全 文 ：植物资源与环境　1999 , 8(3):7 ～ 11　　　　　　　
Journal of Plant Resources and Env ironment　
　　　
何首乌叶铜锌超氧物歧化酶纯化及性质
程光宇1)　吴国荣1)　刘子列1)　　志清2)　魏锦城1)
(1)南京师范大学生命科学学院 ,南京 210097;　2)南京市卫生防疫站 ,南京 210003)
摘要　何首乌(Polygonum multif lorum Thunb.)叶 Cu·Zn-SOD 经硫酸铵盐析 、离子交换柱层析及
葡聚糖凝胶过滤等步骤 , 被分离成两组 SOD 同工酶(SOD1 , SOD2), 它们被纯化到均一程度。
SOD1 分子量为 32.4 kD ,亚基分子量为 16.2 kD , 最适 pH 值为 5.0 , 在 60℃和 65℃时的半衰期分
别为 14 min 和 8 min;SOD2 分子量为 30.5 kD ,亚基分子量为 15.9 kD , 最适 pH 值为 6.0 ,在 60℃
和 65℃时半衰期分别为 32 min 和 16 min , 它由 274 个氨基酸残基组成 , 不含 Cys、Ty r 和 T ry。
SOD1 和 SOD2 每 mol酶都含有 2mol Cu 和 2 mol Zn ,它们在紫外区最大吸收波长均为 275 nm。
关键词　何首乌;叶;Cu·Zn-SOD;纯化;性质
Isolation and characterization of Cu·Zn-SOD from leaves of Polygonum multi florum
Thunb.　 Cheng Guangyu1), Wu Guorong1), Liu Zilie1), Fu Zhiqing2), Wei
Jingcheng1), (1)The College of Life Science , Nanjing No rmal University , Nanjing
210097;　2)Nanjing Sanitation and Anti-Epidemic Station , Nanjing 210003), J .
Plant Resour.&Env iron.1999 , 8(3):7 ～ 11
Two isoenzymes (SOD1 and SOD2)of Cu·Zn-SOD from the leaves of Polygonum
multi f lorum Thunb.were isolated and purified to apparent homogenei ty.The relat ive
molecular masses are about 32 400 and 30 500 for SOD1 and SOD2 respectively.SOD1
and SOD2 exhibite an optimum at pH about 5.0 and 6.0 respect ively .The half-life
v alues at 60℃and 65℃are respectively , 14 and 8 min for SOD1 and 32 and 16 min for
SOD2.SOD2 consistes of about 274 amino acid residues , f rom which Cys , Ty r and Try
are absent.SOD1 and SOD2 contain 2 atoms of Cu and Zn per molecule of enzyme , and
spectrum of the enzymes in the ult raviolet reg ion show s the same a peak at 275 nm.
Key words 　 Polygonum mult if lorum Thunb.; leaf; superoxide dismutase;
purification;characterization
超氧物歧化酶(简称 SOD , EC.1.15.1.1)是一类能有效清除对生物体有害自由基的酶类 ,
近年来的研究表明 SOD与自由基诱发的各种疾病的形成 、发生 、发展及变化密切相关 ,已成为
当今生物医学界研究的热点[ 1] 。我国药用植物资源丰富 ,许多种类富含 SOD[ 2] 。何首乌是著
名抗衰老中草药 ,国内外对其有效成分进行了较多研究 ,但 SOD研究方面报道不多。本文报
道何首乌叶Cu·Zn-SOD的纯化及性质 ,为深入研究其药理作用提供理论依据。
江苏省教育委员会自然科学基金资助项目(1998FWXOSZ0001)
　　　程光宇:男 , 1954年 11月生 ,大学 ,高级工程师 ,江苏大自然生物工程公司副总工程师 ,从事生物活性物质及保健食品
研究开发工作。
　　　收稿日期:1999-03-15
1　材 料 与方 法
1.1　材料
何首乌(Polygonum multi f lorum Thunb.)叶取自南京师范大学生命科学学院温室 。
1.2　方法
1.2.1　何首乌叶 Cu·Zn-SOD的纯化 　采
500 g 何首乌鲜叶 ,剪碎后加入预冷至 4℃的
1 000 mL 50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.8 ,
含0.1 mmol/L EDTA·Na2 , 以下称 A液),
于组织捣碎机中破碎匀浆 ,匀浆液经 8层纱
布过滤 ,滤液 15 000 g 冷冻离心 20 min ,弃
沉淀 ,上清液加硫酸铵分部盐析 ,收集 30%
～ 80%饱和度的硫酸铵沉淀部分 ,用 A液溶
解 ,经 Sephadex G-25柱脱盐 ,将有活性部分
直接加到用 A 液平衡过的 DEAE-Sepharose
柱上 ,用 A 液洗至 A280低于 0.02 后进行盐
梯度洗脱 ,最先洗脱的是两个活性峰(SOD1 ,
SOD2 ,见图 1),加大盐浓度后又有两个活性
峰洗脱下来。将最先洗脱的两个峰分别合
并 ,对 A液透析后再进行 DEAE(DE52)柱层
○—○SOD1(peak 1);　★—★SOD2(peak 2);
——— 蛋白质 protein;　 ┄┄磷酸盐浓度 K-phosphate
图 1　何首乌叶 SOD DEAE-Sepharose柱层析图谱
Fig 1　Chromatography of SOD from the leaves of
Polygonum multi florum Thunb.on DEAE-Sepharose column
析 ,收集活性部分 ,冻干后再进行 Sephadex G-100柱层析 ,用 20 mmol/L 碳酸氢铵溶液洗脱 ,
得到洗脱体积相同的活性峰和蛋白峰 ,将活性峰合并 ,冻干后得到纯化的 SOD1和 SOD2。
1.2.2　SOD活性测定　采用 Stew ert和 Bew ley 方法[ 3] 。
1.2.3　蛋白质含量测定　采用 Bradford方法[ 4] 。
1.2.4　聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性显示　按程光宇 、魏锦城等方法[ 5] 。在 4%～ 35%浓度梯
度胶上进行。
1.2.5　紫外吸收光谱测定　用岛津 UV-256型紫外可见分光光度计测定。
1.2.6　分子量及亚基分子量测定　分子量测定用 Sephadex G-100凝胶过滤法;亚基分子量
测定用SDS-PAGE 法 ,在 7.5%～ 20%梯度胶上进行。
1.2.7　金属元素含量分析　在 PE-Plasma 400电感耦合等离子体光谱仪上进行 。
1.2.8　氨基酸组成分析　按 Pico·TagTM氨基酸分析系统方法进行 ,色氨酸按蔡武城和袁厚
积的荧光法[ 6] ,在岛津 RF-540型荧光分光光度计上进行 。
2　结　　果
2.1　何首乌叶 SOD的纯化
何首乌叶 Cu·Zn-SOD的纯化见表 1 。500 g 叶纯化后得到 2.52 mg 纯酶 ,酶比活性均大
8　　　　　　　　　　　　　　　植　物　资　源　与　环　境　　　　　　　 　　　　　　8 卷
于 4 000 U/mg 。洗脱的 4个活性峰经梯度胶电泳分离后 ,根据相对 Rf值确定最先洗脱的峰 1
和峰 2为 Cu·Zn-SOD(SOD1 , SOD2),峰 3和峰 4 均含有 Mn-SOD 和 Fe-SOD ,但峰 3 以 Fe-
SOD为主 ,峰 4以 Mn-SOD为主(图 2)。
表 1　何首乌叶 SOD 的纯化
Tab 1　Puri fication of SOD from the leaves of Polygonum mult iflorum Thunb.
纯化步骤
Step
总蛋白质
Total protein
(mg)
总活性
Total act ivity
(uni ts)
比活性
Specific activity
(U/mg)
纯化倍数
Purification
(fold)
得率
Yield
(%)
粗提液 Crude ext ract 1 670.00　　 　　160 000 95.8　　 　　　 1.0 　　　100
30%～ 80%(NH4)2SO 4 630.00　　 100 000 158.7　　 1.7 63
DEAE-Sepharose　SOD1 13.18　　 24 100 1 828.5　　 19.1 15
　　　　　　　　SOD2 21.00　　 40 200 1 914.3　　 20.1 25
DEAE(DE52)　　SOD1 3.82　　 12 081 3 162.6　　 33.0 8
　　　　　　　　SOD2 6.81　　 21 010 3 085.2　　 32.2 13
Sephadex G-100　 SOD1 1.02　　 4 000 4 313.7　　 45.0 3
　　　　　　　　SOD2 1.50　　 9 072 6 048.0　　 63.1 6
2.2　何首乌叶 SOD酶类型鉴定
2.2.1　抑制剂试验　SOD有三种类型 ,根据
它们对 H2O2和 KCN 的敏感性不同可将其分
开。当分别加入 H2 O2和 KCN 到 SOD1 和
SOD2中后 ,其活性谱带均消失(图 2),说明它
们对 H2O2和 KCN均敏感 ,为 Cu·Zn-SOD。
2.2.2　金属元素含量分析　金属元素分析结
果表明 ,每 mg SOD1酶蛋白中含 0.443%Cu
和0.443%Zn ,即每 mol SOD1分子含有 2.3
mol Cu 和 2.1 mol Zn;每 mg SOD2 中含
0.340%Cu和 0.425%Zn ,即每 mol SOD2分
子中含有 1.7 mol Cu和 2.1 mol Zn。它们的
Fe和 Mn含量均低于检测下限 ,说明纯化酶
为Cu·Zn-SOD。
2.3　何首乌叶 SOD理化性质
2.3.1　紫外吸收光谱　纯酶紫外吸收光谱
(图 3)表明 , SOD1 和 SOD2在紫外区最大吸
收波长分别为 275.2 nm 和 275.6 nm 。
2.3.2　分子量及亚基分子量　从牛血清白蛋
白 、卵清蛋白 、胰蛋白酶及细胞色素 C 所做的
　　1:峰 4 peak 4;　2:峰 3 peak 3;　3 , 6 , 8 , 10:SOD2(峰
2 peak 2);　4 , 5 , 7 , 9:SOD1(峰 1 peak 1);　5 , 6:在 2
mmol/ L H2O 2存在下染色 stained in the presence of 2
mmol/ L H2O 2;　7 , 8:在 2 mmol/ L KCN 存在下染色
stained in the presence of 2 mmol/ L KCN;　11:标准蛋
白质 standard protein
图 2　何首乌叶SOD 的 4%～ 35%的浓度梯度胶电泳(1
～ 8)和 7.5%～ 20%的 SDS-PAGE电泳(9～ 11)图谱
Fig 2　4%～ 35% concentration gradient gels
electrophoresis(1～ 8)and 7.5%～ 20% SDS-PAGE(9
～ 11)from the leaves of Polygonum mult iflorum Thunb.
标准曲线上查得 SOD1 分子量为 32.4 kD±0.2 kD ,SOD2分子量为 30.5 kD±0.6 kD;在
7.5%～ 20%的 SDS-PAGE图谱上 SOD1和 SOD2均为单一区带(图 2),说明它们已被纯化到
均一程度 ,它们的亚基分子量分别为 16.2 kD和 15.9 kD 。
93 期　　　　　　　　　　程光宇等:何首乌叶铜锌超氧物歧化酶纯化及性质
2.3.3　pH 稳定性　取适量酶液 ,保温于不
同pH 值的广泛pH 缓冲液中 20 min ,测定酶
活性(图 4A), SOD1 最适 pH 为 5.0 , SOD2
最适 pH 为 6.0 。
2.3.4　酶的热稳定性 　SOD1 和 SOD2 于
不同温度中保温 15 min , 测定酶活性(图
4B), SOD1 在 65℃已大部分失活 , SOD2 在
70℃仍较稳定。图 4C 为保温于不同温度中
定时取样测定的酶活性 , SOD1 和 SOD2 在
60℃和 65℃时的半衰期分别为 16 min 和 8
min及 32 min和 14 min。
2.3.5　氨基酸组成分析 　何首乌叶 SOD2
的氨基酸组成见表 2 ,它由 274个氨基酸残
基组成 ,不含 Cys、 Ty r和 Try 。
　　┄┄ SOD1　　——— SOD2
图 3　何首乌叶 SOD 的紫外吸收光谱
Fig 3 　Ultraviolet absorption spectrum of SOD from the
leaves of Polygonum mult iflorum Thunb.
　　 ○—○SOD1　　★—★SOD2
图 4　pH(A)、温度(B)对何首乌叶 SOD 活性的影响及 SOD 的热稳定性(C)
Fig 4　Effect of pH(A), temperature(B)on activity of SOD and thermal stabil ity of SOD
from the leaves of Polygonum mul tif lorum Thunb.
表 2　何首乌叶 SOD2氨基酸组成
Tab 2　Amino acid composition of SOD2 from the leaves of Polygonum mul tif lorum Thunb.
氨基酸
Amino
acid
残基数
Residues/
mol
氨基酸
Amino
acid
残基数
Residues/
mol
氨基酸
Amino
acid
残基数
Residues/
mol
氨基酸
Amino
acid
残基数
Residues/
mol
氨基酸
Amino
acid
残基数
Residues/
mol
Lys 6 Thr 22 Gly 62 M et 2 Phe 　4
His 9 Ser 10 Ala 34 Iso 10 Try 　0
Arg 7 Glu 18 Cys 0 Leu 24
Asp 33 Pro 10 Val 19 Tyr 0 Total 274
3　讨　　论
何首乌叶两组 Cu·Zn-SOD同工酶(SOD1 , SOD2)的纯化结果表明 ,它们都具有与文献报
10　　　　　　　　　　　　　　　植　物　资　源　与　环　境　　　　　　　 　　　　　　8 卷
道的 Cu·Zn-SOD相似的理化性质 ,但在分子量 、最适 pH 及热稳定性等方面存在一定差异 ,提
示它们可能存在于细胞不同部位 ,属叶绿体型和细胞质型[ 7 , 8] ,作者的研究已证实SOD2对
H2O2有一定抗性 ,存在于叶绿体内 , 属叶绿体型(待发表)。
本文在分离粗提液 SOD 中用梯度胶电泳取代均一胶电泳 ,得到了满意结果 ,并发现在
Mn-SOD和 Cu·Zn-SOD间有一条新谱带 ,经抑制剂试验证实为 Fe-SOD ,它含量低 ,作者曾多
次用均一胶电泳均未发现其存在。用梯度胶电泳分离 SOD同工酶具有较高分辨率 ,比均一胶
提高 1 ～ 2个检测数量级[ 5] ,能得到很清楚的谱带 ,在电泳中 ,蛋白质不受本身电荷密度影响 ,
最终滞留于与其分子大小相当的孔径中不再迁移 ,可根据相对 Rf值初步判断 SOD三种类型 ,
可见在分离和鉴定 SOD同工酶中 ,采用梯度胶电泳比均一胶电泳有更好的应用前景。
参　考　文　献
1　丁克祥主编.SOD 临床研究集.北京:原子能出版社 , 1992.
2　吴国荣 ,魏锦城 ,程光宇 ,等.植物药超氧物歧化酶活性与某些性质的研究.南京师大学报(自然科学版), 1991 , 14(2):93
～ 101.
3　S tewert R C , Bew ley J D.Lipid peroxidation associated w ith accelerated aging of soybean axes.Plant Physiol , 1980 , 65:245
～ 248.
4　Bradford M M.A rapid and sensi tive method for the quantitation of microgram quantit ies of protein ut ilizing the p rinciple of
protein dye binding.Anal Biochem , 1976 , 72:248～ 254.
5　程光宇 ,魏锦城 ,吴国荣.SOD 的聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离和酶活性显示.植物生理学通迅 , 1994 , 30(4):248.
6　蔡武城 ,袁厚积主编.生物物质常用化学分析法.北京:科学出版社, 1982.72.
7　Kanematsu S , Asada K.Characterist ic amino acid sequences of chloroplast and cytosol isozymes of CuZn-superoxide dismutase in
spinach , rice and harsetai l.Plant Cell Physiol , 1990 , 31(1):99～ 112.
8　Kw iatowski J , Kaniuga Z.Isolation and characterization of cytosolic and chloroplast isoenzymes of Cu , Zn-superoxide dismutase
from tomato leaves and their relat ionships to other Cu , Zn-superoxide dismutases.Biochem Biophys Acta , 1986 , 874:99 ～
115. (责任编辑:惠　红)
113 期　　　　　　　　　　程光宇等:何首乌叶铜锌超氧物歧化酶纯化及性质