全 文 ：金银木叶总黄酮提取工艺的响应面设计优化
赵小珍，黄 潇 (山西省分析科学研究院，山西太原 030006)
摘要 ［目的］优化并确定金银木叶中总黄酮的最佳提取工艺。［方法］在单因素试验的基础上，选用乙醇体积分数、提取温度、液料比
作为研究对象，通过 3因素、3水平的 Box-Behnken响应面法确定金银木叶总黄酮提取的最佳工艺。［结果］试验表明，金银木叶总黄酮
的最佳提取工艺为，乙醇体积分数 68%，提取温度 67 ℃，液料比 27∶ 1 ml /g，在此条件下，黄酮提取率可达到 12． 88%。［结论］研究可为
金银木的充分利用以及新的抗氧化药物的开发提供参考依据。
关键词 响应面法;金银木叶;黄酮; 提取
中图分类号 S789． 4; TS255． 36; TS218 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2015) 23 －264 －03
Optimization of Extraction Conditions for Flavonoids from Loniceramaackii Maxim Leaves by Ｒesponse Surface Method
ZHAO Xiao-zhen，HUANG Xiao ( Shanxi Academy of Analytical Science，Taiyuan，Shanxi 030006)
Abstract ［Objective］To optimize and determine the extraction techniques for total flavonoids in Loniceramaackii Maxim leaves． ［Method］To
explore the optimal processing techniques of extraction of flavonoids from Loniceramaackii Maxim，ethanol concentration，temperatureand the ratio
of volume of solventtoweight of the dry leaf powder ( V/W) were identified asmain affecting parameters and optimized using response surface anal-
ysis basedon a three-variable，three-level Box-Behnken design． ［Ｒesult］The optimal extraction conditionswere determined asethanol concentra-
tion of 68%，temperature of 67 ℃，V/W of 27∶ 1 ml /g． Under these conditions，the extraction rate of flavonoids from Loniceramaackii Maxim was
up to 12． 88% ． ［Conclusion］The study can provide reference basis for full use of Loniceramaackii Maxim and development of new anti-oxidative
drugs．
Key words Ｒesponse surface methodology; Loniceramaackii Maxim leaves; Flavonoids; Extraction
作者简介 赵小珍( 1982 － ) ，女，山西柳林人，工程师，硕士，从事食品
中微生物、添加剂和农药残留的检测研究。
收稿日期 2015-06-11
金银木(Loniceramaackii Maxim)是忍冬科植物，耐寒、耐
旱、耐半荫，易繁殖，抗病虫，是优良的观花观果灌木，在我国
种植十分广泛。金银木不同生长时期的花叶果均含有黄酮，
而以叶中含量最高［1 －2］。黄酮类化合物主要指以 2-苯基色
原酮为基核的一类化合物，以游离的苷原或以与糖结合的苷
类等形式存在于很多植物中。研究表明，黄酮类化合物具有
多种生物活性，是许多中草药的有效成分之一，可以保护心
血管系统，抗癌，抗病毒，治疗慢性支气管炎、冠心病、动脉硬
化及淋巴结核等病，还具有较强的抗氧化和清除自由基的能
力［3 －5］，因此在食品领域也有广阔的应用前景。笔者对金银
木叶中总黄酮的提取工艺进行优化，确定了最佳工艺条件，
为金银木的充分利用以及新的抗氧化药物的开发提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试金银木叶采集于山西大学院内。芦丁标准
品、氯化铝、醋酸、醋酸钠、乙醇，均为分析纯试剂。752N 型
紫外可见分光光度计，恒温水浴锅。
1． 2 方法
1． 2． 1 芦丁标准曲线的绘制。准确吸取 20 μg /ml的芦丁标
准储备液 0、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0 ml 于 10 ml 容量瓶中，加
入 0． 1 mol /L的氯化铝 1． 0 ml，醋酸 －醋酸钠缓冲液 1． 5 ml，
最后用 50%乙醇定容至刻度，摇匀。测定上述标准溶液在
408 nm波长处的吸光度，绘制标准曲线。
1． 2． 2 金银木叶中黄酮类化合物的提取。称取 1． 000 g 金
银木干叶于具塞锥形瓶中，分别加入不同浓度的乙醇，在恒
温水浴中浸提一定时间，趁热过滤，冷却后用同浓度乙醇定
容至刻度。
1． 2． 3 黄酮提取的单因素试验设计。分别以不同体积分数
的乙醇、不同的料液比、不同的提取温度、不同的提取时间作
为单因素，考察各因素对黄酮提取率的影响。
1． 2． 4 响应面优化试验。在单因素试验基础上，选取影响
显著的乙醇体积分数、液料比、提取温度 3 个因素作为 Box-
Behnken设计的自变量，以黄酮提取率作为响应值进行响应
面优化组合［6］，因素水平设计见表 1。
表 1 响应面分析因素水平设计
水平编号
因素
乙醇体积分数
(A)∥%
温度
(B)∥ ℃
液料比
(C)∥ml /g
－1 60 60 20∶ 1
0 70 70 25∶ 1
1 80 80 30∶ 1
2 结果与分析
2． 1 芦丁标准曲线的绘制 芦丁标准曲线见图 1，回归方程
为 y =0． 036 7x －0． 011 3，Ｒ2 = 0． 999 9。
图 1 芦丁标准曲线
2． 2 黄酮提取的单因素试验
2． 2． 1 乙醇体积分数的影响。精确称取 1． 000 g 金银木叶
于具塞锥形瓶中，分别加入体积分数为 30． 0%、40． 0%、
责任编辑 李菲菲 责任校对 李岩安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(23) :264 － 266，270
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.23.099
50． 0%、60． 0%、70． 0%、80． 0%的乙醇各 30 ml，在 60 ℃恒温
水浴中浸提 3 h，趁热过滤，冷却后用同浓度乙醇定容至刻
度，然后按照“1． 2． 1”试验步骤对黄酮类化合物进行测定(平
行取样 3次，提取率取平均值，以下同) ，结果见图 1。由图 1
可知，当乙醇体积分数为 70%时，黄酮提取率最高，继续加大
乙醇体积分数，黄酮提取率反而下降。
图 2 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
2． 2． 2 液料比的影响。精确称取 1． 000 g金银木叶，分别加
入 70． 0%的乙醇 20、25、30、35、40 ml，在 60 ℃恒温水浴中浸
提 3 h，按上述步骤测定总黄酮提取率。由图 2可知，液料比
上升到 25∶ 1 ml /g之后，黄酮提取率达到最大并保持稳定，再
增加乙醇量，提取率基本不变。故从经济角度考虑，最佳液
料比应为 25∶ 1 ml /g。
图 3 液料比对黄酮提取率的影响
2． 2． 3 提取温度的影响。精确称取 1． 000 g金银木叶，分别
加入 70． 0%的乙醇 30 ml，浸提 3 h，提取温度分别为:30、40、
50、60、70、80 ℃，按照上述步骤测定总黄酮提取率。由图 3
可知，提取温度为 70 ℃时，黄酮提取率最高，温度升到 80
℃，提取率下降。分析是由于温度高于 70 ℃时乙醇挥发严
重，影响了黄酮提取率，所以最佳提取温度应为 70 ℃。
2． 2． 4 提取时间的影响。精确称取1． 000 g金银木叶，分别
加入 70． 0%的乙醇 30 ml，提取温度为 60 ℃，浸提时间分别
1． 0、1． 5、2． 0、2． 5、3． 0、3． 5 h，按照上述步骤测定总黄酮提取
率。由图 3可知，提取时间对黄酮提取率影响并不大，因此
在响应面试验设计中选取了乙醇体积分数、液料比、提取温
度 3个因素。
2． 3 黄酮最佳提取工艺条件的响应面试验分析 以乙醇体
积分数、液料比、提取温度作为响应面设计的单因素，黄酮提
取率为响应值，应用 Box-Behnken试验设计［7 －9］进行试验，结
图 4 提取温度对黄酮提取率的影响
图 5 提取时间对黄酮提取率的影响
果见表 2。利用 Minitab 15． 0软件对表 2试验数据进行多元
回归拟合，得到三元二次回归方程如下:Y = 12． 50 － 0． 58A －
0． 33B + 1． 71C － 0． 12AB + 0． 075AC － 0． 15BC － 1． 09A2 －
0． 64B2 － 2． 26C2。回归方程中二次项系数为负值，表明回归
方程所对应抛物线开口向下，有最大值。
表 2 响应面试验设计及结果
试验号
因素
A B C
提取率
%
1 0 －1 +1 12． 07
2 －1 0 －1 8． 28
3 0 0 0 12． 19
4 －1 +1 0 11． 23
5 0 0 0 12． 66
6 0 －1 －1 7． 87
7 0 +1 －1 7． 43
8 －1 0 +1 11． 06
9 0 0 0 12． 25
10 －1 －1 0 11． 59
11 +1 +1 0 9． 72
12 +1 0 +1 10． 17
13 0 +1 +1 11． 02
14 0 0 0 12． 58
15 +1 －1 0 10． 55
16 0 0 0 12． 84
17 +1 0 －1 7． 09
对所得数据采用 SAS(statistics analysis system)进行回归
分析，回归方程方差分析可得:F回归 = 55． 37，P回归 ＜ 0． 000 1;
FA = 23． 14，PA = 0． 001 9;FB = 7． 75，PB = 0． 027 1;FC =
201． 13，PC ＜0． 000 1;FAB = 0． 48，PAB = 0． 512 1;FAC = 0． 19，
56243 卷 23 期 赵小珍等 金银木叶总黄酮提取工艺的响应面设计优化
PAC = 0． 672 7;FBC = 0． 80，PBC = 0． 399 9;FA2 = 43． 16，PA2 =
0． 000 3;FB2 = 14． 99，PB2 = 0． 006 1;FC2 = 186． 46，PC2 ＜
0． 000 1;F失拟 =2． 20，P失拟 =0． 230 9。由此可知，该试验所选
用的二次多项模型具有高度的显著性(P ＜ 0． 000 1)。失拟
项在 α =0． 05水平上不显著(P = 0． 230 9 ＞ 0． 05) ，其决定系
数(Ｒ2)为0． 986 1，校正决定系数(Ｒ2Adj)为 0． 968 3，证明该模
型拟合程度良好，用该模型对金银木叶中总黄酮的提取工艺
进行优化是合适的。
对方程的回归系数显著性分析表明，A、B、C、A2、B2、C2
这几个因素影响显著(P ＜0． 05) ，表明提取温度、乙醇体积分
数和液料比对金银木叶中黄酮的提取率有显著影响。A2、
B2、C2 影响显著说明试验因子对响应值的影响不是简单的
线性关系。
通过上述二次多项回归方程所做的响应面图和等高线
图见图 6 ～8，该组图反映了 3个因素中任何 2因素交互影响
黄酮提取率的效果。从图 6 ～ 8 可以看出，黄酮提取率在试
验区域内存在最大值，它随着 2 个因素值的不断升高而升
高，达到最大值后又逐渐下降。
图 6 乙醇体积分数和提取温度交互影响黄酮提取率的响应面和等高线
图 7 乙醇体积分数和液料比交互影响黄酮提取率的响应面和等高线
图 8 提取温度和液料比交互影响黄酮提取率的响应面和等高线
2． 4 黄酮最佳提取工艺的确定和验证 根据 Box-Behnken
试验所得的结果和二次多项回归方程，利用 Minitab15． 0 软
件获得金银木叶黄酮提取率最高时的最佳条件为:乙醇体积
( 下转第 270页)
662 安徽农业科学 2015年
测定的不确定度分量情况列于表 5。
表 5 氰化氢不确定度分量
分量类别 来源 评定方法 量值 urel
u (pre) 粒相物萃取过程 B类 多分量 0． 000 99
u(S) 标准溶液校准和稀释过程 B类 多分量 0． 023 9
u(C) 曲线拟合 A类 多分量 0． 007 9
u(rep) 重复性 A类 1． 440 μg /支 0． 011 4
2． 5 相对合成标准不确定 试验得出的相对合成标准不确
定度如下:
urel = ［urel(pre) ］
2 +［urel(s) ］
2 +［urel(c)
2］+［urel(rep) ］槡
2
= 0． 000 992 + 0． 023 92 + 0． 007 92 + 0． 011 4槡 2
= 0． 027 7
2． 6 相对扩展不确定度 按正态分布，取置信概率 95%，k
=2，则相对扩展不确定度:
Urel = k × urel =2 ×0． 027 7 =0． 055 4
珚ω =126． 30 μg /支
U =Urel ×珚ω =0． 055 4 ×126． 30 =7． 00 μg /支
2． 7 结果报告 按照 YC /T253 －2008 卷烟主流烟气中氰化
氢的测定———连续流动法重复 10次测定卷烟主流烟气中氰
化氢的含量为:珚ω =126． 30 ±7． 00 μg /支，k =2。
3 结论
采用连续流动分析法测定卷烟主流烟气中的氰化氢，测
定结果的不确定度为 7． 00 μg /支，比较此次评定中不同参数
的分量大小可知，标准溶液校准及稀释过程中引入的不确定
度分量最大。为保证检测数据的准确性，应定期对定量移液
器校准，严格按规定配制工作曲线。
参考文献
［1］JOHNSON W Ｒ，KANG J C． Mechanism of hydrogen cyanide formation
from the pyrolysis of amino acids and related compounds［J］． J Org Chem，
1971，36:189 －192．
［2］国家烟草专卖局．中华人民共和国国家计量技术规范:JJF(烟草)4． 1 －
2010 烟草及烟草制品连续流动法测定常规化学成分测量不确定度评
定指南第1部分:水溶性糖［S］．北京:中国质检出版社，2011．
［3］国家烟草专卖局．中华人民共和国国家计量技术规范:JJF(烟草)4． 2 －
2010 烟草及烟草制品连续流动法测定常规化学成分测量不确定度评
定指南第2部分:总植物碱［S］．北京:中国标准出版社，2011．
［4］国家烟草专卖局．中华人民共和国国家计量技术规范:JJF(烟草)4． 3 －
2010 烟草及烟草制品连续流动法测定常规化学成分测量不确定度评
定指南第3部分:总氮［S］．北京:中国标准出版社，2011．
［5］国家烟草专卖局．中华人民共和国国家计量技术规范:JJF(烟草)4． 4 －
2010 烟草及烟草制品连续流动法测定常规化学成分测量不确定度评
定指南第4部分:氯［S］．北京:中国标准出版社，2011．
［6］国家烟草专卖局．中华人民共和国国家计量技术规范:JJF(烟草)4． 5 －
2010 烟草及烟草制品连续流动法测定常规化学成分测量不确定度评
定指南第5部分:钾［S］．北京:中国标准出版社，2011．
［7］中国计量科学研究院．中华人民共和国国家计量技术规范:JJF1059 －
1999测量不确定度评定和表示［S］．北京:中国计量出版社，2004．
［8］国家标准物质研究中心．中华人民共和国国家计量技术规范:JJF1135
－2005化学分析测量不确定度评定［S］．北京:中国计量出版社，
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
2005．
( 上接第 266 页)
分数 67． 63%、提取温度 67． 16 ℃、液料比 26． 91∶ 1 ml /g。在
此条件下，黄酮提取率预测值为 12． 95%。为了验证此模型
预测的准确性，选择乙醇体积分数 68%、提取温度 67 ℃、液
料比 27∶ 1 ml /g 进行验证，共试验 3 次，黄酮提取率分别为
12． 84%、12． 92%、12． 89%，平均值为 12． 88%，与预测值接
近，证明该模型能较好地预测金银木叶中总黄酮的提取率。
3 结论
响应面分析法是研究几个因素间交互作用的分析方法，
它克服了正交设计只能处理离散的水平值，而无法找到整个
区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷，是寻找最
优加工工艺参数的有效方法。该研究在单因素试验的基础
上，选用乙醇体积分数、提取温度、液料比作为研究对象，通
过 3因素、3 水平的 Box-Behnken 响应面法优化提取金银木
叶总黄酮的最佳工艺条件，即乙醇体积分数 68%，提取温度
67℃，液料比27∶ 1ml / g。在此条件下，黄酮提取率可达到
12． 88%。试验证明，采用此响应面法优化得到的提取条件
准确可靠，具有一定的实用价值。
参考文献
［1］李春华．金银木叶中黄酮类化合物的提取［J］．河北农业大学学报，
2003，26(3):65 －68．
［2］陈月开，王美素，李红孩，等．金银花和金银木芦丁成分分析［J］．山西
大学学报，2008，31(4):612 －616．
［3］李楠，刘元，侯滨滨．黄酮类化合物的功能特性［J］．食品研究与开发，
2005，26(6):139 －141．
［4］鲁晓翔．黄酮类化合物抗氧化作用机制研究进展［J］．食品研究与开
发，2012，33(3):220 －224．
［5］孟雪莲，徐成斌．黄酮类化合物的药理学作用研究进展［J］．宁夏农林
科技，2012，53(2):63 －64．
［6］BOX G E P，BEHNKEN D W． Some new three level design for thestudy of
quantitativevariables［J］． Technometrics，1960，2(4):455 －475．
［7］范三红，毛强强，王亚云，等．响应面法优化制备南瓜籽抗氧化钛的工
艺［J］．食品科学，2012，33(11):241 －246．
［8］梁彬，李娟，余杰，等．响应面法优化海篷子皂苷提取工艺条件与生物
活性研究［J］．食品科学，2014，35(2):102 －107．
［9］LIU Y，WEI S，LIAO M． Optimization of ultrasonic extraction of phenolic
compounds from Euryaleferox seed shells using response surface methodol-
ogy［J］． Industrial Crops and Products，2013，49:837 －843．
072 安徽农业科学 2015 年