全 文 ：第 48卷 第 1期 土　壤　学　报 Vol.48, No.1
2011年 1月 ACTA PEDOLOGICA SINICA 　Jan., 2011
＊国家自然科学基金项目(30870065, 30800013)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(2010CB126500)资助
　　 通讯作者 , Tel/Fax:86-25-84396645;E-mail:ztzhong@njau.edu.cn
作者简介:张　江(1983— ),男 ,硕士研究生。 E-mail:iamzhangjiang2008@163.com
收稿日期:2009-04 -11;收到修改稿日期:2009 -11-11
中华苜蓿根瘤菌受种子分泌物诱导的
基因筛选和分析＊
张　江　王彦涛　郑会明　钟增涛 　朱　军
(南京农业大学生命科学学院 ,南京　 210095)
SCREENINGANDANALYSISOFGENESINDUCEDBYSEED
EXUDATESINSINORHIZOBIUM sp.1128
ZhangJiang　WangYantao　ZhengHuiming　ZhongZengtao 　ZhuJun
(ColegeofLifeScience, NanjingAgriculturalUniversity, Nanjing　210095, China)
关键词　　Sinorhizobiumsp.1128;紫花苜蓿;种子分泌物;刀豆氨酸
中图分类号　　Q93　　　　文献标识码　　A
　　土壤中的根瘤菌与宿主植物的共生结瘤过程
中 ,豆科植物可以通过分泌氨基酸 ,有机酸 ,糖类 ,
有机酚及其他的次级代谢产物 [ 1]的种类及丰度来
影响根圈范围内微生物的群体种类及数量。豆科
植物可以通过分泌趋化性物质如糖蛋白等[ 2]协助
根瘤菌吸附在合适的侵染位点 ,从而增加自身被感
染的机率。植物还可以分泌抗菌类物质对根系微
生物进行筛选 ,如在 Mirabilisjalapa的种子分泌物
中分离到一种抗菌肽物质 ,该物质对根系中的真菌
有广谱的杀菌作用 ,同时对一些革兰氏阳性菌具有
抗性 ,但是对革兰氏阴性菌则没有明显的抑制活
性 [ 3] 。这种现象在 Arabidopsisthaliana中同样存在 ,
其根部产生的丁酸可以使植物免受多种植物病原
细菌的侵害 [ 4] 。在根瘤菌与豆科植物的共生体系
中 ,当根瘤菌发生不能利用宿主豆科植物根系分泌
的特定氨基酸的突变时其在根部的定殖能力也会
急剧减弱[ 5] 。
为了了解中华根瘤菌 Sinorhizobiumsp.1128
在与其宿主豆科植物紫花苜蓿和草木樨前期相互
作用的过程中根瘤菌基因表达的变化 ,以进一步
从分子水平上了解共生模式下两种不同生物互相
交流的情况 ,本文通过采用一类含有无启动子卡
那霉素抗性基因的转座子诱变技术 ,通过基于卡
那霉素抗性的活体表达技术 ,筛选获得中华苜蓿
根瘤菌与宿主植物种子分泌物相互作用的基因 ,
并研究了相关基因被种子分泌物诱导表达的情况
及其生理功能 ,发现基因 ssiA在根瘤菌与宿主的
早期信号识别具有重要意义。这些研究工作为深
入研究共生结瘤固氮这一复杂的过程提供了
材料 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
1.1.1　菌株与质粒　　本试验所用菌株和质粒及
其特征见表 1。
1.1.2　培养基和培养条件　　根瘤菌及相关突变
株采用 TY培养基在 28 ℃下培养。E.coliSM10λpir
和 BW20676菌株采用 LB培养基在 37 ℃下培养。所
用试剂浓度:卡那霉素(Km)为 15 μgml-1;链霉素
(Sm)为 100 μgml-1;氯霉素(Cm)为 20 μgml-1 ,刀
豆氨酸(CAN)为 100 μgml-1。
218　 　土　　壤　　学　　报 48卷
表 1　本研究中所用的菌株和质粒
菌株和质粒 特征 文献及来源
菌株
Sinorhizobiumsp.1128
Sinorhizobiumsp.YW0
smA, smB, smC, smD
ZHJ1
EscherichiacoliDH5αλpir
BW20676
EscherichiacoliSM10λpir
质粒
pJZ260
pVIK112
pZHJ1
Wildtype
DerivativeofWildtype, SpontaneousSmr
DerivativeofYW0 carryingamarinertransposon
DerivativeofYW0 carryingassiA-lacZ
Standardcloninghost
Conjugationstrain
Conjugaldonorstrain, Sms, hostofpJZ290
Marinertransposonwithpromoter-lessKmgene(Cmr)
LacZtranscriptionalfusionvector, R6Korigin
siA-lacZinternalfusioninpVIK112, KmR
本实验室 [ 6]
本实验室 [ 4]
本研究
本研究
本实验室
本实验室
本实验室
本实验室
本实验室 [ 7]
本研究
1.2　方法
1.2.1　种子分泌物(SE)的制作　　取 10 g紫花
苜蓿种子用 70%酒精表面消毒 , 20 ml无菌水浸泡
24 h,浸泡后的种子用无氮营养液培养至发芽 ,将
培养液过滤除菌 ,于 4 ℃贮存。
1.2.2　突变株的筛选　　将 Sinorhizobiumsp-YW0
与 SM10λpir(pJZ260)两亲接合的突变株文库稀释
后 ,涂布于含有 Sm100 μgml-1 , Km15 μgml-1 , SE
1%(v/v)的 TY平板上。为了去除 Km基因组成型
表达的突变株 ,轻挑菌落分别划线于 Km15 μgml-1
和 Km15 μgml-1 , SE1%(v/v)的 TY平板上 ,如果
前者平板上无生长 ,而后者平板上有生长 ,这说明卡
那霉素抗性基因很有可能插在了种子分泌物诱导表
达的基因里。
1.2.3　突变株菌体浓度的测定　　1%接种突变
株至 TY液体培养基(Km, 15 μgml-1)中 ,等量分
装成两瓶 ,一瓶加入 1%种子浸提物(SE),而另一
瓶加入相同体积的无菌水做对照 , 28 ℃摇床培养。
每隔 24 h左右测定一次菌体浓度(OD600)。
1.2.4　任意 PCR(arbitraryPCR)　　按照文献
[ 6]进行操作 。
1.2.5　β-半乳糖苷酶活性的测定　　将待测菌株
培养至 OD600于 0.2 ～ 1.0之间 ,按照文献 [ 8]的方
法进行 ,并对每个待测菌株重复 3次试验 ,以获得
误差值 。
1.2.6　刀豆氨酸(CAN)抑菌试验　　按照文献
[ 9]进行操作 ,即将待测菌株进行刀豆氨酸未处理
和处理的液体培养 ,梯度稀释后获得细胞数量 ,并
计算比值 。同样的试验重复 3次 ,获得比值的误
差数。
2　结　果
2.1　种子分泌物能够诱导 Km表达的突变株的
筛选
　　从 8 000个接合子突变株中筛选得到了 4株能够
诱导 Km抗性基因表达突变株 ,即突变株在没有分泌
物的 Km培养基中生长被抑制 ,在添加分泌物的 Km
培养基中由于 Km抗性基因诱导表达 ,可以生长 ,二
者之间菌体浓度(OD600)形成明显差异 ,但种子分泌
物对不同突变株的诱导能力也不同(图 1)。
图 1　种子分泌物(SE)对突变株的诱导
2.2　转座子插入位点序列分析
分别以 mariner转座子 5和 3端的引物进行
arbitraryPCR扩增分别得到 mariner转座子的 5和
3端的序列。经 DNA测序 , BLAST比对发现能够
诱导 Km基因表达的 4株突变株的转座子插入到
了 4个不同的基因中(图 2,箭头表示转座子中卡
那霉素抗性基因的方向),与全基因组测序的中华
根瘤菌 SinorhizobiummedicaeWSM419中的 smed
1期 　　张　江等:中华苜蓿根瘤菌受种子分泌物诱导的基因筛选和分析 219　
4165、smed 4658、smed 4659和 smed 5465基因的
同源性很高(99%～ 100%),其编码的蛋白分别为
LysE家族氨基酸外运蛋白 、组氨酸氨解酶 、咪唑酮
丙酸酶 、NADH:黄素氧化酶。
图 2　突变株的转座子插入位点示意图
2.3　ssiA-lacZ的诱导表达
为了验证所筛选的基因是否正确 ,取其中一个
基因 lysE(命名为 siA)通过 lacZ融合验证是否能被
种子分泌物诱导 ,通过测定 β -半乳糖苷酶活性来检
测基因 ssiA的表达情况 。实验发现宿主植物种子分
泌物(SE)中确实存在可以引物根瘤菌 siA基因表
达的物质(图 3),这进一步说明所筛选的基因确实
是在分泌物存在的条件下表达的 ,并且该基因可能
参与了早期菌植互作的过程 。序列分析发现 , ssiA
与天山根瘤菌 Mesorhizobiumtianshanense刀豆氨酸
外运基因 msiA(GenBank登录号 FJ160755)编码蛋
白的序列中有 75%的同源性 ,而苜蓿种子及种子分
泌物中含有大量刀豆氨酸 [ 10-11] 。不同氨基酸诱导
试验发现刀豆氨酸确实能够诱导 siA表达 ,而其他
常见碱性 (包括中性 )氨基酸不能诱导其表达
(图 4),这意味着 siA可能编码刀豆氨酸外运蛋白 。
图 3　种子分泌物(SE)对 ZHJ1的诱导表达
图 4　不同氨基酸对 ZHJ1的诱导表达
2.4　刀豆氨酸的抑菌实验分析
用刀豆氨酸同时处理野生型和突变株 ZHJ1(中
间片段融合使 siA失活)后 ,进行梯度稀释计数并
计算刀豆氨酸未处理和处理后的细胞数量的比值 。
结果发现 ,与不加入刀豆氨酸相比 ,刀豆氨酸处理
野生型菌株 ,几乎没有造成细胞数量的减少 , 比值
约为 1;而同样的条件作用于突变株 ,细胞数量显著
降低 , 未处理的细胞数量约为处理后的 100倍
(图 5)。这进一步验证 ssiA可能与刀豆氨酸的运输
图 5　野生型(WT)和 ssiA突变株(ZHJ1)对刀豆氨酸的敏感性
220　 　土　　壤　　学　　报 48卷
有关。 siA基因缺失的突变株不能将有毒的刀豆氨
酸运出胞外造成对菌株刀豆氨酸的敏感。
3　讨　论
根瘤菌与宿主植物共生的过程中 ,需识别植物
的一系列如有机酸 、类黄酮 、氨基酸 、胞外多糖 [ 12-13]
等信号分子 ,并能够逃避宿主植物的免疫反应 [ 12] ,
才能成功侵入宿主植物 ,这其中就包括根瘤菌体内
很多与该过程相关的基因的表达变化 。本文运用
无启动子的卡那霉素抗性基因作为基因表达筛选
标记 ,获得了 4种能被植物种子分泌物诱导表达的
基因。其中组氨酸氨解酶和咪唑酮丙酸酶是一类
与氨基酸代谢相关的酶 ,而 NADH:黄素氧化酶与生
物的能量代谢有关 ,表明在菌植互作的前期过程中
植物分泌物中的一些糖类 、有机酸 、芳香类化合物 、
氨基酸等化合物可以引起根瘤菌生理代谢的一些
变化 ,具体机制尚待进一步研究 。
本试验重点对 ssiA基因进行了研究 ,其基因表
达产物为一类 LysE家族氨基酸外运蛋白 ,主要运
输一些碱性氨基酸 , 如赖氨酸 (Lys)、精氨酸
(Arg)、组氨酸(His)、刀豆氨酸(CAN)等[ 9, 14] ;经
氨基酸诱导性试验发现 siA-lacZ只能被刀豆氨酸
诱导 ,因此推测其可能与 L-刀豆氨酸的外运有关 。
L-刀豆氨酸是一类精氨酸类似物 ,普遍存在于豆科
的 240属 、1 200种植物中 [ 15] ,在苜蓿种子中含量
很高 。刀豆氨酸掺入新合成的蛋白中 , 由于不能
完成正确的折叠而变性 , 从而对细胞造成毒性 。
刀豆氨酸作为一种抗代谢物 ,被认为可以抑制植
物根圈内昆虫的食害和病原微生物的侵染 [ 16] 。在
苜蓿根际曾报道了刀豆氨酸抑制某些细菌的生长
的现象 [ 10] 。本试验中 ,刀豆氨酸明显抑制了中华
苜蓿根瘤菌 siA突变株的生长 ,从而推测 siA基因
产物可能在中华苜蓿根瘤菌 Sinorhizobiumsp.
1128结瘤的过程中将刀豆氨酸运输至胞外 ,从而
避免被苜蓿种子或根系分泌的刀豆氨酸杀死而成
为根际土壤中的优势菌 , 为下一步的共生结瘤奠
定了基础。根据同源性比对的结果可知 , 在 siA
基因上游还有一类 LysR转录调控蛋白 ,该调控蛋
白如何结合刀豆氨酸信号分子诱导下游 siA基因
的表达将是后续进一步研究的内容 。
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