全 文 ：基因组学与应用生物学，2010年，第 29卷，第 2期，第 322-326页
Genomics and Applied Biology, 2010, Vol.29, No.2, 322-326
研究报告
A Letter
刺梨花粉管萌发的荧光显微观察
王唯薇 1,3 赵德刚 1,2*
1贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室,贵阳, 550025; 2教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室,贵阳, 550025; 3贵州大学生命科学
学院,贵阳, 550025
*通讯作者, dgzhao@gzu.edu.cn
摘 要 花粉管作为连接柱头与胚囊的唯一结构，是外源 DNA导入的通道。因此，必须首先形成花粉管通
道，才能进行外源 DNA的导入。本研究利用醋酸洋红染色对刺梨雌蕊、雄蕊进行显微观察，并在人工授粉后
的 0.5 h、1 h、3 h、6 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、24 h和 30 h不同时期取其雌蕊，用苯胺蓝染色后进行
荧光显微观察。研究结果初步探明了刺梨人工授粉的最佳时期在花蕾露红期；其花粉管通道从人工授粉后
10 h左右开始萌发，到 18 h左右完成萌发，花粉管萌发完成后的 2~9 h是利用花粉管通道法介导刺梨遗传
转化的最佳时期。本研究结果将为花粉管通道法介导刺梨遗传转化技术体系的建立提供基础资料。
关键词 刺梨,花粉管,荧光显微
Microexamination on Pollen Tube of Rosa roxburghii Tratt. by Fluorescent
Technique
Wang Weiwei 1 Zhao Degang 1,2*
1 Guizhou Key Laboratory of Agro-Bioengineering, Guiyang, 550025; 2 Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Biological Engineering,
Ministry of Education, Guiyang, 550025; 3 College of Life Sciences, Guiyang, 550025
* Corresponding author, dgzhao@gzu.edu.cn
DOI: 10.3969/gab.029.000322
Abstract As the only structure of connecting the stigma and the embryo sac, pollen-tube is the channel for exoge-
nous DNA transport. Therefore, it must form the pollen-tube first, then transport the exogenous DNA. In our study, we
have observed the stamen and pistil ofRosa roxburghi Tratt.. bymicroscope through staining of aid magenta. Then af-
ter different periods: 0.5 h, 1 h, 3 h, 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 24 h and 30 h bymeans of the artificial pollina-
tion, we taken the pistil to the fluorescent microscope by staining with aniline blue. Preliminary results indicate that
the best artificial pollination time ofRosa roxburghi Tratt.. is the stage of buds reveal red, and the pollen-tube pathway
start germination from 10 h and finish it about 18 h after artificial pollination. It should be the best time for tansforma
tion by pollen-tube pathway of Rosa roxburghii Tratt.. All our research results would provide the foundation for
establishing the pollen-tube pathway mediated genetic transformation system of Rosa roxburghi Tratt..
Keywords Rosa roxburghii Tratt., Pollen tube, Fluorescence microscopy
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.029.000322
基金项目：本研究由贵州省国际科技合作重点项目(黔科合国字(2007)400102号)资助
刺梨 (Rosa roxburghii Tratt.)，蔷薇科 (Rosaceae)
蔷薇属(Rosa)，是一种药食两用的野生植物，原产中
国，是中国特有的新兴果树，在贵州、云南、四川、陕
西等地均有分布，尤以贵州产量最高。刺梨果实营养
丰富，含有多种糖类、维生素和氨基酸等营养成分，
由于其 Vc含量较高，被誉为“Vc之王”，具有很高的
经济价值。植物转基因技术已成为当今重要的种质
创新技术手段之一，但在刺梨遗传转化方面由于其
组织培养再生困难，迄今尚无相关研究报道。
花粉管通道法是通过在授粉后向子房注射目的
基因的 DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形
成的花粉管通道，将外源 DNA导入受精卵细胞，并
进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精
卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法是由我
国科学家周光宇(1978)提出并在棉花上成功应用的
植物转基因方法之一，目前此技术已日趋成熟，并发
挥着独特的优势，迄今已在大豆(雷勃均等, 1991)、玉
米(王罡等, 2002;邸宏, 2008)、小麦(柏锋等, 1999;张
茂银等, 2000)、棉花(谢道昕等, 1991a)、水稻(谢道昕
等, 1991b)、高粱(洪亚辉等, 1999)、烟草(丁国华等 ,
2000)、黄瓜(魏爱民等, 2008)、桃(万眷雁等, 2009)等
植物上应用并获得成功。花粉管通道转化法是一种
易于外源 DNA整合的原位生殖系统转化方法。花粉
管作为连接柱头与胚囊的唯一结构，是外源 DNA导
入的通道，因此，必须首先探明形成花粉管通道的时
间，才能确定外源基因导入的时间，从而进行外源
DNA的导入。
本研究初步探明刺梨人工授粉的最佳时期，并
通过观察刺梨花粉管通道萌发的过程，初步确定其
花粉管通道在授粉后 18 h左右完成萌发。其遗传转
化的最适时间在花粉管萌发完成后的 2~9 h左右(刘
明等, 2007)，为建立花粉管通道介导的刺梨转基因技
术体系提供了基础资料。
1结果与分析
1.1人工授粉时间的确定
在观察花粉管萌发之前，为了给定一个统一的
授粉时间，有必要对最佳人工授粉时间进行研究。刺
梨属于具有一定自花结实能力的异花授粉植物(陈明
和陈继平, 1993)。通过醋酸洋红对其雄蕊和雌蕊染色
后(图 1)，观察结果表明：在花蕾闭合期，花粉尚未成
熟，雄蕊的花药和雌蕊的柱头上均未染色，传粉还未
开始。在花蕾露红期(若为白色的花则为露白期)，花
药部分已被染成深红色，柱头上亦有少量深红色点
状，柱头染色率为 4.2% (表 1)，说明此时已有部分花
粉成熟，并有极少量花粉落在柱头上，传粉刚刚开
始。在开花期，花药及柱头均被染成深红色，柱头染
色率为 94.4% (表 1)，说明传粉早已开始。在花粉与
柱头的识别过程中，柱头会分泌一种粘液将花粉粘
附，在花蕾露红期，传粉刚开始，且刺梨雌蕊柱头逐
渐分泌粘液，因此是人工授粉的最佳时期。
1.2花粉管生长的观察
在显花植物授粉过程中，花粉落在柱头上粘附
后，花粉在柱头上开始水合并萌发花粉管。花粉管在
花柱内生长时会产生大量的胼胝体塞，采用荧光显
微技术，在WU (宽带紫外光)激发下产生强烈荧光。荧
光显微观察结果如图 2，刺梨在人工授粉后 10 h左右
花粉管开始萌发，在最初的几个小时，花粉管萌发缓
慢，可能是物质(如脂类物质、钙等)积聚的过程(孙颖和
孙大业, 2001)，随后沿花柱向子房延伸，在人工授粉后
18 h左右时，可以观察到花粉管已延伸进子房。
2讨论
植物授粉过程是一个非常复杂的过程，从花粉
落在柱头上开始，需要经过粘附、识别、水合、萌发,花
图 1醋酸洋红对刺梨不同花期雄蕊和雌蕊染色
注: A,B,C:花蕾闭合期; D,E,F:花蕾露红期; G,H,I:开花期
Figure 1 The stamen and pistil of Rosa roxburghi Tratt staining
by aid magenta during different periods
Note: A,B,C: The closed stage of bud; D,E,F: The reveal red stage
of bud; G,H,I: The bloom stage of bud
表 1醋酸洋红对不同花期刺梨雌蕊染色情况
Table 1 Staining effect by aniline blue in different periods of the
Rosa roxburghi Tratt.
注: Ⅰ:花蕾闭合期;Ⅱ:花蕾露红期; Ⅲ:开花期
Note: Ⅰ : The closed stage of bud; Ⅱ : The reveal red stage of
bud; Ⅲ: The bloom stage
雌蕊镜检个数
Number of pistil
115
120
107
被染色柱头个数
Number of stained
stigma
0
5
101
染色率(%)
Staining rate (%)
0
4.2
94.4
花期
Time of
flower
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
刺梨花粉管萌发的荧光显微观察
Microexamination on Pollen Tube ofRosa roxburghii Tratt. by Fluorescent Technique 323
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
粉管在花柱内生长,直至到达子房发生双受精作用。研
究发现花粉管壁的伸展集中在花粉管尖端(Derksen et
al., 1995)。花粉管尖端生长的观点已被普遍接受。因
此，花粉管是否成功萌发决定了受精作用能否成功
完成。在花粉管延伸进胚囊的过程中，外源 DNA可
以被花粉管吸收，若该外源 DNA进入胚囊并参与
受精，基因的转化就可能发生(曾君祉等, 1998)。周光
宇等(1979)提出了 DNA片段杂交假说,认为当外源
DNA沿着花粉管进入胚囊以后被分解成片段，大部
分片段会被降解，幸存的 DNA片段可能以冈崎片段
的方式整合到受体的染色体上，参与受体性状基因
表达的调控或数量遗传。另外，万文举等(1992)认为，
外源 DNA导入具有基因转移和诱变双重作用。郭光
荣(1994, 作物研究, 8(2): 15)认为，外源 DNA 整合
时，受体染色体 DNA必须断裂为外源 DNA片段提
供“座位”。虽然目前科学家关于花粉管通道介导外源
DNA导入受体的整合机理尚未达成共识,但可以肯定
的是外源 DNA的部分片段一定能够整合到受体基因
组中。花粉管通道法介导外源基因导入技术首先在棉
花上应用成功(周光宇, 1993,农业分子育种研究进展,
pp.15-16)，之后在大豆、玉米、高粱上也获得成功。
目前，刺梨花粉管萌发的研究尚未见报道。明确
刺梨花粉管通道形成的时间为花粉管通道法介导刺
梨遗传转化技术体系的建立奠定了基础。目前，我们
已运用该技术在刺梨上进行了外源基因的转化，收
获种子 400余粒，希望获得刺梨外源基因整合的转
基因种子。
3材料与方法
3.1供试材料
实验植物材料为贵州大学农学院种植 4年的贵
农 5号刺梨。贵农 5号刺梨是一个优良的品种，果实
较大，其 Vc含量较其它刺梨种类高，目前推广最为
广泛，具有独立知识产权，适宜加工。
早晨 8:00~9:00点选样并开始染色、授粉，在不
同的时间梯度进行采样。
3.2刺梨花显微观察与人工授粉时间的确定
取花蕾闭合期(花萼完全将花瓣包裹)、花蕾露红
期(花瓣略高出花萼但未展开，能够见到花瓣颜色)和
开花期(花瓣已经展开,雌蕊可见)的刺梨材料，将雄
蕊和雌蕊用 1%醋酸洋红(取 100 mL 45%醋酸加热至
沸,移去火源,徐徐加入 1 g洋红,加热回流 2~24 h,
过滤)染色后在显微镜下观察。
3.3人工授粉
在花蕾露红期，小心地将花萼、花瓣和雄蕊去
除，人工涂抹当日盛花期的成熟花粉，涂完后立即套
袋。授粉后 0.5 h、1 h、3 h、6 h、10 h、12 h、14 h、16 h、
18 h、20 h、24 h和 30 h分别采摘 3朵花，取雌蕊放入
卡诺固定液中固定。
3.4花粉管生长的观察
采用荧光显微镜法观察花粉管的生长情况。参
照魏建和等(2007)的方法并稍做改动，具体流程如
下：取新鲜雌蕊在卡诺固定液中固定 10 h，后用蒸馏
水冲洗干净，在 45℃水浴中利用 2 mol/L NaOH软化
2 h，蒸馏水冲洗 3次，然后用 0.1%水溶性苯胺蓝染
色 4 h (染色液用 2%的 K3PO4溶液配制)，取雌蕊(纵
向包括子房)置载玻片上，加 1~2滴甘油，加盖玻片
轻轻压平，用 XSZ-N107CCD型显微镜在WU (宽带
紫外光激发)下观察。
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图 2刺梨花粉管萌发与生长过程荧光显微观察
注: 1~6:人工授粉后 6 h、10 h、12 h、14 h、16 h和 18 h花粉管
萌发与生长情况
Figure 2 Germination and process of growth of pollen-tube path-
way of Rosa Roxburghi Tratt. by using fluorescent microscope
Note: 1~6: The pollen-tube pathway growth in Rosa Roxburghi
Tratt. after 6 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h and 18 h by way of artificial
pollination
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000322324
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罂粟基因的发现有可能促使便宜的止痛药出现
Poppy Gene Discovery Could Lead to Cheaper Painkillers
卡尔加里——卡尔加里大学的研究人员说，他们已经准确找到了难以找到的罂粟基因，这一发现可能
促使便宜、更普遍的止痛药出现。卡尔加里大学生物学教授 Peter Facchini表示由两个基因编码的酶困扰科
学家们至少已有 50年了，这就是植物中唯一地能产生可待因和吗啡的罂粟的特有的两个基因。可待因和吗
啡是世界上最广泛使用的止痛药。
科学家已经用了 18年的时间研究罂粟，Facchini实验室的博士后科学家 Jillian Hagel有了遗传学的发
现。他们的研究结果于 2010年 3月 14日公布并将刊登于《Nature Chemical Biology》网络版上。
在生物体中寻找有显著特点的基因，诸如乳腺癌或囊性纤维化基因，对于解决问题或使用新技术重要
的第一步。大多数可待因用于药学上。它是通过植物吗啡和化学转换成可待因方法产生的，随着罂粟植物遗
传学上的发现，科学家有可能创造出停止产生可待因的植物来消除了生产止痛药一些额外的工作。能够产
生封闭可待因的罂粟品种能够降低止痛药生产成本。 Hagel使用高科技基因组学技术在可待因 O-demen-
thylase酶作用前将载片上 23 000种不同的基因进行分类。O-dementhylase酶是一种能将可待因转化为吗啡
的植物酶。 Facchini已经为这个发现申请了专利，他说下一步实验就是使用该可待因基因在酵母或细菌中
生产医药品——完全绕开植物本身。这项研究仍然处于早期阶段。
Facchini透露可待因是世界上最常见的鸦片。世界上大约 80%的可待因和吗啡是由 6个国家包括加拿
大消费的。然而，加拿大是从很多种植罂粟的国家如法国、澳大利亚进口所有鸦片。仅加拿大人每年消费含
药剂的可待因就超过 100万美元。该基因的发现可能会降低药品的成本。
编译者：周一奇,本刊通讯员
DOI：10.3969/gab.029.000326
本文引用格式：周一奇, 2010,罂粟基因的发现将促使便宜的止痛药出现,基因组学与应用生物学, 29(2): 326
信息来源：http://www.vancouversun.com/technology/Poppy+gene+discovery+could+lead+cheaper+painkillers/
2682701/story.html
www.genoapplbiol.org
DOI: 10.3969/gab.029.000322326