全 文 ：第6期
第47卷第6期
2008年6月
湖北农业科学
HubeiAgriculturalSciences
Vol.47No.6
Jun.,2008
收稿日期;2008-02-20
基金项目:国家自然科学基金项目(30560094);教育部重点科技项目(205035)
作者简介:高 日(1982-),男,吉林抚松人,2005级硕士研究生,(电话)13944769818;通讯作者,朴炫春,(电话)0433-3261756
(电子信箱)nyypxc@ybu.edu.cn。
东北刺人参(OplpanaxelatusNakai)系五加科
刺人参属多年生落叶灌木,又名北五加、刺人参,其
分布区域十分狭窄,全世界只在中国、俄罗斯、朝鲜
等 3国境内有少量分布[1],在我国主产于吉林省长
白山海拔700～1900m的针叶林带及辽宁东部山区
海拔800～1000m的松杉林下。据近几年的调查,整
个长白山区小片生长的天然东北刺人参已屈指可
数,散生的也已不多[2],必须采取有效措施予以保
护。几年来,国内对东北刺人参的致濒因素和保护
对策也进行了一些探讨[3,4],但尚未见有关东北刺人
参遗传多样性的研究报道。遗传多样性的研究不仅
有助于了解物种的进化历史和适应潜力,以及探讨
物种濒危的机制,同时也关系到能否采取科学有效
的措施来保护物种。用于遗传多样性分析的方法很
多,其中RAPD方法由于具有简便、灵敏、费用相对
便宜、而且可以检测到大量多态位点等优点,已被
广泛地用于研究,并获得了满意的结果。本文利用
RAPD分子标记法对东北刺人参群体的遗传多样性
进行了分析,旨在揭示东北刺人参植物的濒危机
制,为更好地保护东北刺人参种群奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
野外采集供试东北刺人参植株当年生嫩叶,每
地区随机选取10株东北刺人参的叶片,装入保鲜
袋,封口,置于样品贮藏箱(由超低温冰袋维持冷藏
条件)中带回实验室,-70℃保存待用。各采样地概
况和采样数详见表1。
1.2 RAPD分析
1.2.1 基因组 DNA的提取 DNA的提取采用
CTAB[5]法,提取 DNA后,应用 Michemor等的分离
群体分组分析法,分别将每个地区的 10株 DNA样
东北刺人参遗传多样性的RAPD分析
高 日,廉美兰,吴松权,朴炫春
(延边大学农学院,吉林 龙井 133400)
摘要:应用RAPD技术对7份来源于不同区域的东北刺人参进行了分析,从100条随机引物中筛选出
16条引物,共扩增出117条谱带,其中51条为多态带,多态性比率为43.62%,其多态性比率较低。系统
聚类分析将7份东北刺人参居群分为2大类群,长白山老岭山脉的东北刺人参居群聚为一类,长白山主
峰南侧的东北刺人参居群聚为一类。东北刺人参总体较低的遗传多样性是导致其濒危的原因之一。
关键词:东北刺人参;聚类分析;RAPD
中图分类号:S567.5+3;Q503 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2008)06-0627-02
RAPDAnalysisofGeneticDiversityforEndangeredOplpanaxelatus
GAORi,LIANMei-lan,WUSong-quan,PIAOXuan-chun
(AgriculturalColegeofYanbianUniversity,Longjing133400,Jilin,China)
Abstract:Inthisstudy,7Oplpanaxelatussampliesfrom diferentregionsofChangbaiMountainwereanalyzedbyusing
RAPDtechniques.16polymorphicprimers,screenedoutfrom 100random primers,wereusedandproduced117repro-
duciblebands.Ofthem,51bands(43.62%)werepolymorphic.Byclusteranalysisthegermplasmusedinthisstudywasdi-
videdinto2groups:O.elatusofLaolingMountainforonegroup,O.elatusofsouthofChangbaiMountainfortheother.
ThelowergeneticdiversitywasoneofthereasonsofO.elatu.endangerment.
Keywords:Oplpanaxelatus;clusteranalysis;RAPD
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2008.06.024
湖 北 农 业 科 学 2008年
(下转第632页)
图2 UPGMA聚类分析树状图
品等量混合,组成7个不同地区的基因池。
1.2.2 DNA扩增反应程序 反应程序设置为:94℃
预变性 5min,94℃变性 45s,37℃退火 60s,72℃延
伸90s,40个循环,最后72℃延伸7min。反应体系
为 (20μL):9.8μLddH2O,250μmol·L-1 dNTP,2.0
μmol·L-1 MgCl2,2.0μL10×Bufer,0.3μmol·L-1引
物,10ngDNA模板,1.5UTaqDNA聚合酶。
1.2.3 电泳检测 PCR扩增反应结束后,采用0.5×
TBE电泳缓冲液,1.4%的琼脂糖凝胶 (含 0.5μg·
mL-1EB)电泳。取 10μL扩增产物与 2μL电泳载
体缓冲液混匀,电压为80V,电泳产物在GDS-8000
型凝胶成像仪下观察,拍照。
1.3 数据分析
根据片段的有无,用 1表示有带,用 0表示无
带,用 MEGA3.1软件 p-distance来构建遗传距离
矩阵,用 UPGMA法(非加权的成对算术平均法)构
建RAPD聚类树状图。
2 结果与分析
2.1 引物的筛选
100个随机引物进行PCR扩增,筛选出谱带清
晰、稳定、重复性好、多态性明显的16个引物(表2)
用于正式的扩增反应。
2.2 RAPD扩增带的多态性分析
利用16个随机引物对7个东北刺人参居群进
行RAPD分析,共扩增出117条谱带,其中 51条表
现出多态性,占 43.62%,平均每个引物扩增出 7.31
条谱带,其中 3.19条为多态性谱带(表 3),说明东
北刺人参居群表现出较低的遗传多样性。图1为引
物OPD15对7个不同地区扩增的结果。
2.3 东北刺人参居群间聚类分析
根据16条引物扩增产物的统计结果,计算出
遗传距离,其范围为 0.120～0.316,平均遗传距离为
0.224,用 MEGA程序中的非加权组法(UPGMA)进
行聚类分析,得到居群间亲缘关系分支树系图(图
2),以遗传距离 0.222为标准,聚类为 2大类群,位
于长白山老岭山脉的东北刺人参居群聚为一类,包
表1 东北刺人参采样地及采样数
采样地(采样地代号)
长白十五道沟(CB15)
长白十九道沟 (CB19)
通化石湖(THSH)
通化白鸡腰子(THBJ)
白山大镜(BSDJ)
抚松漫江(FSMJ)
临江东小山(LJDX)
地理位置
41°40′N,127°54′E
41°42′N,128°10′E
41°33′N,126°04′E
41°30′N,126°16′E
41°50′N,126°33′E
41°51′N,127°52′E
41°42′N,127°44′E
海拔/m
1000～1200
1000～1150
1002～1200
1040～1180
973～1100
1140～1200
1440～1472
表2 用于RAPD分析的16个随机引物序列数
引物
OPD-15
OPD-20
OPD-18
OPE-05
OPE-06
OPG-14
OPG-11
OPH-01
引物序列
CATCCGTGCT
ACCCGGTCAC
GAGAGCCAAC
TCAGGGAGGT
AAGACCCCTC
GGATGAGACC
TGCCCGTCGT
GGTCGGAGAA
引物序列
TCGGACGTGA
CCAAGCTTCC
CACTCTCCTC
CTGGGGCTGA
TGACGGCGGT
AAGGCGGCAG
CACCCGGATG
GTCCCGTGGT
引物
OPH-02
OPF-09
OPH-17
OPI-13
OPI-14
OPI-06
OPJ-14
OPJ-12
表3 RAPD分析所用引物及其扩增的谱带数
引物
OPD-15
OPD-20
OPD-18
OPE-05
OPE-06
OPG-14
OPG-11
OPH-01
OPH-02
OPF-09
OPH-17
OPI-13
OPI-14
OPI-06
OPJ-14
OPJ-12
总计
扩增谱带/条
7
8
8
8
10
5
8
7
7
7
7
6
8
7
7
7
117
多态性频率/%
57.14
50.00
37.50
37.50
40.00
40.00
50.00
42.86
42.86
42.86
42.86
50.00
50.00
28.57
42.86
42.86
43.62
多态性谱带/条
4
4
4
3
4
2
4
3
3
3
3
3
4
2
3
3
51
2000bp
1000bp
800bp
600bp
M CB19LJDXFSMJBSDJTHSHTHBJCB15
M为200bp分子量标记,字母为表1中的7个不同地区
图1 引物OPD15对7个不同地区的扩增结果
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括通化白鸡腰子(THBJ)、通化石湖(THSH)、抚松漫
江(FSMJ)、临江东小山(LJDX)、白山大镜(BSDJ)。
位于长白山主峰南侧的东北刺人参居群聚为一类,
包括长白十五道沟(CB15)、长白十九道沟(CB19)。
3 讨论
东北刺人参适宜生长在郁闭度较高的环境里[3],
而长白山主峰南侧由于人为破坏生境(森林采伐),
造成采样地空旷,周围无较大的树木,郁闭度小,植
株较矮小;而长白山老岭山脉采样地郁闭度较大,
植株较高,这很可能是本研究中7份来源不同的长
白山区东北刺人参分为长白山主峰南侧和老岭山
脉两类的缘故。从DNA分子水平上说,遗传距离的
变幅越大,说明其遗传分化越大;遗传多样性越高,
表明遗传背景的复杂及该物种存在历史的久远[6]。
从研究的结果来看,来源不同的7份种质的遗传距
离分布在 0.120～0.316之间,平均遗传距离为
0.224,可见东北刺人参遗传多样性比较狭窄,加之
近几年由于人为采食,导致其数量急剧下降。因此,
为了保护这一珍贵的药用植物资源,我们必须加强
对东北刺人参生态环境的保护,同时还应采用组织
培养技术等来扩繁东北刺人参,以实现东北刺人参
种质资源的可持续性利用。
参考文献:
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因(主要是E1A和E3A)的部分或全部,使外源基因
能够通过同源重组的方式进入病毒基因的框架[6]。
外源基因主要进入E1区,因为E1区是病毒复制所
必需的,缺失E1区的腺病毒可以在反式提供E1区
编码产物的细胞系中,如HEK293细胞系中复制。
而E3区的缺失主要是为了扩大病毒的包装容量。
本研究中采用pAdEasy腺病毒载体系统,通过
细菌同源重组产生腺病毒载体的方法[7],该方法是
利用重组酶缺陷型大肠杆菌 (如 BJ5183,recBCs-
bcBC)高效的同源重组机制得以实现的。该法中的
腺病毒骨架质粒包含全长病毒序列 (或 E3区缺
陷),且末端带有PacI酶切位点(8bp内切酶识别序
列)、氨苄青霉素抗性基因和质粒复制区。穿梭质粒
包含病毒基因组左侧区序列ITR序列、病毒包装信
号序列及与E1区下游的一段同源序列。首先,将构
建含有目标基因的穿梭质粒,然后与病毒载体两个
质 粒 载 体 共 转 化 于 recBCsbcBC型 大 肠 杆 菌
(BJ5183),挑取单菌落获得阳性重组质粒,经过限
制性酶切分析,正确的重组子再转染 HEK293细
胞,从而获得重组腺病毒。该方法可以最大程度避
免野生型腺病毒的产生,所以重组成功率较高[6,7]。
另外,细菌内重组的方法无需进行繁琐的病毒空斑
化筛选,因而省时省力。因此,通过本试验 pAd-
hLTF的成功构建,可为人乳铁蛋白腺病毒载体的构
建以及其他重组腺病毒载体的构建提供一定的依
据。
参考文献:
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(责任编辑 王 珞)
(责任编辑 王 珞)
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