全 文 ：江苏农业学报1 9 94 , 1 0 ( 2 ) : 4 2一 4 7丙朋g , “ 了洲门 口 2 of A g 八 c u l t“ r ` 1 5
~
es
油菜芜青花叶病毒鉴定 、提纯及血清学
周益军 ` 侯庆树 ’ 程光榜 2 许大光 “ 肖振鸿
摘 要
通过寄主范围 、 粒子形态 、 血清学测定 , 鉴定出
南 京 油 菜 上 的 两 个 分 离 物 为 芜 青 花 叶病 毒
(T
u
M v )
,
T
一
02 分离物表现为黄斑花 叶型症状 ,称
为花叶型株系 ( T u M V 一 jm ) ; T 一05 为枯斑系统坏死
症状 ,称为坏死型株系 ( T u M V 一 jn) 。 提纯研究表明 ,
A 2 6
o
/ A Zs
。 为 l · 2 2 ; A 。 二 / A 、 。 为 一 1 2 ; 粒 子 长度 为
7 2 0一 8 0 n m 。 S D S 聚丙烯酞胺凝胶电泳测定外壳
蛋白亚基的分子量为 27 . 5 kd 。 还研究了外壳蛋 白
17 种氨基酸的含量及 比例关系 。 以提纯 T u M V 一 jn
制备抗血清 ,研究其免疫分析方法及其与马铃薯 Y
病毒组某些病毒的血清学关系 。
关健词 :芜青花叶病毒 ;株系 ;提纯 ;血清学
油菜病毒病是我国南方油菜上仅次于菌
核病 的一种重 要病害 , 其 中芜青花 叶病 毒
( T u M V ) 在 油菜及十 字花科蔬菜上分布 最
广 、 危害最重 。 我国 40 年代初 已有油菜病毒
病的研究川 , 其后 ,魏景超 、 周家炽等分别对
我国及华东地区油菜病毒病种类进行了分析
研究 .s[ ’ 〕 ,沈淑琳 、李丽丽 、 冯兰香等分别对油
菜和十字花科蔬菜上的 T u M V 进行过株系
研究 l[, 3· `〕 。 本实验在鉴定 、 提纯南京油菜上
分离的两个 T u M V 株系的基础上 ,研究了粒
子特性及血清学 。并对江苏省分布最广 ,危害
, 江苏省农业科学院植物保护研究所 南京 2 10 0 14
2 江苏省农 业科学院农业 生物遗传生理研究所 南京
2 1 0 0 1 4
3 江苏农学院植物保护系 19 9 1 届实习生 杨州 2 2 5 0 01
部分 工 作 由周 益军 在 加拿大农部植物研究中心 D r . R C
Si n h a 实验 室完成 , 曾得到 p a t r i e i a B . w o n g 和 E s t h e r
W o ng 的技术帮助 , 上海农业科学院袁贤溶研究员 、 江
苏省农 业科学院经济作物研究所陈 玉卿副研 究员也
曾提供帮助 , 并 呈请 王法明研究员审阅本 文 , 一并致
谢 !
收稿 日期 : 1 9 9 3一 0 2一 1 0
最重的坏死型株系进行了较深入的探究 。
1 材料和方法
1
.
1 病毒来源
样 品采自南京 、 宜兴等地具有典型病毒
病症状的油菜病株 ,经初步筛选鉴定 ,保留了
来源于南京的 T 一 02 、 T 一 05 两个分离物 。
1
.
2 接种方法
常规汁液接种 。
1
.
3 病毒粒子形态观察
病 叶样 品浸 出液 或提纯病毒制剂 , 经
2% P T A 负染 ,在 H i t a e h i 6 0 0 型透射电镜下
观察 。
1
.
4 病毒提纯
T u M V
一
0 5 繁殖 在芜青 ( B ar s s ic a n助 u s
s s p n a p a b r a s s i e a ) 品种 L a u r e n t i a r 上 ; T 一 0 2
繁殖 在 白菜型 油菜稀 水 白上 , 接种后 17 一
2 0℃下生长 21 天左右 ,采叶 ,封冻在 一 20 ℃
下备用 。 参考 日本崔璋京提纯 T u M V 的方
法 [ , 0 〕 ,作部分改进 。 1 0 0 9 病叶 ,加 1 . 5 倍 ( V /
W )体积的 。 . S M 磷酸缓冲液 (P B p H 7 . 5 , 内
含 0 . 01 M E D T A , 0 . 1 %琉基 乙酸 ) , 捣 碎 ,
尼龙纱过滤 。 3 2 0 x g 离心 15 分钟 , 上清加
l % T r i t o n X
一
1 0 0
,
6% P E G ( MW ~ 6 0 0 0 )
,
0
.
1
M N a C I
, 室温下搅拌 2一 3 小时 , s s o o x g 离
心 1 5 分钟 。 沉淀用 3 0 m l 0 . 5 M P B ( p H 7 · 5 ,
内含 0 . 0 1 M M g C 12 )悬浮 , 8 5 0 0 x g 离心 1 0
分钟 , 上清液 “ 9 0 x g 离心 10 5 分钟 , 沉淀
用 l m l o · S M p B ( p H 7 · 5 内含 0 · 0 1 M M g -
e l
Z
)悬浮 ,离心 9 0 0 0 x 9 2 0 分钟 ,上清液铺放
1 0 %一 4 0肠蔗糖梯度上 , 6 z 0 0 0 x g 离心 1 3 5
分 钟 , 抽取 白色病毒 区 带 , 用 0 . 01 M P B
p H 7
.
o 稀释 , 6 , 9 0 0 x g 离心 1 0 5分钟 , 沉淀
的病毒悬浮在 0 . 0 1 M P B p H 7 . o 中 , 保存在
2期 周益军等 : 油菜芜青花叶病毒 鉴定 、提纯及血清学
一 20 ℃以下备用 。 上述步骤中除注明操作温
度外 ,均在 4℃下进行 。
1
.
5 病毒外壳蛋 白分析
1
.
5二 1 S D S 聚 丙烯酞胺凝胶 电泳 (S D S -
P A G E )分析 采用不连续凝胶系统 , 3%的
浓缩胶 , 13 %的分离胶 , Z o 0 V 电压电泳 约 6
小 时 , 考马斯亮 兰 R 泌。染色 , 乙醇冰醋酸脱
色 。 标准蛋白采用上海东风试剂厂生产的低
分子量蛋 白标样 。 对所测得的病毒外壳蛋白
亚基分子量进行回归分析 。
1
.
5
.
2 外壳 蛋白氨基酸测定 紫外吸收 入
一 28 0 测定病毒外壳蛋 白的含量 ,取精确定
量外壳蛋 白加入 6 N H CI 放 1 10 ℃下水解 24
小时 , 去酸后 用 0 . 02 M HCI 稀释样品 , 在
H it ac hi 8 3 5
一 50 型高速氨基 酸自动分析仪上
测定 。
1
.
6 抗血清制备及血清学方法
1
.
6
.
1 抗血清制备 用 T 一 05 提纯病毒免
疫家兔制备抗血清 。 3 次肌 肉注射 , 等体积的
提纯病 毒与 F er u n d ’ s 不完全佐剂充分乳化
后进行肌 肉注射 ; 直接用提纯病毒静脉注射
两次 。 每次注射间隔 1 周 ,每次注射约 2 m g
提纯病毒 , 最后一次注射 10 天后采血 。
1
.
6
.
2 其它抗血清来源 标准 T u M V 、 大
豆花叶病毒 (S M V ) 、 葛营花 叶病毒 ( L M V ) 、
菜豆普通花叶病毒 ( B C M V ) 、 黄瓜花叶病毒
( C M V )
、 烟草花 叶病毒 ( T M V )抗血清分别
由南京农业大学植病组惠赠和本实验室制
备 。
1
.
6
.
3 效 价测 定 微量沉淀反 应 以 0 . 1
m g /m l 提纯病毒为抗原 , 抗血清按倍 比稀
释 , 反应 在 F or m va r 处理过的培养皿 中进
行 ,龄 6 、 24 小时后观察 、 记载结果 。
1
.
6
.
4 S D S 免疫双扩散反应 在 0 . 75 %琼
脂糖 ( 内含 0 . o l M P B p H 7 . 2 , 0 . 8 5% N a C I ,
0
.
0 2% N a N
3 、
0
.
5 % S D S )凝胶板上进行 , 2 4
小时后观察沉淀线 。
1
.
6
.
5 酶联免疫吸附分析 ( E L IS A ) 采用
间接 E L IS A [ , ] 。
1
.
6
.
6 免疫电镜 ( IS E M ) 捕捉法 : 用铺有
碳膜的铜网置稀释后 的抗血清上吸附 1 小
时 , 用 o , 0 6 M P B p H 6 . 5 冲洗去除未吸附的
抗血清 , 再将铜 网置样 品滴上 4℃过夜或室
温下 2 小时 , 冲洗后吸干 , P T A 负染后 电镜
下观察 。 修饰法 : 上述步骤在染色前再用 10
倍浓度的原抗血清吸附修饰 ,冲洗后再负染
置 电镜下观察 。试验以非同源抗血清为对照 。
2 结果
2
.
1 病原鉴定及致病力分化
汁液接种 T 一 02 和 T 一 05 分离物 ,均系统
侵染小青菜 ( B . : h i , e n s i : )矮脚黄 、 白菜型油
菜烯水白 、甘兰型油菜 ( B . ca mP es t ir , )宁油 7
号 , 以 及 览 色 蔡 ( hC en oP od iu m
a m a ar nt ic ol or )
, 在觅色蔡接种叶上产生局部
枯斑 , 15 天后心叶出现褪绿 、 枯斑 、 畸型 , 进
而 发 展 为系统坏死 , 局部侵染普通烟 ( N .
t a b a c u m ) 品 种 S a n s a m 、 W h i t e B u r l e y ; 不侵
染百 日菊 ( 2 1, n t’a e l e邵 , s ) 、 心叶烟 (N . 砂 u t i -
n os a )
。
两分离物粗 汁液 负染电镜观察 , 可 见
75 0 n m 左右长的线状病毒粒子 。
S D S 免 疫 双 扩散 试 验 , 两分 离 物 与
C M V
、
T M V 抗 血清呈 阴性反 应 ; 与标 准
T u M V 抗血清呈 阳性反应 ,两分离物产生的
阳性反应沉淀线完全融合 。 用标准 T u M V 抗
血清免疫电镜观察 ,可见捕捉到两分离物的
大量病毒粒子 , 并对病毒粒子有较好的修饰
作用 (图 1 、 2 ) 。 根据以上特性 ,上述两分离物
均 被 鉴 定 为 马 铃 薯 Y 病毒 组 ( P ot vy iur s
g r o u p )的芜青花叶病毒 [` 3 〕。
根据两分离物在多数供试油菜品种上的
症状 、 致病类型的差异 ,可分为黄斑花叶型和
枯斑系统坏死型 。 前者以 T 一 02 分离物为代
表 , 在油菜上主要表现重花叶和黄斑花叶型
症状 , 不侵染芜青 L au er n it ar (接种后无症 ,
回接不上 , T u M V 抗血清测定为阴性 ) , 我们
将其定为 T u M V 一 jm 株系 ;后者以 T 一 05 为代

2期 周益军等 :油菜芜青花叶病毒鉴定 、 提纯及血清学
A、 二 / Am in值为 1 . 1 2,病毒产量为每 10 0 9 病
叶可提取 1一 4 m g 病毒 。 提纯样品在电镜下
可观察到大量线状病毒粒子 , 宽约 12 n m ,长
度主要分布在 7 2 0一 5 0 0 n m 处 。
S D S
一
P A G E 测定结果 ,两株系的外壳蛋
白分子量均为 2 7 . 5 k d (图 4 ) 。
提纯 的 T u M v 一 jn 外壳蛋 白水解后 , 稀
释至原样 品含量的 1 1/ 0 , 经氨基酸 自动分
析仪测定的 17 种氨基酸组分见表 1 。
2
.
3 血清学
衰 1 T u M v 一j . 与其它株系的外充蛋白亚荃扭荃酸组分比较
T a b l e 1
.
C o m琳 r l s o n o r a m i n o . e肠d e o 口 p o s l t l o n o f e a脚 ld p or t e ln be t w e n T u M V 一j n 妞d o t址 r s t r a l n s .
氨基酸
A m i n o a e id s
T u M V
一
jn
n m o l / m g
相对摩尔 比率 l ’ R e l a t i v e m o l a r r a t i o l )
T u M V
一
jn T u M V
一
N O
.
6 7 T u M V
一 e m
A l a
A r g
106583
3
.
9 0 1
4
.
4 3 8
7 9 7 8
0
。
2 5 7
6
.
3 9 2
4
。
1 5 5
1
.
3 3 8
2
.
4 3 3
4
.
9 3 9
2
,
4 6 6
2 3 5 5
2
.
8 3 2
2
.
2 0 5
4
。
4 9 8
2
.
0 8 4
3
。
1 6 6
;:
l 8
Z 8
::
::
2 7
l 5
8
l 2
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:;
PU5y51s比re丁Tl1[叭即弘GI .:iHleelL吻娥hjrPS巧Va
, ’为最接近的整数 . ” U s in g n e a r e s t in t e g e r s .
2
.
3
.
1 抗血清的效价测是 提纯 T u M v 一 jn
(T
一
05 ) 制备的抗血清微量沉淀反应测定效
价为 2 0 48 ; S D S 双扩散测定效价为 l : 1 6( 抗
原用 T u M V 病叶的粗汁液 ) ; 间接 E IL S A 测
定抗血清的效价为 1 : 1o 0 o 0 0( 抗原为 1拌g /
m l 的提纯 T u M V 一 jn ) 。
2
.
3
.
2 病毒的检测 间接 E L IS A 测定 ,用
提纯 的抗 体免 疫 球 蛋 白 ( l g G 一 T u M v 一 jn )
1雌 /ml 或用稀释 1 0 0 0 0 倍的抗血清可检测
到 稀 释 12 8 0 倍 油 菜 病 叶 粗 汁 液 中 的
T u M v ; 也 可 检 测 到 稀 释 2 5 6 0 倍 莽 菜
( aC 户s e l la b u sr a
一户a s t o ir s ) 粗 汁 液 中 的
T u M V ; 稀 释至 1 / 6 4 拌g /m l 的提纯 T u M V
亦可被检测到 。 IS E M 试验用稀释 1 0 0 0 倍的
抗血清可从稀释 50 倍的粗汁液 中捕捉到较
多的病毒粒子 ( x 3 0 0 0 0 倍时 , 20 个视野 中平
均每视野 19 个病毒粒子 ) , 用稀释 1 0 倍抗
血清对 同源病毒粒子有较好的修饰作用 (图
2 )
。
2
.
3
.
2 血 清 学 比较 S D S 双 扩 散 测 定
T u M V
一
i n 抗血清与 T u M V 一 jm 株系呈 强阳
性反 应 , 两株系间无血 . 清学差 异 ; P ot y vi ur s
组的 S M V 、 L M V 、 B C M V 抗血清与两株系均
无阳性反应 。 免疫 电镜试验 , T u M V 一 jn 抗血
清 对 两 株 系 均 有 较 强 的 捕 捉 能 力 , 而
B C M V
、
S M V
、
L M V 抗血清对上述两株系几
乎没有捕捉作用 。
江 苏 农 业 学 报 1 0卷
3
· 讨论
本文所鉴定的 T uMV两株系与沈淑琳 、
淮祖芹鉴定的江苏省油菜的两个 T uMV株
系基本一致 [ ] 3, 说明近年来江苏省油菜上的
T u M V 仍 以花 叶型 (沈淑琳文中称黄斑型 )
和坏死型两株系为主 。从样品分析来看 ,这两
个株系中仍以枯斑坏死株系占优势 ,而且危
害 程 度也较前者严重 。 目前 国 内外 有关
T u M V 株 系的研究较多 [` , ` , ` 2 ] , 因所用 的鉴
别寄主不同 ,故不能确定江苏 T u M V 两株系
的归属 ,这方面还有待进一步研究 。在测定的
样品中 ,有些症状介龄两株系之间 ,或同时表
现两株系的症状 , 可能是两株系的混合侵染 ,
目前尚未找到从中分离出 T u M V 一 jm 的分析
寄主 , 无法将混合侵染的两株系完全分开 ,因
此尚不能揭示是否是混合侵染或混合侵染中
两株系之间的关系 。 在所分析的油菜病毒病
样 品中 , 亦有少量 的 C M V 、 T M V 以及 它们
与 T u M V 复合侵染的样品 , 对此 , 另文将作
讨论 。 提纯的 T u M V 呈典型的核蛋白紫外吸
收曲线 。 S D S 一 P A G E 分析表明 , T u M V 两株
系外壳蛋 白亚基分子量 约为 2 7 . s kd ,这与
崔璋京和朱海英的结果相近 .z[ 川 , 但与徐来
升的结果不同 8j[ ,这可能与采用的株系 、提纯
方法 、 电泳样品处理方法不同 ,导致蛋 白质在
制备过程中降解的差异有关 。 有关蛋 白质亚
基氨基酸的组成 , 从表 1 中可 见 , T u M V 一 jn
株系氨基酸组分与 日本株系 〔` ’ 〕 、 崇明大 白菜
株 系 ( T u M V 一 c m )差 异较大 , 其 中天冬 氨酸
( A s p )
、 亮 氨 酸 ( L eu ) 含 量 高 放 日本 和
T u M V
一 c m 株 系 , 而 丙 氨 酸 ( A l a ) 、 组 氨 酸
( H i s )
、 异亮氨酸 ( I l e u )和蛋氨酸 (M e t )含量
却略低放这两个株系 ,其它氨基酸组分也与
两株系不同 。作者认为 , 病毒蛋白质亚基的氨
基酸组分和顺序可从分子水平上为株系鉴定
提供依据 。病毒血清学 比较结果说明 , T u M V
与 P o t y v i r u s 组中的 S M V 、 L M V 、 B C M V 血
清学关系相距甚远 。
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A m
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J ia ng u sJ
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A g
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S
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, 1 0 ( 2 )
: 4 2一 4 7 4 7
I ds
n t i f i c a t i o n
,
P u r i f i c a t i o n a n d S e r o l o g y o f T u r n i P M o s a i e
V i r u s f r o m R a P e
`
Z H o u Y iju n
, `
H o u Q i n g s h u
, `
C H E N Z h a o b a n g
, Z
X u D a g u a n g a n d
“
X l ^ 0 Zh e n g h o n g
A b s t r a C t
A e e o r d i n g t o s t u d ie
s o n
一
t h e h o s t r a n g e
,
p a r t i e l e p r o p e r t y a n d s e r o lo g y o f 2 i s o l a t e s
,
T
-
0 2 a n d T
一 0 5
,
f r o m r a p e i n N a n j i n g
,
t h e y w e r e id e n t i f ie d a s t u r n i p m o s a i e v i r u s ( T u M V )
.
T
一
0 2 w a s s u g g e s t e d t o b e a m o s a i e s t r a i n ( T u M V
一
im ) 息h o w i n g y e l l o w m o s a i e s y m p t o m s a n d
T
一
0 5 a n e e r o t i e s t r a i n ( T u M V
一
jn )
s h o w i n g
s y s t e m n e e r o
s i s i n m o s t e u l t iv a r s o f r a p e
.
T h e
p u r i f i e d T u M V s h o w e d t h e f o l l o w i n g e h a r a e t e r is t ie s
:
A
2 6。
/ A
2 8。
= 1
.
2 2
,
A o
x
/ A m
。。
= 1
.
1 2 a n d
p a r t i e l e l e n g t h 7 2 0 一 8 0 0 n m . T h e y ie ld o f p u r i f i e d v i r u s w a s l 一 4 . 0 m g / 1 0 0 9 i n f e e t e d
l e a v e s
.
O n t h e b a s is o f S D S
一
P A G E o f d i s s o e ia t e d e a p s id p r o t e i n o f T u M V
, e a c h s u b u n i t
h a d a m o le e u l a r w e i g h t o f a p p r o x im a t e l y 2 7
.
5 k d
.
C o m p a r i s o n o f a m i n o a e id e o m p o s it i o n o f
P r o t e i n s u b u n i t w a s e a r r ie d o u t
.
T h e a n t i s e r u m p r e P a r e d w i t h P u r i f i e d T u M V
一
jn h a d t i t e r s
o f l
, 2 0 4 8 i n m i e r o P r e e i P t i n t e s t a n d l
, 1 0 0 0 0 0 i n i n d i r e e t E L I S A
.
T h e 2 s t r a i n s o f T u M V
a r e d i f f e r e n t f r o m o t h e r 饥 e m b e r s o f t h e p o t y v i r u s g r o u p b u t t h e s a m e b e t w e e n t h e m s e l v e s i n
s e r o l o g y
.
K e y w o r d s : t u r n i p m o s a i e v i r u s ( T u M V ) f r o m r a p e ; id e n t if i e a t i o n ; p u r i f ie a t i o n ; s e r o l o g y
` I n st i t uet of P la
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