全 文 ：291　
回　嵘1 ,马瑞君2 ,朱　慧2 ,赵庆芳 1, ＊
(1.西北师范大学生命科学学院 ,甘肃兰州 730070;
2.韩山师范学院生物系 ,广东潮州 521041)
摘　要:以水浮莲为原料提取叶绿素 ,通过单因素实验确定料液比 、浸提温度 、浸提时间的最佳工艺条件 ,利用正交实
验法优化工艺 ,并测定水浮莲叶绿素的稳定性 。结果表明 ,在单因素的基础上 ,确定了最佳工艺为采用溶剂无水乙醇 、
料液比 1∶5、浸提温度 70℃、浸提时间 7h。水浮莲叶绿素对紫外光 、常见氧化剂 (如 H2O2 )均具有较强的耐受性 ,在近
中性或偏碱性介质环境中性质基本稳定 。研究结果可为入侵植物水浮莲的综合利用提供有价值的参考 。
关键词:水浮莲 ,叶绿素 ,提取 ,稳定性 ,工艺条件
Studyonextractiontechnologyandstabilityof
chlorophylfromaninvasiveplantPistiastratiotesL.
HUIRong1 , MARui-jun2 , ZHUHui2 , ZHAOQing-fang1 , ＊
(1.ColegeOfLifeScience, NorthwestNormalUniversity, Lanzhou730070 , China;
2.DepartmentofBiology, HanshanNormolUniversity, Chaozhou521041, China)
Abstract:InordertogetchlorophylwithhighqualityandyieldfrominvasiveplantPistiastratiotesL, anorthogonal
experimentwasappliedtooptimizethebestextractionconditions.Extractiontime, extractiontemperature, solvent
andsolventtorawmaterialratiowerethemainfactorswhichinfluencetheyieldandpurityoftheextracted
chlorophyl.Thefourfactorschosenforthepresentinvestigationwerebasedontheresultsofasingle-factortest.
Theoptimum extractionconditionsweredetermined asfolows:extractiontime 7h, temperature 70℃ and
solid-liquidratio1∶5.ThechlorophylfromP.stratiotesshowedgreatertolerancetoultravioletlight, commonoxidants
(suchasH2O2)anditwasgeneralystabilityinanearneutralorslightlyalkalineenvironment.Theresultofthis
studymaybeusefultocomprehensiveutilizationofinvasiveplantP.stratiotes.
Keywords:PistiastratiotesL.;chlorophyl;extraction;stability;technologycondition
中图分类号:TS202.3　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2009)10-0291-04
收稿日期:2009-02-17　＊通讯联系人
作者简介:回嵘(1985-),女 ,硕士研究生 , 主要从事细胞生物学、资源
植物学研究。
　　水浮莲(PistiastratiotesL.),又名大薸 ,属天南星
科(Araceae)大薸属多年生草本植物。生长于平静的
淡水池塘和沟渠中 ,可通过匍匐茎进行克隆繁殖 ,也
可由种子进行有性繁殖 [ 1 ];其显著特点是生命力极其
旺盛 、种群扩散速度快 ,在短时间内形成单优势种群
落 。水浮莲原产南美 ,于 20世纪 50年代作为饲料引
入中国 ,又因其生长 、繁殖速度快 ,能从水体吸收大
量的营养物质 ,因此在水体富营养化治理和污水处
理中具有一定作用 ,但水浮莲漂浮生长 ,易在湖泊 、
水库和静水河湾等地方堵塞航道 ,影响水产养殖 ,导
致沉水植物死亡 ,危害水生生态系统结构与功能 ,目
前已被列为入侵植物。对入侵植物的研究通常从控
制和综合利用两方面考虑 。有关水浮莲综合应用开
发时有报道 ,如处理富营养化水体 、有效抑制藻类生
长 ,对低铜污染水体有良好的修复能力等 [ 2] 。但在水
浮莲发挥其生物净化能力的同时 ,其植株作为饲料
外 ,很少综合利用。从植物叶中提取叶绿素 ,并将其
改性形成性质稳定的食用色素或工业染料 ,具有较
高的潜在价值和应用开发前景 ,在食品 、化妆品 、医
药等工业中应用日益广泛 [ 3-5] 。本实验通过常规方
法 ,对水浮莲叶绿素的提取工艺及其稳定性等方面
进行了研究 ,旨在获得最佳提取工艺并了解影响其
稳定性的因素 ,为水浮莲的进一步开发利用提供有
价值的参考。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
水浮莲植株　选择生长于潮州市东丽湖湖面成
熟 、健康无病虫害且长势基本一致的 ,带回实验室 ,
选择新鲜的水浮莲叶作为叶绿素提取原料;无水乙
醇 、95%乙醇 、丙酮 、H2O2、Na2CO3、NaHCO3等　均为
分析纯。
UV-4802H型紫外可见分光光度计 , YP601N型
电子天平 , HH-8恒温水浴锅 , PHS-3C型精密酸度
计 , AX-T2GN型搅拌机等。
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2009.10.027
292　
1.2　实验方法
1.2.1　叶绿素提取 　取一定量的水浮莲叶洗净 ,阴
干 ,置于搅拌机中捣碎 ,然后封于塑料袋中置于冰箱
中保存 ,实验前取出称取一定量 ,按一定的料液比加
入浸提溶剂 ,维持一定温度 ,适时过滤移取浸提液 ,
避光保存。
叶绿素提取工艺流程:水浮莲叶※捣碎※浸提※过
滤※叶绿素提取液
1.2.2　叶绿素含量(CT)测定　测定植物的叶片叶绿
素含量常规应用分光光度法(Arnon法)。其原理是
利用叶绿素溶于有机溶剂的性质 ,将叶片浸于丙酮溶
液中研磨提取 ,经过滤后 ,在某一特定波长下测定光密
度 ,在根据 Arnon提出的公式进行计算 。在最佳提取
液的条件下 ,以温度 、浸泡时间 、液料比三因素来进行
L9(33)正交设计实验 ,确定最佳提取工艺条件 [ 6] 。
叶绿素 a、叶绿素 b在红光区的最大吸收峰分别
位于 663nm和 645nm,又已知在波长 663nm下叶绿
素 a、叶绿素 b的 80%丙酮溶液的吸收系数分别为
2.04和 9.27,在波长 645nm下分别为 16.75和 45.6,
故得出叶绿素含量(CT)计算公式:
CT=Ca+Cb=8.02×OD663 +20.21×OD645
式中:CT值的单位为 mg·L-1;吸光值的高低与
叶绿素的含量(CT)成正比。
1.2.3　叶绿素稳定性测定
1.2.3.1　温度对水浮莲叶绿素稳定性的影响　选取
正交实验中浸提量最高的一组作为实验组 ,移取叶
绿素浸提液 5mL置于 4个 50mL容量瓶中 ,用无水乙
醇定容 、摇匀。在不同温度(40、50、60、70、80℃)水
浴中 ,加热已定容的叶绿素溶液 30min,冷至室温后
测定其叶绿素含量。
1.2.3.2　紫外光对水浮莲叶绿素稳定性的影响　选
取正交实验中浸提量最高的一组作为实验组 ,移取
叶绿素浸提液 5mL置于 4个 50mL容量瓶中 ,用无水
乙醇定容 、摇匀。固定紫外光照射距离 56cm,分别测
定未经紫外光照射和在不同作用时间(1、2、3、4h)后
定容溶液的叶绿素 a和叶绿素 b的吸光值 ,进而测出
其叶绿素含量。
1.2.3.3　酸碱介质对水浮莲叶绿素稳定性的影响　
选取正交实验中浸提量最高的一组作为实验组 ,移
取叶绿素浸提液 5mL置于 50mL容量瓶中 ,分别用
0.2mol· L-1 Na2HPO4和 0.1mol·L-1柠檬酸配制具有
不同 pH的缓冲液(pH=2、4、6、8、10)定容 、摇匀 ,放
置一段时间后 ,测定溶液中叶绿素含量。
1.2.3.4　氧化剂对水浮莲叶绿素稳定性的影响　选
取正交实验中浸提量最高的一组作为实验组 ,移取
叶绿素浸提液 5mL置于 50mL容量瓶中 ,用不同浓
度的 H2O2 溶液 (0.60%、 1.20%、 1.80%、 2.40%、
3.00%)定容 、摇匀。放置一定时间后 ,测定溶液中叶
绿素含量。
2　结果与分析
2.1　水浮莲叶叶绿素的提取实验
2.1.1　浸提溶剂的选择 　浸提溶剂的选择原则:样
品含有的各种化学成分在提取溶剂中的溶解度不
同 ,选择对所需提取的成分溶解度大 ,而对其他无关
成分溶解度小;不与目标物质发生化学反应 ,包括不
成键或成缔合态;价格低廉 ,使用安全;沸点适中 ,便
于溶剂回收反复利用的溶剂作浸提液 。
在室温 、料液比 1∶6的同等条件下 ,选用丙酮 、无
水乙醇 、95%乙醇等 3种常用有机溶剂提取水浮莲
叶绿素提取效果的排列顺序:无水乙醇 >95%乙醇
>丙酮(图 1),无水乙醇的浸出效果最好 ,这可能与
水浮莲叶中含有叶绿醇而导致叶绿素亲脂性较大有
关 [7 ] ,且无水乙醇挥发性小 ,毒性小 ,价格相对低廉 ,
因此选其做浸提溶剂。
图 1　溶剂对浸提的影响
2.1.2　料液比的选择　采用不同的料液比(1∶4、1∶5、
1∶6、1∶7、1∶8),在同等条件下用无水乙醇浸提水浮莲
叶 8h(图 2),通过对浓度 ×体积计算 ,得出随着料液
比值的增大 ,浸提出的叶绿素含量增多 ,当料液比达
到 1∶7时 ,浸提已基本达到完全 ,料液比 1∶7与 1∶8相
比 ,浸提出的叶绿素含量稍高 ,但通过差异显著性分
析 ,没有显著性差异。根据朗伯-比尔定律 ,浓度与
吸光度成正比 ,而料液比的下限是由保证浸提剂浸没
原料所需的体积所决定的。但由于料液比 1∶4的体积
相对较小 ,不能使原料得到充分浸润 ,因此提取的量较
少 ,浸提效果不好。在无水乙醇工艺可行的前提下本
着节约的原则 ,确定料液比的适宜范围为1∶5～1∶7。
图 2　料液比对浸提的影响
2.1.3　浸提温度的选择　采用 1∶6的料液比 ,用无水
乙醇分别在 40、50、60、70、80℃下浸提水浮莲叶 7h
(图 3)。在 40～ 70℃范围内 ,浸提效果与温度成正比 ,
在 70℃时叶绿素含量与在 40℃时相比 , 上升了
1.99%。当温度超过 70℃时 , 浸提量开始下降 ,在
80℃时 ,浸提量已低于 40℃时的浸提量。原因在于
随着温度的提高 ,溶剂向原料内部的扩散速率增加 ,
溶质的溶出速度加快。当温度高于 70℃时 ,吸光值有
所下降 ,分析认为是高温导致了叶绿素的分解 ,且高温
浸提会增加叶绿素中脂质杂质 ,使外观稠厚粗糙 ,因
此 , 50～70℃应当是水浮莲叶绿素适宜浸提的温度。
2.1.4　浸提时间的选择　在室温 、料液比 1∶6的同等
条件下 ,用无水乙醇浸提水浮莲叶不同时间(4、5、6、
293　
图 3　温度对浸提的影响
7、8ｈ）（图 4),随着时间的延长 ,浸提率增加 ,在 4～7h
范围内 ,浸提量由 47.77mg·L-1上升到 49.51mg· L-1 ,
当时间达到 7h,原料中的可溶出物已近完全 ,在原料
内 、外部间溶液浓度梯度变得很小 ,所以超过 7h后
浸提率增幅变小。综合考虑浸提效果和工艺效率 ,
确定 5～ 7h为适宜的浸提时间 。
图 4　时间对浸提的影响
2.1.5　正交实验　由于水浮莲叶绿素的提取率实际
上是受料液比 、浸提温度 、浸提时间三个因素交叉影
响 ,为了全面考虑这三个因素的影响 ,以提取水浮莲叶
绿素的各单因素实验的结果为依据 , 设计了
L9(33)正交实验 [8-11] ,以叶绿素的提取量为考察指标
(表 1、表 2)。
表 1　L9(33)正交实验因素水平表
水平 因素A料液比 B温度(℃) C时间(h)
1 1∶5 50 5
2 1∶6 60 6
3 1∶7 70 7
表 2　L9(33)正交实验结果分析
实验号 A B C 叶绿素含量(mg· L-1)
1 1 1 1 50.11
2 2 2 2 50.59
3 3 3 3 47.34
4 3 2 1 46.42
5 1 3 2 57.11
6 2 1 3 52.33
7 2 3 1 50.62
8 3 1 2 43.12
9 1 2 3 54.70
K1 161.92 145.56 147.15K2 153.54 151.71 150.82K3 136.88 155.07 154.37
R 25.04 9.51 7.22
　　极差 R值表明 ,各因素对水浮莲叶绿素提取的
影响均较大 ,实验时都应给予充分考虑 ,三个因素对
实验影响的大小顺序为:料液比 >浸提温度 >浸提
时间 ,因此最佳提取工艺条件为 A1B3C3 ,即提取水浮
莲叶绿素的最佳工艺为:料液比 1∶5、温度 70℃、时间
7h,且在最佳提取工艺条件下 ,浸提出的叶绿素含量
高于 57.11mg·L-1 。
2.2　水浮莲叶绿素的性质稳定性实验
2.2.1　温度对水浮莲叶绿素稳定性的影响　经过不
同温度处理 ,溶液中叶绿素含量随温度增高而降低
(图 5)。通过浓度 ×体积计算 ,得出随着温度的升
高 ,叶绿素的分解速度加快 ,但当温度超过 70℃后 ,
水浮莲叶绿素含量急速下降。显著性分析表明 ,在
温度 40～ 70℃时 ,叶绿素含量没有显著性差异 ,当温
度达到 80℃时 ,出现显著性差异 ,说明水浮莲叶绿素
在 40～ 70℃范围内较为稳定 ,在高温条件下稳定性降
低。分析认为温度对水浮莲叶绿素的影响机理有两
个方面:一方面 ,温度升高 ,叶绿素降解 ,高温条件下
叶绿素降解速度加快;另一方面 ,在较高温度条件
下 ,叶绿素卟啉环结构中心的镁离子脱落而引起的
脱镁反应 [ 11 ] 。
图 5　温度对水浮莲叶绿素稳定性的影响
2.2.2　紫外光对水浮莲叶绿素稳定性的影响　经过
不同时间紫外光照射 ,溶液中的叶绿素含量基本稳
定 ,变化不大(图 6)。通过浓度 ×体积计算 ,未经紫
外线照射时溶液的叶绿素含量是 57.11mg· L-1 ,与
经过紫外光照射后的叶绿素含量比较 ,变化幅度较
小 ,通过显著性差异分析没有显著性差异 ,因此紫外
光对水浮莲叶绿素的稳定性影响较小 ,同时紫外线
还可杀灭细菌 ,可以间接起到保护叶绿素的作用 [ 7] 。
图 6　紫外光对水浮莲叶绿素稳定性的影响
2.2.3　酸 、碱性介质对水浮莲叶绿素稳定性的影响
　经过不同 pH的缓冲液处理 ,叶绿素溶液的含量随
酸碱浓度的变化而改变(图 7)。通过浓度 ×体积计
算 ,对照液(用无水乙醇稀释定容的叶绿素溶液)叶
绿素含量是 57.11mg· L-1 ,酸性或碱性过强都使溶
液叶绿素含量下降 ,与对照组相比 ,差异显著 ,表明
溶液的 pH影响水浮莲叶绿素的稳定性。水浮莲叶
绿素是双羧酸酯 ,一定浓度的酸碱介质都对它有影
响。这是因为过酸导致叶绿素脱镁而褪色明显而碱
性过强则加速了脱酯反应使叶绿素分解 [12] ,但在碱
性条件下因不发生脱镁或碳环裂解反应却能保持相
294　
对稳定的色泽。因此 ,在使用中只要控制介质的 pH
在近中性或偏碱性水平 ,就能基本维持水浮莲叶绿
素的稳定性 。
图 7　酸碱价质对水浮莲叶绿素稳定性的影响
2.2.4　氧化剂对稳定性的影响　经过不同浓度 H2O2
处理 ,叶绿素随 H2O2浓度的增加而减少(图 8)。通
过浓度 ×体积计算 ,对照液(用无水乙醇稀释定容的
叶绿素溶液)的叶绿素含量是 57.11mg· L-1 ,随着
H2O2的浓度增加 , 溶液的叶绿素含量逐渐下降 ,当
H2O2浓度达到 0.24%时 ,溶液的叶绿素含量快速下
降 。与对照组相比 ,差异性显著 ,由此可见 ,水浮莲
叶绿素对低浓度的氧化剂比较稳定 ,而对高浓度的
氧化剂则表现出较低的抗氧化能力 。分析认为水浮
莲叶绿素的多不饱和双键很不稳定 ,决定了它的易
氧化性 [ 13-14 ] 。
图 8　过氧化氢对水浮莲叶绿素稳定性的影响
3　结论
3.1　用无水乙醇作为浸提溶剂 ,从水浮莲中提取叶
绿素的最佳单因素条件分别为:料液比 1∶5～ 1∶7、浸
提温度 50～70℃、浸提时间 5～ 7h;最佳工艺条件是:
料液比 1∶5、浸提温度 70℃、浸提时间 7h。
3.2　水浮莲叶绿素对紫外光有较强的耐受性 ,对低
浓度的氧化剂比较稳定 ,而对高浓度的氧化剂则表
现出较低的抗氧化能力 ,在 70℃以下的温度和中性
或偏碱性介质环境中性质基本稳定。
3.3　水浮莲是一种生长迅速的入侵植物 ,资源丰富 ,
其叶绿素的提取工艺简单 、可操作性强 ,如能作为提
取叶绿素的资源植物 ,不仅成本低廉 ,而且可以变害
为宝 ,保护生态环境 。
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(上接第 271页)
极性化合物 [ 5] ,由于大孔树脂色谱具备吸附和分子筛
作用 ,可以有效富集所需要活性成分 ,去除杂质 [6 ] ,
因此可以通过大孔树脂来纯化多糖 。本研究考察了
6种型号大孔树脂对无花果多糖的杂质的吸附性能 ,
通过比较 ,综合多方面因素 ,通过静态吸附方法对树
脂进行选型 , 由实验结果发现 AB-8大孔树脂具有
较好的选择吸附和解吸能力 ,选择 AB-8树脂作为最
佳纯化树脂 ,并详细研究 AB-8大孔吸附树脂纯化无
花果多糖的过程 ,确定层析条件为:上柱溶液 pH=
8,洗脱速度 =2mL/min(柱体积 30mm×300mm),
NaCl浓度 =0.03mg/mL。结果表明 ,纯化后的无花果
多糖的纯度达到 71%,回收率 68.7%,说明该方法简
便有效 ,回收率高 ,工艺稳定 ,适于无花果多糖的吸
附纯化 。
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