全 文 ：668 2014 年第 5 期
收稿日期:2013-11-05
基金项目:浙江省农业新品种选育专项 (2012C12903)
作者简介:鲁忠富 (1963 －) ，男，浙江杭州人，实验师，从事蔬菜育种及新品种推广工作。E-mail:lzf0522@ 163. com。
通信作者，李国景。E-mail:ligj@ mail. zaas. ac. cn。
文献著录格式:鲁忠富，王莎，吴晓花，等． 利用插入 /缺失标记分析我国瓠瓜资源遗传多样性 ［J］． 浙江农业科学，2014 (5) :
668 － 672．
利用插入 /缺失标记分析我国瓠瓜资源遗传多样性
鲁忠富，王 莎，吴晓花，胡耀文，汪宝根，吴新义，徐 沛，李国景
(浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)
摘 要:瓠瓜作为重要的葫芦科作物之一，在我国已有悠久的栽培历史。瓠瓜分子标记研究大大落后于黄
瓜、白菜等作物，应用分子标记技术开展瓠瓜种质资源的遗传多样性和亲缘关系研究，对促进瓠瓜重要种质资
源的开发和利用具有重要意义。本研究选择 96 份具有广泛代表性的我国瓠瓜种质材料，利用插入 /缺失分子标
记技术，研究分析了其遗传多样性和亲缘关系，探讨我国瓠瓜品种间的基因差异和瓠瓜亚种间及亚种内的亲缘
关系。结果表明，瓠瓜种质遗传相似系数 0. 30 ～ 1. 00，在遗传相似系数 0. 68 处可将 96 份瓠瓜种质材料分为 8
类，各种质材料分布较平均;相同瓜型的材料有聚集在一起的趋势，根据瓜型可将这 96 份瓠瓜种质大致分为
3 类。
关键词:瓠瓜;聚类分析;插入 /缺失标记;遗传多样性
中图分类号:Q 75 文献标志码:A 文章编号:0528-9017(2014)05-0668-05
瓠瓜 (Lagenaria siceraria (Molina)Standl．)
为雌雄同株异花一年生草本植物 (2n = 2x = 22) ，
隶 属 葫 芦 科 (Cucurbitaceae ) 葫 芦 属
(Lagenaria)，是世界上重要的葫芦科作物之
一［1］。瓠瓜原产赤道非洲南部低地［2］，是人类最
早种植的作物之一，1 万年前就有考古学上的证
据表明人类已开始种植瓠瓜。我国瓠瓜遗传资源
丰富，其栽培史可上溯到新石器时代，被认为是
瓠瓜的次生起源中心之一［3］。瓠瓜在我国主要分
布在长江流域及以南地区，近年来，山东、河
北、河南等地也有栽培［4］，可作为瓜果蔬菜食
用，既可烧汤做菜，又可腌制晒干;其成熟果还
可用作容器或乐器;此外，瓠瓜可用作嫁接西瓜
的砧木，用来预防西瓜枯萎病［3，5］。
目前瓠瓜分类主要根据种质资源的表型特征，
按形态分，有圆柱形、牛腿形、手榴弹形等;按大
小分，老瓜大的可达 8 ～ 10 kg，小的不足 0. 1 kg;
按嫩瓜颜色分，有深绿、浅绿、白色、白底带花青
斑等;按品质分有柔滑型、硬肉型 (硬于黄瓜) ;
按口味分，有淡味型、甜味型、清苦型 (类似苦
瓜之苦味)、剧苦型;按生育期可分为早熟型、中
熟型、晚熟型。此外，不同类型、不同品种的长势
强弱、抗病性、抗逆性等也都有差异［6 － 7］。但目前
在 DNA 水平上检测瓠瓜不同种质间遗传多样性的
研究还较少。
我国瓠瓜生产上以瓠子类品种为主，种质来源
局限性大，缺乏遗传多样性。近年来瓠瓜生产中病
毒病、白粉病、枯萎病等病害多发，苦味瓜不时产
生，商品瓜性状多样性跟不上消费者需求等问题日
益严重，亟需拓宽栽培瓠瓜的遗传多样性，以培养
新一代良种，为此有必要深入了解我国现有瓠瓜品
种的遗传多样性和亲缘关系。
1 材料和方法
1. 1 材料
试验材料为浙江省农业科学院蔬菜所瓠瓜豇
豆组历年搜集并具有广泛代性的 96 份地方品种
资源所组成的自然群体。代号南秀为 LS1，孝感
瓠子为 LS2，贵州圆瓠瓜为 LS3，长瓠为 LS4，龙
岩长四月瓠为 LS5，长蒲 1 为 LS6，甬砧 1 号为
LS7，新疆瓠瓜为 LS8，东阳农家种 1 为 LS9，白
葫芦为 LS10，萧山园蒲为 LS11，广东早瓠瓜为
LS12，松桃瓠瓜为 LS13，金钱蒲为 LS14，全化
蒲瓜为 LS15，东阳农家种 2 为 LS16，四川长瓠
DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.2014.05.042
鲁忠富，等:利用插入 /缺失标记分析我国瓠瓜资源遗传多样性 669
瓜为 LS17，临夏瓠子为 LS18，长蒲 2 为 LS19，
肖长蒲为 LS20，湖南圆瓠瓜为 LS21，小籽瓠瓜
为 LS22，长蒲 3 为 LS23，安吉地蒲为 LS24，武
都瓠子为 LS25，清秀为 LS26，湖南瓠瓜为 LS27，
台江瓠瓜为 LS28，津胜特选为 LS29，青砧为
LS30，辽宁瓠子为 LS31，蒲县瓠瓜为 LS32，新
蔡瓠瓜为 LS33，湖南圆瓠 1 号为 LS34，G22②①
为 LS35，绍兴长瓜为 LS36，短筒瓠子为 LS37，
G32②②为 LS38，杭州长瓜为 LS40，云南农家种
为 LS41，麦瓠为 LS42，小葫芦为 LS43，新选为
LS44，汉龙青玉为 LS45，长蒲 4 为 LS46，极早
熟瓠瓜为 LS47，宁波夜开花为 LS48，观赏瓠子
分离出为 LS50，本地义序芋瓠瓜为 LS53，南平
青花插杆瓠为 LS54，清流长芋瓠为 LS55，思南
瓠瓜为 LS56，松桃瓠瓜分离为 LS57，贵州长瓠
瓜 1 为 LS58，长瓠子为 LS59，湖北瓠子为 LS60，
花皮葫芦分离出为 LS61，永泰圆筒瓠为 LS63，
贵州长瓠瓜 2 为 LS64，榕江瓠瓜为 LS65，正阳
瓠瓜为 LS66，湖南早瓠瓜为 LS67，雄溪瓠瓜为
LS68，菜葫芦为 LS69，三江口葫子为 LS70，瓢
葫芦为 LS71，九山园蒲 1 为 LS72，丽水农家种
为 LS73，义乌农家种为 LS75，东阳农家种分 1
为 LS76，东阳农家种分 2 为 LS77，东阳农家种
分 3 为 LS78，汉龙碧玉为 LS79，葫芦蒲为 LS80，
火焰蒲为 LS81，金华农家种为 LS82，九山园蒲 2
为 LS83，南秀公主为 LS84，爬地蒲为 LS86，青
皮圆蒲为 LS87，三山牛腿蒲为 LS88，绍兴长蒲
为 LS90，透年蒲为 LS91，腰葫芦为 LS93，引
10-1②②为 LS94，圆葫芦为 LS95，浙江圆瓠 1 号
为 LS96，园蒲为 LS97，越蒲 1 号为 LS98，云南
为 LS99，早熟瓠子为 LS101，砧木为 LS102，08
扁蒲-1 为 LS103，G26②① /②为 LS104，J077-1
I77①为 LS105 和长条瓠瓜为 LS106。
供试材料经浸种、催芽、育苗、移植等一系列
处理 后，使 用 改 进 的 CTAB 法 提 取 基 因 组
DNA ［6 － 8］。
1. 2 方法
1. 2. 1 插入 /缺失标记的来源
本试验所使用的插入 /缺失标记是由瓠瓜豇豆
组前期开展的 ＲAD-Seq 基因组测序开发而来，包
括 85 条差异片段超过 10 bp 的多态性插入 /缺失
标记。
1. 2. 2 PCＲ反应条件
PCＲ体系包括 10 ng 的 DNA，2. 5 pmol 的引
物，2. 5 nmol 的 dNTPs，18. 6 nmol 的 MgCl2，0. 2
U的 rTaq 酶以及 10 × Buffer，用水补足体积至 12. 5
μL。PCＲ扩增程序为:①预变性 94 ℃ 3 min;扩
增循环:②变性 94 ℃ 30 s，③退火 52 ℃ 30 s，④
延伸 72 ℃ 40 s，② －④共重复 36 个循环;⑤72
℃延伸 5 min，⑥4 ℃保存。
1. 2. 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
PCＲ产物在室温条件下使用 8%的垂直非变性
聚丙烯酰胺凝胶 (Acr ∶ Bis 为 19 ∶ 1 或 29 ∶ 1 或
39∶ 1)电泳分离，银染法染色，拍照分析。根据
电泳结果记录清晰可重复的条带，将电泳图中同一
位置上清晰且可重复的不同带型分别赋值为 0，1，
2，以此类推，统计各引物的多态性条带的比率并
作进一步分析。
1. 2. 4 遗传多样性分析
对每种基因型在每个位点上的等位基因数和出
现频率进行统计。使用 PIC_ Calc 0. 6 (http: / /
www. esnips. com /doc /9171097b-ac41-424a-9d35-e7d
4e540ec9f /Picalc)计算每个插入 /缺失位点的 PIC
值，计算公式为:PIC = 1 － ΣPij
2。其中:Pij代表
在第 i个位点出现第 j 个等位基因的频率［9］。使用
NTSY Spc 2. 10 进行 Nei’s遗传距离计算 (DA)和
主坐标分析 (PCoA)。最后根据 DA 的结果用
SAHN 程序中的 UPGMA 法进行聚类分析，并用
EIGEN程序求特征值和特征向量进行主坐标分析，
用 Tree Plot 模块生成聚类图，构建分子进化树，
用 3D Plot生成主坐标图。
2 结果与分析
等位基因变异的多态性位点数和百分率不仅可
以反映植物的多态性指数，而且可以评价引物反应
多样性信息量的多少。本研究从 85 条插入 /缺失引
物中共筛选出 22 条多态性较好且能稳定扩增的引
物。不同的引物所产生的条带数不同，最多的为 8
条 (如引物插入 /缺失-33590) ，最少的为 1 条 (如
引物插入 /缺失-24033) ，扩增的 DNA 片段大小范
围为 75 ～ 500 bp，除了插入 /缺失-17370 (多态性
条带大小为 500 bp 左右)，多态性条带大小均为
100 ～ 200 bp。22 条引物共扩增出 64 条带，其中
27 条带表现出多态性，平均每条引物扩增 2. 78 条
带，平均多态性比例为 42. 19% (表 1)。
基于插入 /缺失扩增的 22 个多态性标记，通过
NTSYS-pc (2. 1 版)软件对 96 份瓠瓜种质资源进
行了聚类分析，得到了基于插入 /缺失的聚类树状
670 2014 年第 5 期
表 1 插入 /缺失引物多态性分析
引物编号 扩增总带数
多态性扩增
条带数
多态性比率 /
%
插入 /缺失-9470 4 1 25
插入 /缺失-17370 3 1 33
插入 /缺失-24033 1 1 100
插入 /缺失-24849 2 1 50
插入 /缺失-25208 5 2 40
插入 /缺失-32260 2 1 50
插入 /缺失-32630 2 1 50
插入 /缺失-33188 2 1 50
插入 /缺失-33590 8 2 25
插入 /缺失-40571 6 1 17
插入 /缺失-42061 3 1 33
插入 /缺失-45015 1 1 100
插入 /缺失-52443 1 1 100
插入 /缺失-65626 3 2 67
插入 /缺失-75892 2 1 50
插入 /缺失-83521 5 2 40
插入 /缺失-85024 2 1 50
插入 /缺失-100187 2 1 50
插入 /缺失-42722 3 2 67
插入 /缺失-51166 3 1 33
插入 /缺失-96511 3 1 33
插入 /缺失-104571 1 1 100
总计 64 27
图 (图 1)。瓠瓜种质之间的遗传距离 (GD)变
幅 0 ～ 2. 54。其中，LS73 (丽水农家种)和 LS82
(金华农家种)，LS12 (广东早瓠瓜)和 LS105
(J077-1 I77①) ，LS2 (孝感瓠子)和 LS11 (萧
山圆蒲)，LS9 (东阳农家种 1)和 LS103 (08 扁
蒲-1) ，LS25 (武都瓠子)和 LS61 (花皮葫芦分
离种)的 GD均接近 0. 00，说明它们的亲缘关系
极近。
从树状图中并无明显可作为分类标准的特性，
但可以根据各种不同的趋势，将 96 份瓠瓜种质材
料在遗传相似系数为 0. 68 处分为 8 类 (图 1)。第
1 类与其他材料相似性系数最小，仅有 0. 36，即与
其他材料的距离最远，仅有 1 份瓠瓜种质，即来自
辽宁的小葫芦，该材料瓜型为单腰且较小，瓜长仅
10 cm左右。第 2 类也只有 1 份种质，来自宁夏的
临夏瓠子，瓜型中长棒形，瓜色绿白，瓜条较长，
早熟，该材料与其他材料相比地理来源较远，亲缘
关系也较远。第 3 类同样只包括 1 份瓠瓜材料，为
来自新疆的瓢葫芦，瓜色浅绿，瓜型为长把梨形且
较小，瓜长 19 cm左右，早熟。第 4 类包括 3 份材
料，分别为来自浙江的全华蒲瓜、肖长蒲和杭州长
瓜，瓜型均为长棒形，瓜色绿色，瓜长 45 ～ 50
cm，早熟。第 5 类共有 9 份材料，均表现为早熟，
其中 7 份材料瓜色为绿白相间，而这 7 份材料中有
5 份材料的瓜型均为牛腿形，2 份来自云南的材料
也聚集在一起。第 6 类包括 5 份材料，分别为清
秀、新蔡瓠瓜、麦瓠、南平青花插杆瓠、砧木。这
组材料瓜色均表现为绿色，其中除砧木以外的 4 份
材料瓜型为棒形，瓜长较短，早熟。第 7 类仅有 1
份材料，绍兴长蒲，瓜型棒形，瓜色油绿，瓜条较
长 (41 cm)，熟性较早。余下的 75 份材料被归为
第 8 类，以瓜型不同又可细分为 3 组，第 1 组瓜型
为棒形 (除腰葫芦外) ，包括 8 份材料，瓜皮绿
色，瓜长中等 (25 ～ 35cm) ，早熟。第 2 组材料包
括 17 份，瓜型多为牛腿形，近圆形有 5 份，占到
近圆形材料总数的 1 /2;瓜色均表现为绿色，瓜长
较短，熟期较晚，仅有的 3 份晚熟型的材料 (火
焰蒲、透年蒲和圆葫芦)均聚集在本组。第 3 组
包括 50 份材料，来源较广泛，瓜型大部分为棒形，
瓜色多变，以纯绿色为主，本试验中全部 9 份极早
熟材料 (萧山园蒲、长蒲 1、长蒲 2、长蒲 3、长
蒲 4、津胜特选、湖南圆瓠 1 号、观赏瓠子分离
种)均聚集在本组。
在主成分分析中，没有明显的可以作为分类标
准的特征，材料较平均地分布于图中，但相对于产
地而言，相同瓜型的材料有聚集在一起的趋势
(图 2)。上窄下宽的牛腿形、长把梨形材料，大部
分集中分布在图左部和右上的位置;近圆形材料在
图上分布较分散，但大部分集中分布在中间靠左的
位置;棒筒形材料最多，集中在图中间部分，这与
树状图的结果基本一致。
3 小结和讨论
我国瓠瓜资源众多，遗传变异非常丰富，但较
为全面、系统的遗传多样性分析还比较少见。应用
分子标记技术研究分析主栽品种的亲本与优良品系
间的亲缘关系，可为瓠瓜育种实践中优化亲本选
配，减少杂交组合数目，提高品种质量及育种效率
提供依据。通常，在阐明种质资源的遗传多样性
后，选择能最大程度代表物种遗传多样性的核心种
质构成核心种质库是长期整合、保存种质基因资
源、方便育种亲本选配的重要途径。
插入 /缺失标记是指两亲本间在全基因组序列
中的差异，在生物的遗传多样性分析、纯度鉴定、
亲子分析等方面已有广泛的应用。然而，插入 /缺
失引物在蔬菜中应用较少，在瓜类中更加少见。本
研究首次使用插入 /缺失引物研究非模式物种———
鲁忠富，等:利用插入 /缺失标记分析我国瓠瓜资源遗传多样性 671
图 1 96 份瓠瓜材料聚类分析树状图
瓠瓜的遗传多样性。Decker-Walters 等［10］利用 38
个 ＲAPD 标记研究了世界范围内 74 个瓠瓜品系的
遗传多样性，发现世界范围内瓠瓜可以大洲为界限
划为不同类群，非洲、亚洲的瓠瓜种质相对独立，
新大陆 (美洲)的种质起源于非洲，但受到亚洲
种质的一些影响，而商业品种由于地理起源和遗传
组成的差异有很大不同，由于这些品种的流通使得
难以完整地界定某些品种。Yetisir 等［11］利用形态
672 2014 年第 5 期
图 2 96 份瓠瓜材料插入 /缺失聚类分析二维坐标图
学标记研究土耳其的 182 份瓠瓜的果实和种子材
料，在统计学和多变量分析共同研究所得的数据基
础上，发现瓜型和大小可以作为区分瓠瓜亚类的主
要标准，这与本研究的结论一致。
本研究利用插入 /缺失标记方法，从分子水平
上对我国 96 份瓠瓜资源的遗传多样性及亲缘关系
进行研究，可以为我国瓠瓜资源的合理开发利用以
及进一步开展瓠瓜育种研究、指导亲本选配提供重
要依据;同时可为瓠瓜种质的分类、核心种质库的
构建，以及瓠瓜种质资源的进一步收集保存、创新
利用提供分子水平上的依据，以缩短瓠瓜育种年
限，提高育种效率。
参考文献:
［1］ Beevy S S，Kuriachan P． Chromosome numbers of south Indian
Cucurbitaceae and a note on the cytological evolution in the family
［J］． Journal of Genetics and Cytology，1996，31:65 －71．
［2］ Decker-Walters D S，Wilkins-Ellert M，Chung S M，et al．
Discovery and genetic assessment of wild bottle gourd［Lagenaria
siceraria (Mol．)Standley;Cucurbitaceae］ from Zimbabwe ［J］．
Economic Botany，2004，58 (4):501 －508．
［3］ Lee J M． Cultivation of grafted vegetables I． Current status，
grafting methods，and benefits ［J］． HortScience，1994，29
(4) :235 － 239．
［4］ 彭庆务，何晓明，谢大森，等． 瓠瓜的特征特性及育种对策
［J］． 广东农业科学，2003 (1) :18 － 19．
［5］ Yetisir H，Sari N． Effect of different rootstock on plant growth，
yield and quality of watermelon ［J］． Animal Production
Science，2003，43 (10) :1269 － 1274．
［6］ 潭俊杰，蒋光明． 蔬菜栽培学各论 ［M］． 北京:中国农业
出版社，1999．
［7］ 吕家龙． 蔬菜栽培学各论:南方本 ［M］． 北京:中国农业
出版社，2001．
［8］ Maguire T L，Collins G G，Sedgley M． A modified CTAB DNA
extraction procedure for plants belonging to the family Proteaceae
［J］． Plant Molecular Biology Ｒeporter，1994，12 (2) :106 －
109．
［9］ Anderson J A，Churchill G A，Autrique J E，et al． Optimizing
parental selection for genetic linkage maps ［J］． Genome，
1993，36 (1) :181 － 186．
［10］ Decker-Walters D，Staub J，Lopez-Sese A，et al． Diversity in
landraces and cultivars of bottle gourd (Lagenaria siceraria;
Cucurbitaceae)as assessed by random amplified polymorphic
DNA ［J］． Genetic Ｒesources and Crop Evolution，2001，48
(4) :369 － 380．
［11］ Yeti爧ir H，爦akar M，Serce S． Collection and morphological
characterization of Lagenaria siceraria germplasm from the
Mediterranean region of Turkey ［J］． Genetic Ｒesources and
Crop Evolution，2008，55 (8) :1257 － 1266．
(责任编辑:高 峻)