全 文 ：浙江农业大学学报　 25( 2): 143～ 146, 1999
Journal of Zhejiang Agricul tu ral Universi ty
　　收稿日期: 1997-10-25
作者简介: 陈集双 , 男 , 37岁 ,在职博士 ,副教授 ,从事微
生物分子生物学研究 .
文章编号: 1000-2111( 1999) 02-0143-04
引起二月兰花叶病的芜菁花叶病毒研究
陈集双 , 李德葆
(浙江大学 生物技术研究所 , 浙江杭州 310029)
摘　要: 在表现花叶、植株矮化、茎叶坏死和畸形的十字花科观赏植物二月兰 (Orychophragmus vio-
laceus)上分离到一种线状病毒 ,其病毒粒子分布范围为 780～ 800 nm. 通过寄主反应测定、病毒提纯和
形态观察、血清学反应测定 ,确定该病毒为芜菁花叶病毒 ( TuMV) .病毒分离物 AH1回接二月兰无病毒
苗 ,引起黄斑、系统花叶、系统坏死和畸形 ,在供试十字花科植物上均产生系统侵染 ,并在洋酸桨等茄科
供试寄主上引起系统症状 . AH1与来自十字花科甘蓝型油菜上的一个 TuMV有紧密的血清学关系 ,但
在寄主反应上与之有一定差异 . 对自然发病的二月兰植株和接种 AH1分离物的系统寄主用 TuMV抗
血清进行免疫电镜观察 ,均检测到线状病毒粒子 ,用 CMV抗血清、 TMV抗血清进行检测 ,均没有发现
相关病毒 . 作者认为: TuMV即是引起二月兰花叶病的病原 . 这是 TuMV侵染该属植物的首次报道 .
关　键　词: 二月兰 ; 花叶病 ; 芜菁花叶病毒
中图分类号: S682. 31; S436. 8; Q939 [. 46]　　　文献标识码: A
CHEN Ji-shuang , L I De-bao ( Institute of B iotechnology , Zhejiang University , Hangzhou 310029, Chi-
na )
Orychophragmus violaceus mosaic caused by turnip mosaic virus. Journal o f Zhejiang Ag ricultural Uni-
versity, 1999, 25( 2): 143～ 146
Abstract: A po tyvir us was de tect ed from diseased plants o f Qrychophragmus v iolaceus symptoma tized as
mosaic, stunt, stem and fo liage necro sis and disto r tion in Hang zhou, Zhejiang during winter to la te
spring fr om 1993 to 1997. One typical iso la te ( AH1) w as identified as turnip mosaic virus ( TuMV ) ac-
co rding its bio lo gica l, mo rpho lo gica l and ser ological cha racteristics. Yellowing spo ts, sy stemic mosaic
and necr osis, and a lso severe distor tion w ere induced by back inoculation o f this v irus onto O . Vio-
laceus. When compa red with a TuMV isolate ( H1) origina lly isolated from oil-seed rape (Brassica na-
pus) , AH1 w as sero lo gica lly clo se-related, but w as differ ent f rom the this iso la te by ho st r eactions.
U sing immuno-so rbent electron micro scope ( ISEM ) method with TuMV antiser a, filamentous pa rticles
wer e easily de tect ed from na tural-infected plants o fO . violaceus or inoculated ho st plants, but no t with
antisera o f either cucumber mosaic v irus and tobacco mosaic v irus. TuMV was considered a s the princi-
pal pa thogenic vir us o f this new disease.
Key words: Orychophragmus v iolaceus; mosaic disease; turnip mosaic vir us
　　二月兰 (Orychophragmus violacus )又名诸
葛菜 ,是一种十字花科诸葛菜属 (Orychophrag-
mus )草本植物 ,可作蔬菜、油菜和花卉用 . 在长
江中下游地区主要作为观赏花卉普遍栽培 ,有
多个栽培品种 (变种或品系 ) .
　　目前国内外尚无有关该属植物病毒的报
道 ,但在十字花科其它作物 (油菜、大白菜、榨菜
等 )上则普遍存在黄瓜花叶病毒 ( CMV )和芜菁
花叶病毒 ( TuMV )的侵染 [2 ] ,在十字花科作物
上还报道有烟草花叶病毒 ( TMV )及其类似物
和蚕豆萎蔫病毒 ( BBWV)等 [3 ] .
　　 1991年以来我们发现在杭州地区栽培的
二月兰普遍遭受花叶病危害 ,且病害在早春二
至三月份最为明显 . 病株主要表现为花叶、矮
化、茎叶 (脉 )坏死并导致开花减少和不孕实 ,部
分地段发病率为 100% ,严重影响了花卉的观
赏性 .我们对感病植物材料进行多次病毒分离 ,
均获得一种线状病毒 . 现将该病毒的鉴定以及
生物学特性研究结果报道如下 .
1　材料与方法
1. 1　毒原和抗血清
　　①自然发病的二月兰病株于 1991～ 1993
年分别采自浙江花港公园、杭州花圃和浙江大
学华家池校区 ,病株用盆栽保存于防虫温室中 .
②芜菁花叶病毒分离物 ( TuMV H1)来自十字
花科甘蓝型油菜 ,黄瓜花叶病毒分离物 ( CMV
M-22)来自唇形科花卉一串红 . 以上毒原由浙
江大学生物技术研究所实验室分离并保存 [4, 5 ] ,
作为对照 . ③ TuMV, CMV抗血清和 TMV抗
血清由浙江大学生物技术研究所实验室制备并
保存 .
1. 2　病毒分离和生物学测定
　　毒原分离采用常规汁液磨擦接种方法接种
多种常规指示植物 ,或用嫁接方法接种二月兰
种子苗 [4 ] . 寄主反应测定每次接种同种供试植
物 6～ 10株 ,重复 2次 .
1. 3　病毒粒子检查
　　待检植物 (自然发病的二月兰病株或人工
接种的系统寄主 )叶组织加入等量 ( W /V ) 0. 5
mol /L, pH 7. 4磷酸缓冲液 (含 0. 5%戊二醛、
10%氯仿 )后充分研磨 ,低速离心取上清 ,然后
用 0. 2%磷钨酸 ( PT A)负染 ,电镜下检查病毒
粒子的有无和形态 .
1. 4　病毒提纯
　　参照 Hisashi之大豆花叶病毒提纯方法并
作适当修改 [6 ] ,繁殖寄主为城青二号大白菜 .在
接种植物形成严重的系统症状前 (常温下 20～
25 d)采取新鲜病叶作为提取材料 [ 5] ,粗提纯病
毒在 10% ～ 60%连续甘梯度中经 78 000 g离心
150 min,吸取病毒带 ,为提纯病毒 .
1. 5　血清学反应测定
1. 5. 1　琼脂双扩散反应　　 TuMV抗血清、
CMV抗血清、 TMV抗血清均用 0. 2 mol /L ,
pH 7. 4磷酸缓冲液稀释 2～ 4倍 ;抗原为粗提
纯的病毒 ,悬浮于含有 0. 1% SDS的 0. 2 mol /
L, pH 7. 4磷酸缓冲液中 .按 Ouchterlony之琼
脂扩散方法进行测定 [4 ] ,观察待测抗原与以上
3种抗血清反应的情况 .
1. 5. 2　免疫电镜　　参照常规的免疫吸附、免
疫修饰方法 [5 ] .
①免疫吸附: TuMV抗血清和 TMV抗血
清分别用 0. 2 mol /L , pH7. 4磷酸缓冲液稀释
500倍 , CMV抗血清稀释 200倍 . 经亲水化处
理后的钢网在稀释抗体上处理 15 min,双蒸水
冲洗 ,然后在待检病叶汁液或粗提纯病毒上处
理 10 min,双蒸水冲洗后用 2%醋酸铀 ( U AC)
负染 ,电镜下检查球状、杆状或线状病毒粒子的
有无和形态 .
　　②免疫修饰:在免疫吸附的基础上 ,经病汁
液上处理、双蒸水冲洗后的钢网继续分别在稀
释抗体 ( TuMV抗血清和 TMV抗血清稀释
200倍 , CMV抗血清稀释 100倍 )上处理 10
min,双蒸水冲洗、 UAC负染后置电镜下检查
病毒粒子的有无和被修饰的情况 .
2　结果与分析
2. 1　病毒分离和寄主反应
　　用汁液磨擦接种和嫁接方法 ,从自然感病
的植株上进行多次病毒分离 ,所获分离物在常
规寄主上的反应基本一致 . 其中 ,单斑分离物
AH1在测试寄主上的反应如表 1所示 . 该类分
离物在昆诺藜科指示植物上引起系统坏死斑 ,
在心叶烟、普通烟、假酸桨等茄科植物的接种叶
上为局部斑 ,但在洋酸桨、克里英兰烟上产生系
统症状 . 其不侵染豆科、菊科和葫芦科供试植
物 ,在苋科指示植物千日红和鸡冠花上为局部
侵染 ,接种十字花科供试植物产生系统侵染或
隐症 . AH1回接二月兰种子苗产生黄斑、系统
花叶、茎脉坏死并导致矮化 ,此与自然发病之症
状相似 (图 1～ 图 2) .
144　　　　 　 浙　江　农　业　大　学　学　报 　 第 25卷　
表 1　病毒分离物 AH1在测试寄主上的反应
Table 1　 Hos t reaction of th e i solate AH1
寄主植物
科名 Family 种名 Species　　
寄主反应①
Host s ymptoms
寄主植物
科名 Family 种名 Species　　
寄主反应①
Hos t s ymptoms
藜科
　昆诺藜
　苋色藜
Chenopod ium quinoa
C. amarant icolor
SL
SL
茄科
　蔓陀罗
　心叶烟
　普通烟
　克里芙兰烟
　假酸浆
　洋酸浆
　番茄
　矮牵牛
Datu ra st ramonium
N icotiana g lut inosa
N . tabacum
N . clevelend ii
N icand ra ph ysalodes
N . f loridana
Lycopersicon esculentum
Petunia hybr ida
O
LYS
LL
SN
LN( LD)
YS, SM
O
O
豆科
　豇豆
　菜豆
　蚕豆
V igna sinensis
Phaseollus vulga ris
V icia faba
O
O
O
葫芦科
　黄瓜 Cucumis sativus O
苋科
　千日红
　鸡冠花
Compherena globosa
Celosia crista ta
LL
LL
玄参科
金鱼草 Antir rhinum majus YS
菊科
　瓜叶菊 Senecio oruentus O
番杏科
　番杏 Tetra gonia r xpansa LN
十字花科
　大白菜
　小白菜
　甘蓝型油菜
　白菜型油菜
　油青菜
　榨菜
　花椰菜
　二月兰
Brassica pekinensis
B . ch inensis
B .napus
B . ch inensis
B . ch inensis
B . juncea
B .oleracea Var . botr yt is
Orychophragmus violaceus
SM, D
SM, N, D
SN
SM
LI
SM, D
LI
YS, SM , SN, D
　　① SL: 系统枯斑 ; LL: 局部枯斑 ; O: 不侵染 ; YS: 接种叶局部黄斑 ; D: 皱缩 ; LN: 接种叶坏死 ; LD: 落叶 ; SM: 系统花叶 ;
SN: 系统坏死 ; LI: 隐症侵染 .
　　 SL: sys temic lesion; LL: local lesion; O: non-h ost; YS: yellow spo t on inoculated leaf; D: dis torti on; LN: local lesion;
LD; leaf dropping; SM: s ys temic spot; SN: s ystemic necrosis; LN: latent infection.
图 1　自然感病的二月兰病株 ,示系统花叶、叶脉坏死
Fig. 1　 Infected field plants of O. viola ceus, sh ow ing s ys temic mosaic and vien n ecrosi s
　　 AH1的寄主反应基本符合 TuMV的特点 .
2. 2　病毒粒子观察
　　从自然发病的二月兰植株和产生系统症状
的十字花科指示植物以及克里芙兰烟上均检测
到线状病毒粒子 ,其长度均为 700～ 800 nm,且
未检测到杆状或球状的病毒粒子 . AH1提纯后
经 PT A负染 ,在电镜下为类似 TuMV的均一
的线状病毒粒子 (图 3) .
2. 3　琼脂双扩散反应结果
　　粗提纯病毒加入 SDS后分别与 TuMV抗
血清、 CMV抗血清和 TMV抗血清反应的结果
表明: AH1及另一个来自十字花科甘蓝型油菜
的分离物 TuMV H1均与 TuMV H1同源抗血
清有阳性反应 ,而与 CMV抗血清及 TMV抗
血清均无阳性反应 . A H1与 TuMV H1的沉淀
线完全融合 .
145　第 2期 　 陈集双　李德葆　　引起二月兰花叶病的芜菁花叶病毒研究 　 　　　　
图 2　 AH1接种二月兰产生明脉和系统花叶
Fig. 2　Vien clearing and sys temic mois aic on O. violaceus
inoculated wi th AH1 isolate
图 3　　提纯的 AH1病毒粒子 (PTA负染 ,× 12 000)
Fig. 3　 Purif ied virus part icles of AH1
is olate ( PTA s tained, × 12 000)
2. 4　免疫电镜观察结果
　　粗提纯病毒、自然发病的二月兰植株叶汁
液以及接种 AH1及其余分离物的十字花科植
株病叶汁液中 ,均用 TuMV抗血清吸附到线状
病毒粒子 ,并能用同种抗血清修饰 .用 CMV抗
血清或 TMV抗血清均未检测到相应的球状或
杆状病毒 .
　　血清学反应测定结果表明: TuMV即是引
起二月兰花叶病的病原 .
3　讨　论
　　根据本文研究结果 ,从感病的二月兰植株
上分离纯化的病毒分离物 AH1的生物学、形态
学、血清学特征均符合 TuMV的特点 . 我们用
TuMV抗血清对自然发病的二月兰病株以及
接种其它二月兰分离物的指示植物材料进行检
测均为阳性反应 ,电镜观察其病毒粒子为线形 .
同时 ,用 CMV抗血清或 TMV抗血清则未检
测到相应的病毒 .因此 ,作者认为引起二月兰花
叶病的病原即是芜菁花叶病毒 .
　　 TuMV作为最重要的作物病原病毒之一
而受到重视 [2, 7 ] ,尤其在十字花科植物上引起严
重危害和损失 . 本文是有关 Orychophragms属
植物病毒发生的首次报道 ,亦是 TuMV侵染该
属植物的首次报道 . AH1与一个来自甘蓝型油
菜上的 TuMV分离物 ( H1)有紧密的血清学关
系 ,但其寄主反应则表现一定的差异 .有关该类
病毒与常见蔬菜和油菜上 TuMV的关系以及
其所致病害的相互关系尚需进一步研究 .
　　 TuMV一般不经种子传播 [2, 5 ] ,在我们进
行病害调查和病原鉴定的过程中 ,均未发现二
月兰花叶病经种子传播的情况 . 种子繁殖和防
治早期侵染应是减轻该病害危害的有效途径 .
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(责任编辑　陈　波 )　　
146　　　　 　 浙　江　农　业　大　学　学　报 　 第 25卷