全 文 ：进境大丽花种子携带大丽花花叶病毒的分子检测
陈 青 黄 峰 廖富荣 林石明 陈红运
(厦门出入境检验检疫局 福建厦门 361026)
收稿日期:2012 － 09 － 14
Molecular detection of seed transimitted Dahlia mosaic virus from an imported Dahlia seed lot． Chen Qing，
Huang Feng，Liao Furong，Lin Shiming，Chen Hongyun (Xiamen Entry － Exit Inspection and Quarantine Bu-
reau，Xiamen 361026，China)
Abstract Dahlia mosaic virus (DMV)was identified through growing out，symptomatology，PCR amplification
and sequence determination from an imported dahlia seed lot． Sequence comparison showed that the identified
DMV isolate was closely related to DMV － D10． A primer pair P5 /P6 with expected fragment of 750 bp was de-
signed based on the determined sequence and alignment with other DMV isolates． The PCR assay results proved
that the primer pair P5 /P6 could amplify DMV efficiently compared to previously reported primers，which indica-
ted P5 /P6 was suitable for the detection of DMV．
Key words Dahlia mosaic virus;molecular detection
摘要 通过生长性试验、症状观察、PCR 扩增及序列测定，从一批进境的大丽花种子上发现大丽花花
叶病毒(Dahlia mosaic virus，DMV)。序列比对结果表明，发现的 DMV分离物与 DMV － D10 存在较近的亲
缘关系。根据已报道引物 P3 /P4 的测序结果，并将其与已有的 DMV 序列进行比对，设计 1 对预期扩增片
段为 750 bp的检测引物 P5 /P6。实验结果证实，P5 /P6 的扩增效率优于已报道的引物 P1 /P2 和 P3 /P4，适
用于 DMV的分子检测。
关键词 大丽花花叶病毒;分子检测
中图分类号 S41 － 31
大丽花是菊科多年生草本植物。据统计，大丽
花品种超过 3 万个，是品种最多的花卉之一。病毒
病是大丽花上的主要病害，大丽花上常见的病毒有
黄瓜花叶病毒(Cucuber mosaic virus，CMV)、大丽花
花叶病毒(Dahlia mosaic virus ，DMV)、凤仙花坏死
斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)、烟草线
条病毒(Tobacco streak virus，TSV)和番茄斑萎病毒
(Tobacco spotted wilt virus virs，TSWV)。1928 年德
国首次报道 DMV以来［1］，DMV 被认为是大丽花上
最重要的病毒之一，引起的症状包括花叶、明脉、矮
化和叶片扭曲，症状因品种的不同而不同，在有些
品种上隐症。感染 DMV 会影响植物的活力，从而
减少花的数量、降低花的质量。DMV 自然寄主仅
有大丽花，但通过人工接种可侵染茄科、藜科和苋
科 13 种植物，有报道 DMV 可以侵染百日草属植
物［2］。DMV可通过种子传播，既可通过机械接种
传播，也可由蚜虫以非持久方式传播。目前整个欧
洲的大丽花产区均有发生。1980 年，俄罗斯科学研
究院是在观察植物的超微结构时意外发现了该病
毒在当地的发生［3］。我国云南等地也都发现有
DMV，其危害程度轻重不一［4］。DMV 在美国广泛
分布，Pappu 等［5］调查 DMV 在美国加州等 9 个州
的发生情况，从 90% 以上的样品中检出 DMV。
2010 年，我们从进境的大丽花种子长成的植株中发
现 3 株表现花叶和矮缩症状，怀疑是 DMV 侵染所
致。本研究以进境大丽花种子种植后的显症叶片
为材料，以设计的特异性引物采用 PCR 方法检测
到了大丽花花叶病毒。
1 材料与方法
1． 1 病毒分离物
随机取 200 粒大丽花种子，播于防虫温室内。
植株生长至 3 ～ 4 叶期后，发现有 3 株呈花叶症状，
其中 2 株还表现矮化，均为典型的病毒病症状，将
其命名为 S1、S2 和 S3。
—02—
2012 年第 2 期 植物检疫 PLANT QUARANTINE Vol． 26 No． 2
1． 2 试剂
基因组 DNA提取试剂盒、LA Taq、dNTPs、胶回
收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。根
据 Pahalawatta等［1］的报道合成 DMV 检测引物，引
物序列见表 1。
表 1 DMV检测引物序列
引物名称 引物序列(5 － 3) Tm /℃ 产物 /bp 来源
P1 TgCATAAAATgAgTTCTATC 58 480 Pahalawatta等［1］
P2 TgAACTTgTTCATCATTATC 同上
P3 ATggAAgAAATTAAggCgT 60 1280 同上
P4 TTgTCTTCATCCATAAAgCAg 同上
P5 CACTCTACgACgAAAgTC 52 750 本研究
P6 TgTATATgTgTTCAgACTC 本研究
1． 3 PCR扩增
应用试剂盒提取样品的 DNA。取 1 μL DNA
进行 PCR扩增(50 个循环)。PCR 产物纯化后，由
宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。
2 结果
2． 1 PCR扩增与序列分析
S1、S2和 S3经引物 P1 /P2 扩增后，出现 350 bp
和 550 bp的 DNA片段(图 1 － A) ，大小和带型均与
Pahalawatta等的结果不同。S1、S2 和 S3 经引物
P3 / P4 扩增后，出现约 1500 bp 的 DNA 条带(图 1
－ B) ，也与预期长度(1280 bp)不符。
图 1 引物 P1 / P2(A)和 P3 / P4(B)的扩增结果
M． 100 bp DNA Ladder;1． S1;2． S2;3． S3;4． 阴性对照
BLAST 比对结果表明:350 bp 的片段与 DMV
－ D10(EU096522)的核苷酸序列同源性为 81%，
550 bp的片段与 DMV － D10 的核苷酸序列同源性
为 90%，二者与 DMV － D10 存在显著差异的核苷
酸序列分别见图 2 和图 3，核苷酸序列上的差异可
能导致引物 P1 /P2 在扩增带型及片段大小上与预
期结果不同。
图 2 350 bp片段与 DMV － D10 的比对
注:Query:350 bp序列;Sbjct:DMV － D10
图 3 550 bp片段与 DMV － D10 的比对
注:Query:550 bp序列;Sbjct:DMV － D10
BLAST 结果显示，1500 bp 的片段与 DMV －
D10(EU096523，HQ261759)的同源性为 96%。将
引物 P3 和 P4 的序列与 GenBank 登录的 DMV －
D10 比较发现，P3 /P4 的扩增片段应为 1500 bp，而
—12—
2012 年第 2 期 植物检疫 PLANT QUARANTINE Vol． 26 No． 2
非文献报道的 1280 bp。Pahalawatta等设计引物 P3
和 P4 时，参考序列与 DMV － D10 存在差异，导致扩
增片段与预期大小不符。
2． 2 检测引物的重新设计与验证
应用 P1 /P2 和 P3 /P4 进行 PCR 扩增时发现，
这 2 对引物要经过 50 个循环才能扩增到目标条
带，表明引物的扩增效率很差，不适合 DMV 的检
测。我们根据 1500 bp片段的测序结果及 GenBank
登录的 DMV序列，重新设计引物 P5 /P6，循环参数
为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 50 s，35
个循环;72℃ 7 min。引物 P5 /P6 经过 35 个循环即
可从 S1、S2 和 S3 扩增到预期的 750 bp 的条带(图
4) ，其扩增效率明显优于 P1 /P2 和 P3 /P4，可用于
DMV的分子检测。
图 4 引物 P5 / P6 的扩增结果
M． 100 bp DNA Ladder;1． S1;2． S2;3． S3;4． 阴性对照
3 结论与讨论
本研究从进境大丽花种子长成的植株上发现
疑似 DMV的症状，PCR 扩增及序列测定结果证明
了 DMV 的存在，序列分析结果显示该分离物与
DMV － D10 较为接近，但在核苷酸序列上存在一定
差异。在应用 Pahalawatta 等报道的引物 P1 /P2 和
P3 /P4 扩增疑似 DMV样品时发现，P1 /P2 和 P3 /P4
经过 50 个循环才扩增到预期的 DNA 条带，扩增效
率很低。我们根据 P3 /P4 扩增产物的测序及序列
比对结果，重新设计了检测引物 P5 /P6，实验证明
该对引物可用于 DMV 的分子检测。Pahalawatta
等［6］证实，采自美国和欧洲部分地区的样品几乎都
能检出 DMV － D10，DMV － D10 已成为最广泛流行
的株系。本研究中检测引物 P5 /P6 是根据测序及
序列比对结果设计的，同样适用于 DMV － D10 的检
测，因此可有效检测来自美国和欧洲的大丽花种子
上携带的 DMV，降低园林绿化成本。由于 DMV 在
一些品种上是隐症的，花卉繁育机构在引进大丽花
育种材料时，也可应用本研究设计的检测引物开展
DMV的检测，适时淘汰或处理带有 DMV 的繁殖材
料，提高品种选育的效率，保证种子健康。
参考文献
［1］ Pahalawatta V，Druffel K，Pappu H． Seed Transmission of Dahli-
a mosaic virus in Dahlia pinnata． Plant Disease，2007，91(1) :
88 － 91．
［2］ Kitajima1 E W，Lauritis J A，Swift H． Fine structure of zinnia
leaf tissues infected with dahlia mosaic virus． Virology，1969，39
(2) :240 － 249．
［3］ Yu V Bogunov． Identification of Dahlia mosaic virus by Molecular
Methods． Molecular Biology，2006，(40)1:162 – 163．
［4］ 孔宝华，蔡红，陈海如，等． 花卉病毒病及其防治． 北京:中国
农业出版社，2003:136 － 138．
［5］ Pappu H R，Wyatt S D，Druffel K L． Dahlia mosaic virus:Mo-
lecular Detection and Distribution in Dahlia in the United States．
Hortscience，2005，40(3) :697 － 699．
［6］ Pahalawatta V，Miglino R，Druffel K L，et al． Incidence and rel-
ative distribution of distinct caulimoviruses (genus Caulimovirus，
family Caulimoviridae)associated with dahlia mosaic in Dahlia
variabilis． Plant Disease，2007，91(9) :1194 － 1197．
连云港口岸截获检疫性有害生物南部松齿小蠹
2011 年 12 月 11 日，连云港局在对 1 批来自新西兰的辐射松(Pinus radiata)、火炬松(P． taeda)原木进
行检疫时，截获 3 种检疫性有害生物，经江苏局植检实验室鉴定复核为我国进境检疫性有害生物南部松齿
小蠹(Ips grandicollis(Eichhoff) )、长林小蠹(Hylurgus ligniperda (Fabricius) )和长小蠹属(非中国种) (Platy-
pus spp． (non － Chinese) ) ，其中南部松齿小蠹在连云港口岸为首次截获。
南部松齿小蠹，又名光间十齿小蠹，主要分布在美国、加拿大东部，现已传入澳大利亚、新西兰等国，在
我国尚无分布。该小蠹主要为害长叶松(P． palustris)、山松(P． montezumae)、欧洲赤松(P． sylvestris)、火炬
松(P． taeda)等，能为害致死健树，点片或成片为害致死幼松树是该种一大特征。
连云港出入境检验检疫局 潘 杰 颜柳松 刘 翔 江苏出入境检验检疫局 朱宏斌
—22—
2012 年第 2 期 植物检疫 PLANT QUARANTINE Vol． 26 No． 2