全 文 ：浙江大学学报 (农业与生命科学版 )　 28( 6): 659～ 663, 2002
Journal of Zhejiang Un iversity ( Ag ric. & Life Sci. )
　　收稿日期: 2001-09-04基金项目: 浙江省自然科学基金资助项目 ( 302362)作者简介: 何新华 ( 1966— ) ,男 ,湖南衡阳人 ,副教授 ,在职博士研究生 ,现从事生物固氮工作 .
文章编号: 1008-9209( 2002) 06-0659-05
杨梅根瘤 Frankia菌分离株的遗传多样性研究
何新华 1, 2 , 陈力耕 1 , 胡西琴1 , 张建业 1
( 1. 浙江大学 园艺系 ,浙江杭州 310029; 2. 广西大学园艺系 ,广西 南宁 530005)
摘　要: 对分离自杨梅根瘤的 10株 Frankia菌分离株进行表型特性研究 ,并用特异引物扩增其 16S rD-
N A,对扩增产物用 2种限制性内切酶 HinfⅠ 和 HaeⅢ进行酶切后 ,分析酶切图谱 . 结果表明 :这 10株
Frank ia菌分离株不仅表型存在差异 ,而且其酶切图谱差异较大 ,说明其基因型也有差异 . 即使从同一
株荸荠种杨梅根瘤中 ,不同时间分离获得的 Frankia菌分离株 ,表型和基因型也存在较大的差异 ,可能
属于不同的基因种群 .无论是从菌株表型分析 ,还是 PCR产物的 RFLP分析 ,都表明从杨梅根瘤中分离
获得的 Frankia菌分离株存在着丰富的遗传多样性 .
关　键　词: Frankia; 遗传多样性 ; RFLP; 杨梅
中图分类号: S154. 38　　　文献标识码: A
HE Xin-hua1, 2 , CHEN Li-geng1 , HU Xi-qin1 , ZHANG Jian-ye1 ( 1. Dept. of Horticulture , Zhejiang
University , Hangzhou 310029, China; 2. Dept. of Horticulture , Guangx i Univ ersity , Nanning
530005, China )
Study on Genetic diversity of Frankia strains from symbiotic nodules of Myrica rubra. Journal o f
Zhejiang Univ ersity ( Ag ric. & Life Sci. ) , 2002, 28( 6): 659-663
Abstract: T en isolates of Frank ia from symbio tic nodules o f Myrica rubra w ere studied on their pheno-
types and RFLP analyses of their PCR products amplified from 16S rDN A by restriction enzymes Hinf
Ⅰ and HaeⅢ . The results show ed tha t the re a re differences not only in their pheno types but also in
th eir gene types among the ten iso lates o f Frankia. Ther e ar e also differ ences in phenot ypes and gene
types among strains o f Frank ia iso la ted fr om the sam e nodule of Myrica rubra va r. puji at differ ent
time w hich may be different g ene gr oups. The results o f their phenotypes and RFLP analyses of their
PC R products amplified f rom 16S rDN A o f ten iso la tes of Frankia from symbio tic nodules o f Myrica
rubra sh ow ed ample genetic div ersity.
Key words: Frank ia; g ene tic div er sity; RFLP; Myrica rubra
　　杨梅 (Myrica rubra )是我国特产经济林果 ,
是一种与 Frankia放线菌共生结瘤固氮的植
物 ,其根瘤具有较强的固氮能力 .国内外对杨梅
根瘤的固氮能力 [1, 2 ]、肥料对杨梅根瘤固氮的
影响 [3 ]以及从杨梅根瘤中分离 Frank ia菌株 [4 ]
等方面进行过研究 ,但对杨梅根瘤中的 Frank i-
a菌株的遗传多样性的研究未见报道 . 依据原
核生物 16S rDN A序列的保守性 ,将扩增的
16S rDN A片段进行酶切 ,然后通过酶切图谱
分析菌间多样性 ,这是近年来发展起来的分析
菌间多样性的一项现代生物技术 . Huguet等利
用此技术对香杨梅 (Myrica gale )根瘤 Frank ia
菌的多样性进行过研究 ,结果发现存在丰富的
遗传多样性 [5 ] . 刘忠等应用 ARDRA技术对沙
棘、木麻黄、赤杨、沙枣、香厥木等植物中分离的
12个分离株的遗传多样性进行过研究 [6 ] . 本文
对已分离鉴定的杨梅根瘤 Frankia分离株研究
其培养特性差异 ,并根据 Frankia菌的 16S rD-
N A序列设计引物进行 PCR扩增 ,对扩增产物
进行酶切图谱分析 ,以期从分子水平上阐明其
遗传多样性 .
1　材料与方法
1. 1　菌　株
　　本试验选用从杨梅根瘤中分离获得的 10
株 Frankia菌分离株纯培养物 ,其中 MPC11、
MPC12、 M PC16、 M PC120、 M PC121、 M PC123、
MPC163分离自浙江慈溪荸荠种杨梅根瘤 ,
M PA11、 MPA12分离自浙江安吉的荸荠种杨
梅根瘤 , M DA21分离自浙江安吉的东魁杨梅
根瘤 . Mg+ 分离自香杨梅根瘤 (中国科学院沈
阳应用生态研究所张忠泽教授惠赠 ) .
1. 2　菌株培养
　　将供试菌株分别接种在改良的 Qmod固
体培养基 [7 ]上和以 0. 5%葡萄糖为碳源、 0. 5%
酪蛋白水解物为氮源的 BAP液体培养基 [8 ]中 ,
在 25℃下暗培养三周 ,观察菌株颜色变化 .
1. 3　Frankia菌基因组 DNA提取
　　将供试菌株接种在 BAP液体培养基中 , 25
℃下暗培养 2～ 3周 , 6 000 g离心 10 min,收集
菌体 ,用无菌水洗涤 2次 ,再用 pH 8. 0的 TE
( Tris 50 mmol /L, EDTA 20 mmol /L)缓冲液
洗涤 1次 ,收集菌体 ,加 2× CTAB提取缓冲液
( 2% CTAB, 100 mmol /L Tris-HCl, 20
mmol /L EDTA, 1. 4 mol /L NaCl, pH8. 0)在
灭菌的研钵中充分研磨 ;转入离心管中 , 65℃
水浴 1 h , 6 000 g 离心 5 min 2次 ,收集上清
液 ,加等体积的氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1)溶液 ,充
分混匀 , 13 000 g离心 20 min,收集水相 ,加入
1 /5体积的 5% CT AB缓冲液 ( 5% CTAB,
0. 35 mo l /L NaCl )充分混匀 , 65℃水浴 10
min,加入等体积的氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1)溶液
抽提一次 , 13 000 g离心 20 min,收集水相 ,加
入 1 /10体积的 3 mol /L NaAc和 2倍体积的
乙醇沉淀 DNA, 用 70%乙醇漂洗 , 自然干燥 ,
溶于 RNase的 T E缓冲液 ( pH 7. 5)中 , 0. 8%
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的质量 . 如有杂质
或 DNA降解 ,则用等体积的饱和酚抽取一次 ,
再用氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1)溶液抽提一次 , 1 /10
体积的 3mol /L NaAc和 2倍体积的乙醇沉淀
DNA, 用 70%乙醇漂洗 , 自然干燥 ,溶于
RNase的 T E缓冲液 ( p H 7. 5) .
1. 4　 16S rDNA PCR扩增
　　选用 1对引物
fD1: 5′-ccgaat tcg tcgacaacAGAGT T TGATCCTGGCTCAG-3′
rD1: 5′-cccgggatccaagct tAAGGAGGTGA TCCAGCC-3′
进行 PCR合成 (上海生物工程有限公司 ) ; PCR
反应体系为: 10× PCR Buffer for Taq Plus
5μL , DN A模板 1μL,引物各为 50μmol /L ,
dN TP 0. 1 mmol /L, Taq Plus DN A聚合酶 (上
海生物工程有限公司 ) 2. 5 U,加水至 50μL,反
应在 HyBaid的 PCR Express扩增仪上进行 ,
首先 94℃变性 3 min;然后 94℃ 1 min, 60℃
45 s. , 72℃ 1 min, 35个循环 ;最后 72℃ 10
min. 取 5μL PCR产物于 1. 0%琼脂糖凝胶电
泳并照相 .
1. 5　 RFLP
　　选用 2种限制性内切酶 HinfⅠ 和 HaeⅢ
分别对 11株 Frank ia菌的扩增产物进行酶切 .
酶切反应体系为: PCR扩增产物约 1μg ,内切
酶 2μL,内切酶缓冲液 2μL,加水至 20μL,反
应混合物在 37℃的培养箱中酶切 12 h,然后加
2μL Loading Buf fer终止反应 ,用含溴化乙淀
的 2. 5%琼脂糖凝胶电泳并照相 .
2　结　果
2. 1　各菌株在培养基上的颜色
　　不同的菌株在改良的 Qmod固体培养基
和以 0. 5%葡萄糖为碳源、 0. 5%酪蛋白水解物
为氮源的 BAP液体培养基中 25℃下暗培养 3
周后 ,菌株之间颜色差异较大 (见表 1) .
660　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 8卷　
表 1　杨梅根瘤 Frankia菌分离株在培养基上
培养 3周后呈现的颜色
Table 1　 Colours of Frankia i solates cultured on the
dif ferent media fo r three w eeks
菌株 改良的 Qmod固体培养基 BAP液体培养基
M PC11
M PC12
M PC16
M PC120
M DC121
M PC123
M PC163
M PA11
M PA12
M DA21
菌落正面咖啡色 ,反面淡黄色
菌落正面褐色 ,反面淡黄色
菌落及培养基均变为褐色
菌落黑色 ,培养基变为蓝黑色
菌落咖啡色
菌落咖啡色
菌落橙色
菌落无色或绿色 ,培养基绿色
菌落桔黄色
菌落黄色 ,培养基变为褐色
菌体褐色
菌体无色
菌体褐色
菌体浅紫色
菌体褐色
菌体深褐色
菌体橙色
菌体粉红色
菌体淡黄色
菌体粉红色
2. 2　 PCR扩增
　　以引物 fD1和 rD1对 11株 Frankia菌分
离株进行 PCR,均能得到具有重复性好且稳定
清晰的 1 500 bp左右的特异带 .
2. 3　扩增产物的酶切图谱
　　扩增产物经 HinfⅠ和 HaeⅢ分别酶切后 ,
经 2. 5%琼脂糖凝胶电泳 ,可分别获得 3～ 8条
和 3～ 11条比较清晰的条带 ( 72 bp以下的条
带不包括在内 ) ,其酶切图谱见图 1A和图 1B.
2. 4　菌株间相似率比较
　　根据酶切图谱 ,按 Nei [9 ]提出的菌株间同
源性计算公式 ,可在分子水平上计算菌株间的
相似性 . 计算结果见表 2和表 3 .
A— Frankia菌扩增产物 HinfⅠ 酶切图谱 ; B— Frankia菌扩增产物 HaeⅢ酶切图谱
　　M: Mark erφX174-HaeⅢ ; Lane 1～ 11: Frankia s trains M PC11, M PC12, M PA11, Mg+ ,
M PA12, MDA21, M PC16,M PC120, M PC121, M PC123, M PC163
图 1　Frankia菌扩增产物经 HinfⅠ 和 HaeⅢ酶切的电泳图谱
Fig. 1　 Agaros e gel elect rophoresis of PCR products of 16S rDN A diges ted wi th HinfⅠ and HaeⅢ
　 表 2　Frankia菌间相似率比较 (HinfⅠ )
Table 2　 Similarit y betw een st rains of Frankia ( HinfⅠ ) %
菌株 M PC11 M PC12 M PA11 Mg+ M PA12 M DA21 M PC16 M PC120 MPC121 M PC123 M PC163
M PC11 100
M PC12 71. 4 100
M PA11 77 77 100
Mg+ 20 20 22. 2 100
M PA12 66. 7 66. 7 72. 7 25 100
M DA21 83. 3 66. 7 72. 7 25 80 100
M PC16 53. 3 40 43 18. 2 61. 5 61. 5 100
M PC120 80 66. 7 71. 4 18. 2 61. 5 61. 5 62. 5 100
M PC121 71. 4 71. 4 91 25 60 80 46. 1 77. 8 100
M PC123 66. 7 66. 7 72. 7 25 60 80 61. 5 61. 5 80 100
M PC163 54. 5 36. 4 40 28. 6 44. 4 44. 4 66. 7 50 44. 4 44. 4 100
661　第 6期 　 何新华 ,等　　杨梅根瘤 F rankia菌分离株的遗传多样性研究 　 　　　　
表 3　Frankia菌间相似率比较 (HaeⅢ酶切 )
Table 3　 Simi lari t y b etw een s t rains of F rankia ( HaeⅢ ) %
菌株 M PC11 M PC12 M PA11 Mg+ M PA12 M DA21 M PC16 M PC120 MPC121 M PC123 M PC163
M PC11 100
M PC12 100 100
M PA11 100 100 100
Mg+ 0 0 0 100
M PA12 66. 7 66. 7 66. 7 28. 6 100
M DA21 60 60 60 25 88. 9 100
M PC16 50 50 50 14. 3 53. 3 62. 5 100
M PC120 50 50 50 20 72. 7 66. 7 44. 4 100
M PC121 66. 7 66. 7 66. 7 0 75 66. 7 53. 5 54. 5 100
M PC123 44. 4 44. 4 44. 4 0 50 44. 4 40 36. 4 75 100
M PC163 40 40 40 25 66. 7 40 25 66. 7 44. 4 44. 4 100
3　讨　论
3. 1　菌株表型的多样性
　　本实验选用的 10株 Frankia菌分离株纯
培养物在改良的 Qmod固体培养基和 BAP液
体培养基上培养 ,颜色差异较大 ,同一菌株在不
同固体培养基和液体培养基中的颜色不同 ;来
自不同地点和不同园艺性状品种的杨梅根瘤
Frankia菌分离株在相同的培养基上生长 ,也
呈现不同的颜色 . M PC11、 MPC12、 MPC16、
MPC120、 M PC121、 MPC123、 MPC163分离株
是从同一株荸荠种杨梅根瘤中在不同时间分离
获得的 Frankia菌分离株 ,但菌株的颜色也不
一样 . 也就是说 ,从杨梅根瘤中分离获得的
Frankia菌分离株表型存在差异 ,菌株间呈现
出丰富的多样性 .
3. 2　Frankia菌的遗传多样性
　　由于菌株间表型存在明显差异 ,为了弄清
这些菌株之间是否存在基因型之间的差异 ,利
用 2条原核微生物 16S rDN A特异性引物
fD1、 rD1, 对从杨梅 根瘤中分离 的 10个
Frankia菌分离株进行 PCR扩增 ,然后进行
RFLP分析 . 从 PCR结果来看 ,所有菌株均得
到一条大约 1 500 bp左右的片段 ,但从酶切图
谱来看 ,菌株之间存在差异 ,除参考菌株 Mg+
外 ,供试的 10个分离株之间相似性在 36. 4%
～ 100% ;用 HinfⅠ酶切 ,在 210 bp左右和 75
bp左右处有 2条共同条带 ,用 HaeⅢ酶切 ,在
150 bp和 75 bp左右处有 2条共同带 .
　　从图 1a和图 1b来看 , 2个酶切图谱均显
示 , M PC11、 MPC12、 MPC121、 MPA11、
M PA12、 MDA21六个菌株之间的同源性绝大
多数在 67. 7%以上 ,接近 70% ,有的菌株之间
的同源性达 80%以上 , 根据 Wayne等认为
DNA同源值在 70%以上 ,则属于同一基因
种 [ 10]的原则 ,可将这 6个菌株划为 1个基因
种 ,但酶切图谱仍有较大的差异 ,且所选的内切
酶不同 ,所得的条带也不同 .而这 6个菌株与另
外的 4个菌株 MPC16、 MPC120、 MPC123、
M PC163的同源性较低 ,特别是用 HaeⅢ酶切
的同源性更低 . M PC16、 MPC120、 MPC123和
M PC163之间的同源性也较低 ,很难将其归为
一个基因种 . 从杨梅根瘤获得的 10个 Frankia
菌分离株纯培养物与参考菌株 Mg+ 之间的同
源性较低 ,在 0% ～ 28. 6%之间 .
　　从以上结果来看 ,供试的 10个 Frankia菌
分离株纯培养物不仅表型不同 ,而且基因型也
存在差异 . 即使从同一株荸荠种杨梅根瘤中在
不同时间分离获得的 Frank ia 菌分离株
M PC11、 M PC12、 M PC16、 MPC120、 MPC121、
M PC123、 M PC163,不仅表型存在差异 ,而且从
酶切图谱来看 ,它们的基因型也存在较大的差
异 ,有些菌株之间的同源性较低 ,可能属于不同
的基因种群 .
　　另外 ,供试的 10个菌株除表型和基因型存
在差异外 ,其利用碳源、氮源等生理生化特性也
存在一定的差异 (另文发表 ) .
　　无论是从菌株表型分析 ,还是 PCR产物的
RFLP分析 ,从杨梅根瘤中分离获得的 Frankia
662　　　　 　 浙 江 大 学 学 报 (农业与生命科学版 ) 　 第 2 8卷　
菌分离株存在着丰富的遗传多样性 . PCR-
RFLP技术不仅能有效地实现 Frankia菌多样
性的鉴定 ,而且通过酶切图谱的分析 ,可以实现
Frankia菌种间在分子水平的划分 .
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