全 文 ：第 15 卷 第 3期
1 9 8 了年 5 月
东 北 林 业 大 学 学 报
J OU R N AL OF NORT H龙 AS T F OR E ST RY U IV E NR S IT Y
vo 一 5 ` N, J
M a y 盆, 公了
杨 梅 根 瘤 分 离 菌 的 形 态
观 察 和 纯 培 养 `
蒋建德 赵振英 朱宝琴
(中 国 科 学 院 林 业 土 维 研 究 所 )
’ 【摘 要 】
从杨梅 (对 乡, r i e a r o b r 。 ) 根瘤获得的分离菌 F , a : 未f a I F S 1 6 2 4 0 2能够在宿主植物根系
上结瘤 , 并且具有固氮能力 。 它和其他弗兰克氏菌不同 , 在 Q M O D 培养基上 , 形成扩展而
稀疏的基内菌丝 。 菌丝粗细不均匀 , 通常 l一 2件 , 粗的可超过 2 . 5卜 , 内含脂滴 , 革兰 氏 阳
性反应 , 无 色素 , 抱子囊通常桑湛衫 10 火 20 协 , 在虎泊唆咋炭原很定嗜养基上 , 诱 导 出了
大戛泡子蒸 , 抱 子系衫戈箱虱形 , 1一 .1 3卜。 固氮囊泡为司球形 , 表面光滑 , 直径 2 . 5一 5 , 。
在纯培养中有机氮远优于无机氮 , 最好的氮源是酶解蛋白陈 , 以丙酮酸作 碳 源 比 通 用 的
Q M O D 培养基生长量大 . 70 倍 , 也远比吐温 80 作碳源为好 。 出人意料 , 在丙酸上只表现出有
限的生长 。
前 言
非豆科树木的固氮属共生固氮范畴 , 它具有比自生固氮菌还高的固氮 活 性 。 近 年
来 , 分离根瘤内生菌取得了突破 , 引起 了世 界各国科学家的关注 , 但 由于对这类固氮放
线菌生物学属性知之不多 , 到 目前为止 , 世 界上仍有一率以上的寄主的根瘤 内生菌末被
分离出来 。 而杨梅 ( M 夕: i e a r 亡 n l s兮l , a : : i c a ) 根瘤内生菌 是 L e e h e v a l i e r , y . 〔’ 首先
获 得 纯培养的 ( 1 9 7 9) 。 我们经反复试验从 我 国 南 方 红 杨 梅 ( M犷 i阴 1u 乙翔 iS e d &
z u e e ) 的根瘤中获得了分离菌 F : a 戚 f a I F S奥1 6 2 4 0 2 (原菌名 17 , a滋丁a s p . M r c 8 3 o Z ) ,
分离菌回接到原宿主幼苗根系上形成了典型约杨梅型根瘤 , 即每一瘤瓣上带一负向地性
的瘤根 。 从乙炔还原法测定其固氮活性和无氮培养都显示出分离菌不仅能感染宿主而且
形成的根瘤具有固氮能力 (因幼苗培养欠佳 , 根瘤的乙炔还原活 性 为 .0 叔召 C , H ; /克
根瘤鲜重 · 小时 ) 。 目前 , 分布在我国的非豆科固氮树木的六个属中 , 赤杨属 、 胡颓子
属 、 沙棘属和木麻黄属的根瘤分离菌 己有描述 , 但杨梅的分离菌还末见报导 , 为此我们
把杨梅分离菌和其他弗兰克氏菌作了形态学的比较 。
对于摸清分离菌的培养条件 、 加快培养进程 , 进一步探索其生物学特性 , 这不仅为
下一步的研究打下基础 , 而且也为 日后生产菌剂创造了条件 。
谷 姚建华参加部分工作 , 毕 庶春提供 电镜照片 , 钟玉 华 、 杨碧芳 、 吴铁铮 、 苏州蚕丝 专科学校 病理教 研组曾
给予 帮助 , 一并致 以感资 。
1 1 4 东 北 林 业 大 学 学 报 第15 卷 .
材料和方法
杨 梅 ( 叮g r i c o r动 ;。 ) 根瘤采自苏州洞庭东山 4 年生 的 幼 苗 。 分 离 培 养 基 为
Q M O D 〔 2 〕 , 根瘤经洗净 、 表面消毒 、 剥皮后把根瘤皮层细胞团块接种于琼脂斜面上 。
分离菌的氮源实验 是 以 Q M O D 为 基 础 培 养基 , 不同 的 氮源 分 别 为 : N H 4 CI
20 m g / L
,
K N O 3 3 7
.
8 m g / L
, 尿素 1 1 . 23 m g / L , 鱼蛋白膝 (上海东海制药厂 ) , 牛肉汁
(英国进 口 ) , 酪蛋 白水解产物 (酸水解 自己制备 ) , 精解蛋 白陈 (上海禽蛋二厂 ) 有机
氮源均为 g5 / L 。 实验是在液体培养基 中进行 , p H 6 . 5 , 每支试管定量加人 4m l 的液体
培养基 , 除尿素用过滤器过滤灭菌外 , 其余均是在 。 . 7个大气压下灭菌 20 m i n , 定量接
种分离菌后培养在 27 ℃ 下 2 个月 。 生长量是以至少 10 支以上的试管总菌量 , 经过滤或
离心 , 收集菌体 , 洗涤 , 在 60 ℃一 70 ℃烘干 , 称其相对干重 , 求出每支试管的平均生长
量 , 或换算成每升菌液菌体干重 。
碳源实验也是以 Q M O D 为基 础培养基 , 但 把有机氮改为 N H oC I 1 . 5 9 / L , 柠檬酸
铁改用 F e S O二 7 H ZO l m g / L , C a C 0 3 改以 C a C 12 · ZH止0 l o o m g / L 。 p H 6 . 5 , 分 别
用 20 多种不同的搪 、 醇和有机酸作碳源 1 0 9 / L ,* 以细菌过滤器去除杂菌 , 然 后 和 无机
成分混合并分装于试管 中。 其他培养条件如氮源实验 。
固氮泡囊 ( V e s i c l e ) 的诱导 , 经液体培养约一个半月的杨梅分离菌 , 以 较 大的接
种量 , 接种在以唬拍 酸 、 丙酮酸 、 丙二酸为碳源的 J . D . T j e p k e m a 〔 3 〕限定培养基上 ,
p H .6 8, 27 ℃ 下培养 7一 14 do 注人乙炔 , 在 25 ℃ 培育 2 h , 迸行固氮酶活性的乙炔还
原法测定 。 并进行相应的形态观察 。
回接结瘤实验 , 因杨梅苗在沈阳不能自然结瘤 , 所 以用灭过菌的土壤作杨梅实生苗
的营养介质 。 回接方法及根瘤固氮活性的测定同四川恺木 〔 4 〕。
p H 实验以吐温 80 为碳源 , 以酪蛋 白水解物为氮源 , 在 p H 4一 8 危围内观察长势 。
综合培养实验还以丙酸盐 、 丙酮酸 、 吐温 80 作碳源 , 用不同 p H 、 氮源组合 , 探索
最 生培养条件 , 以加速培养菌的生长与发育 。
二 、 结果与讨论
1
. 形态观察 ( 尸r an 打。 ) 是一类具有明 显特征足 以和其他放线菌加以区别的有机体 ,
尽管弗兰克氏菌本身在形态上是十分相似的 。 然而杨梅分离菌 F。 以扣 I F S 1 6 2 4 0 2 和
其他属宿 主分离菌有着明显不同的地方 。 在 Q M O D 培养基上 , 菌丝不在培养基表面生
长 , 几乎全部在培养基之下形成基 内菌丝 。 菌丝在培养基内扩散 、 分布稀疏 , 形成质地
松散为菌落 , 以至肉眼往往不易看出 , 当对着光源时才清晰可辨 , 分离后 4心d 菌落直径
已可达 s m m , 这和紧密的恺木分 葛菌菌落明显不同 。 显然它们是一类能忍受低氧分压
的微生物 。 在光学显微镜下 , 菌丝粗细分明 , 通常 为 l一 1 . 2召 , 有 一些 粗的菌丝可达
2
.
5 ,、 , 但 直 径 不均匀 , 以至形如链伏 , 这 倒阳木麻黄分离菌十分相似 。 菌 丝 分 枝有
隔 , 没有色素 , 革兰氏泪性反应 。 在粗菌丝中可见折光性强的颗粒内含物 , 用苏丹黑 B
第 3 期 杨梅根瘤分 离菌的形态观察和纯培养 1 1 5
染色 , 证明这些球形内含物为脂肪滴 。 在较粗 的菌丝体上通常能形成特征性的抱子囊 ,
抱子囊通过一抱子囊柄和菌丝相连 , 杨梅分离菌成熟的抱子囊呈长园群, 抱子以纵横分
裂形成隔 , 以至于和桑堪果十分相象 (见图 1 ) , 通常 10 x 2 .0l , 但 在其他培养 基上则
形 成不规则形状的抱子囊 。 从抱子囊巾散发出来的抱子园形或椭 园 形 , 1 . 3召左 右 ( 见
图 l 杨 梅根瘤分 L打 J省的菌 丝 未抱 子囊 、 l 。 图 2 厂 r a n 左` a I F S 一6 2 4 0 2 、 破碎 的抱子
囊 和外露的抱子 ( 电镜 x 18 6 4 )
图 2) 。 当在液体培养基中培养时 , 菌落球形沉于底部 , 生长 2 个 月直径约 4一 s m 二 , 以
后亦不见增大 , 菌落质地疏松 。
在贫氮限定培养基上可诱导出固氮泡
囊 , 经镜检仅有 为数不 多的固 氮 泡 囊 形
成 , 泡囊为直径 2 。 5一 5召 的 园 球 体 , 表
面光滑 , 有一长约 2一 5 ,` 的 短 柄 和菌 丝
相连 。 但在加丙二酸盐的限定培养基上 ,
不仅末见固氮泡囊的形成 , 就是抱子囊也
十分稀少 。 显然这是丙二酸盐使氧化途径
受阻 , 从而得不到能量来源 。
图 3 在玻拍 酸为碳源 的限定培养基上诱 导出分离 在 以珑拍 酸为碳源的限定培养基上 ,
菌的成片抱子囊 (显 微照片 x 2 40 ) 诱导出了大量不规则形的大抱子囊 , 镜检
时几乎充斥整个视野 ( 见图 3) 。 一般抱子囊可达 3 7 . 5 x 62 . 5 ,` , 长形抱子囊 32 . 5 x 51, ,
所见抱子囊最大可达 72 . 6 x 50 尽 ( , 大量抱子的产生 , 这对今后根瘤菌剂的生产无疑是有
益的 。 从欧洲赤杨的感染实验 获知 , 有抱子的根瘤比不产生抱子的根瘤感染宿主的能力
高 1 0 0 0 倍 〔 5 〕。
2
。 氮源实验 以 Q M O D 为基础培养基 , 不同的氮源对杨梅分离菌生长 量 的 影 响
( 见表 1 ) 。
1 16 东 北 林 业 大 学 学 报 第 51 卷
表 1 不同氮源对杨梅分离菌生长的影响
二一叹一蛋谎一上吓葬士一 ’ !一卒 一邑一兰份少-敷薰 … . ’薰 ……器 /卜求
虽由于用葡萄糖作为碳源 , 使菌体的生长量受到了限制 , 但从称量结果或从肉眼即
可清楚地比较出 , 杨梅分离菌对有机氮的利用要比无机氮要好得多 , 前者形成团聚状菌
落 , 生长量且较高 , 而后者为无菌落结构的 “ 沉积物 ” 。 而在有机氮中 , 精解蛋 白陈效果
又最好 , 用作分离菌的氮源是合适的 。 总之它不像木麻黄分离菌对氮源的选择那样专一 。 -
表 2 不同碳派对分离菌生长影晌的观察 .3 碳源实验 实 验 也以
碳 源
对照 ( 不加碳源 )
生长情况 } 碳 源 ! 生长情况
糖醇酸醉D 一木
醉三露
肌丙赤甘
+
+一十糖子芽棉乳麦蔗
D一山梨搪
D 一半乳糖
D 一葡萄糖
D 一果 糖
了一 鼠李搪
D一甘露糖
乙
苹
反丁烯二酸
丙 酮 酸
吐 温 8 0
十
+
+ + 十
注 : ` 一 ” 几乎不长 “ 十 ” 微量生长 (镜检 ) ` 十十 ” 稍生长 (肉
眼 可见 ) “ 十十十 ” 大量生长 。
Q M O D 为基础培养基 , 比 较
了不同的搪 、 醇 、 酸对分离菌
生长的影响 , 最终进行了定性
的比较和相应的观察 。 实验结
果 (见表 2) 。
从表中可看出 , 作为分离
菌的碳源 , 绝大部分糖 、 醇 、
酸是不合宜的 。 长时期生活在
特定的根瘤环境条件下 , 对碳
源的利用比较单一 , 因此要比
普通微生物适应范围来得狭 。
分离菌相对能较好地利 用蔗
糖 , 菌落菌丝生长正常 , 能形成典型的弗兰克氏菌的抱子囊 , 大小可达 5 0 X 1 2 . 5声。 而
吐温 80 对 杨 梅分离菌的生长 , 远远超过其他碳源 , 能形成大量的菌丝体 , 在显微镜下
菌丝出现明显的短隔 , 以致于似乎断裂 。 不能形成典型的 1F 翻k ia 抱子囊 , 有时仅在幼
嫩的菌丝间出现膨大 , 形成约 5召左右的小园球 。 这些形态或培养特征和典型的弗兰克
氏菌差异很大 。 但这同时给我们一个启示 , 利用 吐 温 80 可以培养足够数量的菌丝体 ,
然后把这些菌丝体转移到以珑拍酸为碳源的贫氮限定培养基上 , 则可获取大量的抱子囊
抱子 。 以杨梅分离菌的培养特性为基础 , 通过用二步培养法来制取根瘤接种体应该说是
可取的 。
总之 , 碳源是至关重要的 , 一旦改善碳源 , 生长将大大加速 , 以往所用的 Q M O D
培养基 , 其碳源是葡萄糖 , 这是菌体不能得以快速生长的主要限制因子 。
4
.
p H 实验 通过不同的梯度实验得 出 : p H 4一 4 . 5 或 p H S一 8 。 5 菌体已不生长 ,
p H 7
.
5 时生长较差 , p H 5 . 5一 6 . 7 时菌体生长最好 , 是适宜生长的最佳 p H 范围 。
5
. 综合培养实验 在以上单项实验的基础上 , 综合各因素 , 以探讨加速 杨 梅分离
菌的生 长和繁殖 。 当用吐温 80 作碳源 , 其他条件按照 QM O D 培养基 , 菌体生长任盛 ,
第 3期 杨梅根瘤分离菌的形态观察和纯培养 1 1 7
、
生长比在 Q MO D 上大为改善 , 但并非最佳 。 当用丙酮酸作碳源 , 精解蛋白 陈 作 氮 源
时 , 加少许维生素 (B : 、 B艺 、 B 。 、 芋酸 、 生物素 o . l m 酬 L ) , p H 调到 6 . 7 , 这样的组
合分离菌的生长十分突出 , 整个液体培养基中 一长满了球形菌落 , 静止培养二个月 , 菌体
生长量高达 1 . o g m g 干重 4/ m l 菌液 , 而生长在 Q M O D 培养基 的杨梅分离菌 , 在同样条
件下菌体干重仅 o . 01 5 m g干重 / 4 m l 菌液 , 生长量竟提高了 70 多倍 。 显然杨梅分离菌 是
利用丙酮酸 , 通过三狡酸循环进行彻底氧化的 。
最近 , 国外推荐并广泛使用丙酸作为弗兰克氏菌的碳源〔 。 〕 , 我们曾把 Q M O D液体
培养基 中的碳源改为丙酸 , 但出人意料 , 分离菌的生长和繁殖都不理想 , 菌体不形成菌
落 , 生长量亦少 。 这说明分离菌缺少把丙酸转换成丙酮酸的酶类 , 从而不能连接这条氧
化途径 , 使分离菌代谢受阻 ,
参 考 文 献
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1 18 东 北 林 业 大 学 学 报 第5 1卷
MO R P H O O LG I C A O LB S ER V A T I O N P U R E
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U n d e r Q M O D s o l i d m e d i u m
, i t e x t e n d s f e w a n d s c a t t e r e d f i l a m e n t s
w h i e h d o n o t l i k e t h e o n e s o f A l n u s i s o l a t e t h a t f o r m s d e n s e m y e e l i a l
m a t s o n a g a r s u r f a e e
.
T h e h y p h
a e a r e i r r e g u l a r i n d i a m e t e r
, u s u a l l y
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,
g r a m p o s i t i v e
, a n d l a e k p i g m e n t a t i o n
.
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n i u 1b e r r y s h a p e
, I O x Z o 那m . O n d e f i n e d m e d i u m e o n t a i n i n g s u e e i n i e
a e i d a s e a r b o n s o u r e e
, a l a r g e n u m b
e r o f s p o r a n g i a a r e f o r m e d
.
S P o r e s
a r e g l o b o s e o r s u b g l o b o s e
, 1一 1。 3召m i n l e n g t h . S p h e r i e a l v e s i e l e s w i t h
s m o o t h s u r f a e e a r e 2
.
5一 5不, m i n d i a m e t e r . T l z e i s o l a t e e u l t u r e d w i t h
o r g a n i e n i t r o g e n s 15 b e t t e r t h a n w i t h i n o r g a 只 i e n i t r o g e n s . T h e b e s t
n 1 t r o g e n s o u r e e 15 P e p t o n e e n z y m o l y s e d f r o m e g g i n o r g a n i e n i t r o g e n s
,
T h e i s o l a t e g r o w i n g i n P y r 以 v i e a e i d a s C 一 s o u r e e w e i g h s a s m u e li a s 7 0
、
t i m e s i n Q M O D m e d i u m
, w h i c h 15 m u e h b e t t e r t h a n T w e e n 8 0 t o b e a
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