解45min,冷却后加100μL
异戊醇,14 000r/min下离心3min后,上相中含有浓缩状态的花青素和其他类黄酮.
(3)薄层色谱法鉴定色素
① 色素分离.用玻璃毛细管线性点滴测试物质和标样到同一块硅胶G薄层板上,在薄层层析槽里进
行色谱分离.甲醇盐酸萃取物的展开剂为正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶2);甲醇萃取物的展开剂为甲苯∶甲
酸乙酯∶甲酸(10∶8∶1).② 色素鉴定.展开,取出,晾干,在正常光照条件下,通过薄层色谱分离后的距
离和标样进行对照,确定化合物种类.喷以1%三氯化铝乙醇溶液,在105℃加热5min,然后将层析后的
硅胶G薄层板置紫外光灯(365nm),观察类黄酮的颜色变化,通过对比标样并参考 Harborne的方法[19]进
行鉴定.
1.2.4 葱兰和韭兰花色色素质量分数的检测
(1)韭兰花青素苷的测定
取花瓣0.100g,迅速用液氮研磨至粉末,用含1.0% 浓盐酸的甲醇溶液(V 浓盐酸∶V 甲醇=1∶99)
提取12h,定容至50mL,立刻在波长200~700nm范围内扫描[19-20],每次测量设置3个重复.采用改进
的Fuleki方法[21]计算花青素苷的质量分数(mg/g).
花青素苷质量分数/=
A535nm×V×n
98.2×m
式中:A535nm为色素在535nm波长处的吸光度,V 为一定质量的花瓣提取色素时的定容体积 mL;n为比
色时稀释的倍数,98.2为花青素苷色素在535nm波长处的平均消光系数,m 为花瓣的质量g.
(2)花色色素的总类黄酮质量分数的测定
称取花瓣0.100g放入具塞试管中,迅速用液氮研磨至粉末,加入提取剂为1%浓盐酸的甲醇溶
液10mL浸提48h,将浸提液定容至10mL,每次测量设置3个重复.
根据氯化铝显色法[22],黄酮类化合物与 AlC13 形成黄色的黄酮铝配合物.将标样芦丁于102℃烘
干1h,准确称取20.3mg用少量甲醇溶解,用浓盐酸∶甲醇(1∶99,v/v)定容至25mL,配成0.812mg/
mL标准样品溶液.分别取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL标准样品溶液,加浓盐酸∶甲醇(1∶99,v/v)至4
mL,再分别加入1% AlC13·6H2O甲醇溶液6mL平衡10min.在220~700nm范围内,采样间隔1nm
慢速扫描,发现在401nm和268nm处各有一吸收峰,以401nm为检测波长测定标准样品的吸光值,根
据标样芦丁溶液体积质量分数和A401 吸光值绘制标准曲线,求出线性回归方程.
芦丁标准曲线方程分别为
C=0.052 7×A401nm+0.001 3 R2=0.999 9
C=0.033 7×A268nm+0.004 0 R2=0.981 8
式中:c为芦丁体积质量分数(mg/mL);Aλmax为吸光度.
经实验后得出,λmax=268nm波长处得到的工作曲线,线性关系及精密度数据均不佳,故本实验选
取λmax=401nm为测定波长.
取2mL提取液加入3mL 1% AlC13·6H2O甲醇溶液平衡10min,测定A401 利用标准曲线线性回归
63 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第36卷
方程计算样品溶液体积质量分数,并计算冷冻样品总类黄酮质量分数,单位为mg/g.
2 结果与分析
2.1 葱兰和韭兰花色色素的特征颜色反应
葱兰和韭兰花色色素特征颜色反应见表1.葱兰花瓣色素主要是类黄酮,不含花青素,类黄酮化合物
则主要是黄酮,可能也含有异黄酮,不含有黄酮醇、查尔酮、橙酮、二氢黄酮和二氢异黄酮,色素可能具备
3′,4′,5′-三羟基,所有色素的C3位无游离羟基.韭兰花瓣色素主要是花青素和类黄酮,类黄酮化合物也
主要是黄酮,可能含有二氢黄酮和二氢异黄酮,不含黄酮醇,色素具有邻二酚羟基结构.
表1 葱兰和韭兰花色色素的颜色反应和结果
韭兰 葱兰 测 试 结 果
石油醚测试 无色 无 色
均表现 出 无 色,说 明 两 种 花 色 色 素 均 不 含 类 胡 萝 卜
素[9,12-13].
盐酸测试 红色 微黄色
韭兰显示出红色,说明含有花青素,葱兰出现黄色则说明可
能是黄酮类化合物.
氨水测试 黄绿色 亮黄色
韭兰色素表现的黄绿色是由花青素苷呈现的蓝色和类黄酮
呈现的黄色混合而成.
浓盐酸-镁粉反应 红色退为粉红色 微紫红
韭兰由红色退为粉红色,说明含有花青素苷.葱兰显示出的
微紫红,意味着葱兰可能含有黄酮,可能也含异黄酮(isofla-
vone)[14,23].
浓盐酸-锌粉反应 微紫红 淡紫红
均呈现出不同程度的紫红,意味着这两种花花色色素不含黄
酮醇,可能含二氢黄酮醇[15,24-25].
醋酸铅反应 白色沉淀 黄色沉淀
韭兰产生白色沉淀,葱兰产生黄色沉淀,表明这两种花色色
素具备酚羟基,而且不含查尔酮、橙酮,可能具邻二酚羟基
或者兼有4-酮基、3-OH或者4-酮基、5-OH结构[14-15,23].
三氯化铁反应 墨绿色 深黄色
韭兰和葱兰分别呈现出墨绿色和深褐色,表明这两种花的花
色素必然具备酚羟基.并且葱兰的花色色素可能具备3′,
4′,5′-三羟基,所有色素的C3位无游离羟基[14-15,23].
三氯化铝反应 黄橙色 黄橙色
韭兰和葱兰均呈现出黄橙色,证实这两种花花色色素属于黄
酮类[14-15,23].
浓硫酸反应 深黄色 深黄色
韭兰和葱兰均呈现出深黄色,再次证实这两种花花色素属于
黄酮类[14-15,23].
四氢硼钠反应 洋红色 无色
韭兰呈现出洋红色,证明其含有二氢黄酮和二氢异黄酮.葱
兰呈现出无色,证明其不含二氢黄酮和二氢异黄酮[14-15,23].
碱性试剂反应 绿色 淡黄色
韭兰呈现出绿色,证明其含有二氢黄酮;葱兰呈现出淡黄
色,通空气后颜色不变,说明其不含二氢黄酮醇[14-15,23].
氨性氯化铯反应 黑色沉淀 白色沉定
意味着两种花花色色素中具有邻二酚羟基结构的黄酮类化
合物[14-15,23].
硼酸反应 无色 无色
韭兰和葱兰均未发生反应,说明两者花色色素的黄酮可能不
含C5-OH[14-15,23].
73第3期 董 博,等:葱兰和韭兰花色色素种类和质量分数的研究
2.2 花色素成分的紫外-可见光谱分析
2.2.1 花瓣中的叶绿素检测
葱兰和韭兰花色色素的丙酮∶乙醇溶液在662nm和644nm处均无吸收峰(表2),这意味着葱兰和韭
兰花色色素可能不含叶绿素[17].
2.2.2 花瓣中的类胡萝卜素检测
葱兰和韭兰花色色素的石油醚∶丙酮溶液在440nm和470nm附近均无吸收(表2),说明葱兰和韭兰
中不含有类胡萝卜素[16].
2.2.3 色素的紫外-可见光谱分析
韭兰花色色素的1%浓盐酸的甲醇溶液中,在530nm处有一个吸收峰,这为花青素苷的特征峰.
在352nm和265nm处的吸收峰为韭兰和葱兰所具备(表2,图1),这表明韭兰与葱兰的花色色素含
有相同的非红色黄酮类化合物,韭兰的红色是源于花色色素或其苷,即确证韭兰的花色色素为花青素
苷和黄酮类,葱兰花色色素仅为黄酮类;带Ⅰ吸收峰352nm、带Ⅱ吸收峰264或266nm,再次证实
葱兰色素含黄酮,不含黄酮醇和二氢黄酮[26],264或266nm处吸收峰的非低强度再次说明韭兰和葱
兰色素不含查尔酮、橙酮.
表2 葱兰和韭兰用不同溶剂提取的花色色素的紫外-可见光最大吸收峰
品 种
溶 剂
90%的丙酮∶乙醇 石油醚∶丙酮 1%浓盐酸的甲醇 盐酸化甲醇
韭兰 无最大吸收峰 342 532,350,266
葱兰 无最大吸收峰 339 353,264
图1 葱兰和韭兰花色色素的紫外-可见光谱(左:葱兰 右:韭兰)
2.2.4 薄层层析色谱检测
实验中分别考察了乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)、甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)、甲苯乙
酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)、正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶2)等多个展开系统.结果表明甲醇盐酸萃取物以正丁
醇∶醋酸∶水(4∶1∶2),甲醇萃取物以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸(10∶8∶1)系统分离和展开效果最佳.
薄层色谱检测结果表明,葱兰和韭兰含有相同的非红色黄酮类化合物;葱兰花主要成色色素为木
犀草素(图2A),韭兰花的主要成色色素为锦葵色素和木犀草素,还含有一种迁移快的待定黄酮类化
合物(图2B).
2.3 葱兰和韭兰花色色素质量分数的检测
根据Fuleki方法计算得出粉红色韭兰色素中花青素苷质量分数为1.375mg/g.
本次实验中测得1.000g葱兰花中含有的总类黄酮质量为5.21mg.1.000g韭兰花中含有的总类黄酮
质量为9.505mg.
83 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第36卷
1.槲皮素,2.山柰素,3.木犀草素,4.韭兰,5.葱兰.
a.锦葵色素,b.矢车菊素,c.飞燕草素,d.韭兰.
图2 薄层层析色谱检测结果
3 讨 论
花色是光线照射到花瓣上穿透色素层时部分被吸收,部分被海绵组织反射折回,再通过色素层而进入
我们眼帘所产生的色彩,因此它与花瓣细胞中的色素种类、色素质量分数(包括多种色素的相对质量分
数)、花瓣内部或表面构造引起的物理性状等多种因素有关,但花色色素起主要作用[27].与花成色有关的
色素包括叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮、水溶性生物碱及其生物4大类群[28].花的颜色主要由类黄酮类色
素决定,其中花青素是影响花色的主要因素[29-30].花青素应为花色素及其与糖形成的苷(即花青素苷)[22],
花青素主要分为3类:花葵素苷(橘黄→砖红色)、矢车菊素苷(红色→粉红)、飞燕草素苷(紫色→蓝
色)[24].而花青素本身为花色色素之一[31-33],即花青素属于类黄酮.因此,葱兰和韭兰色素均属类黄酮化
合物,不含有类胡萝卜素.韭兰显示出粉红色,葱兰为白色,从紫外可见光谱扫描的曲线可以看出,两者只
在530nm处(花色苷特征吸收峰)有差异,由薄层色谱检测出韭兰含有锦葵色素,故目前推测韭兰粉红色
的色素为锦葵色素或其苷,而葱兰白色花色的色素则为黄色或无色的黄酮类或其苷.
特征显色反应,紫外-可见光谱和薄层色谱都是色素成分初步分析常用的方法,具有简单易行、结果直
观的特点.在本试验中,葱兰和韭兰色素的特征显色反应,紫外-可见光谱和薄层色谱都出现了相应的结
果,但是由于葱兰和韭兰色素成分的复杂性以及该方法的直观性较强,尤其是特征显色反应,使色素成分
的判断和鉴定更为困难.所以,在特征显色反应,紫外-可见光谱和薄层色谱试验结果的基础上,结合其他
鉴定方法更为必要,比如核磁共振、高效液相色谱和质谱等方法.
葱兰和韭兰是很受人们喜爱的两种观赏植物,但对于其花色的育种未见报道.蓝色系是自然界较少的
花卉色系,世界上许多园艺育种家都将蓝色花卉的培育作为研究重点.飞燕草素衍生而来的花青素苷,包
括矮牵牛素是蓝色花必不可少的色素,飞燕草素的缺乏是自然界缺少蓝色葱莲的重要原因.这些色素的生
93第3期 董 博,等:葱兰和韭兰花色色素种类和质量分数的研究
物合成途径成为蓝色花分子育种的突破口.目前已经将类黄酮生物合成途径研究得相当清楚.类黄酮-3′,
5′-羟基化酶基因(F3′5′H)是合成飞燕草素的关键酶基因,利用基因工程手段将编码F3′5′H 或调节其活
性的基因导入,并促使其在花瓣中表达将为蓝色葱莲的生成提供重要的技术支持.目前已经从矮牵牛、茄
子、长春花、马鞭草、龙胆等植物中成功分离出编码F3′5′H 基因.
该结果将深入解析韭兰和葱兰花色物质的结构和生物合成途径、克隆其相关功能基因和开展花色分子
育种.此外,本研究结果还为同科或相近的单子叶植物花卉如兰花、水仙等花色物质的研究提供了参考.
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Study on the Categories and Contents of the Flower Color
Pigments of Zephyranthes candida and Zephyranthes grandiflora
DONG Bo, LIU Xue, FU Chun,
LU Jun-xing, WANG Tong-ming, CHAI You-rong
Chongqing Key Laboratory of Crop Quality Improvement;Engineering Research Center
of South Upland Agriculture,Ministry of Education;
School of Agronomy and Biotechnology,Southwest University,Chongqing 400715,China
Abstract:Sharing similar background traits,Zephyranthes candida and Z.grandiflora have quite dis-
tinct flower colors.With white and red petals respectively,these sister-flower-color species are widely cul-
tivated in horticulture.It is necessary to dissect the flower color pigment types and the reason causing
their flower color difference.In this study,their petal pigments were extracted and identified with specific
color reactions,ultraviolet and visible spectrophotometry(UV-Vis)and thin layer chromatography.The
results showed that the petal pigment of Z.candida was primarily constituted by luteolin,which is a fla-
vone pigment,and no anthocyanin was detected,and that the petal pigments of Z.grandifloracontained
luteolin and an unknown flavone with a high shift rate,and malvidin,which is an anthocyanidin pigment.
Z.grandifloraflower petal contained 9.505mg/g FW of total flavonoids,of which anthocyanidin/antho-
cyanin was 1.375mg/gFW.Z.candida petal contained 5.21mg/g FW of total flavonoids.The red flow-
er color of Z.grandiflora was conferred by malvidin or its glycoside,which was not present in Z.candi-
daflower.These results wil promote further dissection of the structure and biosynthesis pathway,clo-
ning of related functional genes and molecular breeding of flower colors of Z.candida and Z.grandiflo-
ra.
Key words:Zephyranthes candida;Zephyranthes grandiflora;flower color pigment;category;content
责任编辑 夏 娟
14第3期 董 博,等:葱兰和韭兰花色色素种类和质量分数的研究