全 文 ：第 30卷　第 1期
2008年 3月 　 　　　　 延　边　大　学　农　学　学　报Journal of Ag ricultural Science Yanbian Univer sity 　　　　　Vo l.30 No.1　Mar.2008
收稿日期:2007-10-18　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30560094).
作者简介:高日(1982—), 男 ,吉林抚松人 , 延边大学农学院园艺系 ,在读硕士.朴炫春为通讯作者 ,
　　　　　Tel:0433-3263389 , E-mail:nyypxc@ybu.edu.cn.
东北刺人参 RAPD反应体系的优化
高日1 , 　廉美兰1 , 　吴松权1 , 　朴炫春1＊ , 　林长春2
(1.延边大学农学院 ,吉林 龙井 133400;2.延吉市林业局 吉林 延吉 133000)
摘要:以东北刺人参试管苗叶片为材料 ,建立东北刺人参 RA PD反应优化体系.结果表明:
20.0 μL 反应体系含 250.0 μmo l/L dN TP ,2.0 μmo l/L M gCl2 , 1×Buf fer ,0.3 μmo l/L 引物 ,
10.0 ng DNA模板 , 1.5 U Taq DNA 聚合酶 ,9.8μL ddH 2O;扩增反应程序为:94 ℃预变性 5
min , 94 ℃变性 45 s ,36 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 1.5 min ,40个循环 ,最后 72 ℃延伸 7 min时
获得的 RAPD指纹图谱带型清晰 、重复性好.
关键词:东北刺人参;RAPD;优化
中图分类号:S567.5+3　　文献标识码:A　　文章编号:1004-7999(2008)01-0001-04
东北刺人参(Oplpanax elatus Nakai)系五加科刺人参属多年生落叶灌木 ,又名北五
加 、刺参 ,分布区域十分狭窄 ,全世界只在中国 、俄罗斯 、朝鲜 3国境内有少量分布 ,在我国主
产于吉林省长白山海拔 700 ～ 2 000 m 的针叶林带及辽宁东部山区海拔 800 ～ 1 000 m 的松
杉林下[ 1] .近几年由于人为采挖 ,自然资源遭到严重破坏 ,经调查整个长白山区小片生长的
天然东北刺人参已屈指可数[ 2] ,对东北刺人参的保护迫在眉睫.
近几年来 ,国内对东北刺人参的致濒因素和保护对策也进行了一些探讨[ 3 ,4] ,但尚未见
有关东北刺人参遗传多样性的研究报道.本试验对东北刺人参基因组 DNA 提取方法及其
RAPD扩增条件进行了优化 ,以期建立适于东北刺人参的简单 、高效 、稳定的 RAPD反应体
系 , 为其种质资源和遗传关系等方面的研究提供依据.
1　材料与方法
1.1　材料
将东北刺人参茎端消毒 ,接种在 MS 培养基上 ,取培养 30 d后生长健壮的试管苗 10瓶.
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA 的提取
DNA 提取采用CTAB 法[ 5] :1)取东北刺人参试管苗 ,称取 0.2 ～ 0.3 g 叶片放在预冷
的研钵中加液氮研成粉末 ,迅速装入 1.5 mL离心管中 ,加入 1 mL 65 ℃预热的CTAB 缓冲
液 ,再加入 200μL的 β -巯基乙醇;2)放在 65 ℃水浴锅中温浴 0.5 ～ 1 h;3)取出 ,待其冷
却至室温后加入等体积氯仿和异戊醇(24:1), 8 000 r/min 离心 15 min ,抽取上清液;4)重
复 3)步骤 1次;5)在上清液中加入 2/3体积冰冷的异丙醇 ,放入-20 ℃冰箱中 30 min;6)
从冰箱中取出离心管 ,用移液枪挑出 DNA ,转入 1.5 mL 小离心管中 ,用 70%乙醇漂洗 3
DOI :10.13478/j.cnki.jasyu.2008.01.007
延　边　大　学　农　学　学　报 第 30卷　
次 ,自然晾干 DNA;7)当沉淀无乙醇气味时加入 1×TE 缓冲液 50 μL ,溶解 DNA;8)离心
管中分别加入 2 μL 的 RNase , 37 ℃水浴锅中温浴 2 h , 5 000 r/min 离心2 min , 取 5
μLDNA 溶液 ,在 0.7%的琼脂糖上电泳 ,检测 DNA 浓度及纯度.检测后的 DNA 在 4 ℃下
待用或-20 ℃长期保存.取等量的东北刺人参 DNA 混成基因池 , 作为优化体系的模板
DNA.
1.2.2　电泳检测提取 DNA 的质量
采用 DYY-12型稳压稳流电泳仪 ,缓冲液为 TBE(0.7%硼酸)的琼脂糖凝胶 ,电泳检
测 ,电压 5 V/cm ,电泳 2 h ,结束后在凝胶成象仪下照相 ,并记录结果.
1.3　PCR扩增条件优化
1.3.1　DNA 扩增反应程序
反应程序设置为:94 ℃预变性 5 min , 94 ℃变性 45 s , 36 ℃退火 1 min , 72 ℃延伸
1.5 min , 40个循环 ,最后 72 ℃延伸 7 min.反应体系为 20μL ,其中含模板 DNA 20 ng ,引物
OPD06(cacccggatg)0.2μmol/ L , dNTP 150μmol/L ,MgCl2 1.5 mmol/L , Taq DNA 聚合酶
1 U , 10×Buffer 2 μL , 其余以重蒸馏水补充至 20 μL.
1.3.2　PCR扩增体系
采用 20 μL 反应体系 ,包括 ddH 2O 、dNTP 、10×Buffer 、MgCl2 、引物 、DNA 模板 、Taq
酶.设置 DNA 模板 2.5 , 5 , 10 , 15 , 20 , 25 ng 6 个处理 ,引物浓度 0.1 , 0.2 , 0.3 , 0.4 , 0.5 , 0.6
μmol/ L 6个处理 , dNTP 设置为 50 , 100 , 150 , 200 , 250 , 300 μmol/L 6 个梯度 , MgCl2 设为
0.5 , 1 , 1.5 , 2 , 2.5 , 3 μmol/L 6个梯度 , TaqDNA 聚合酶设 0.25 , 0.5 , 1 , 1.5 , 2 , 2.5 U (1U
为 0.33μL)6个梯度 ,每次 PCR扩增除比较因素按上述浓度梯度变动外 ,其他反应因子相
同.通过反复对比试验找出最佳反应体系 ,并且每个因素 3次重复进行优化条件的检验.
1.3.3　电泳检测
PCR扩增反应结束后 ,采用 0.5×TBE 电泳缓冲液 , 1.4%的琼脂糖凝胶(含 0.5%EB)
电泳.取 10 μL 扩增产物与 2 μL 电泳载体缓冲液混匀 ,电压为 80 V ,电泳产物在 GDS -
8000型凝胶成像仪下观察 ,拍照.
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA 的检测
提取 DNA 样品的色泽为白色或近白色 , DNA 琼脂糖电泳图谱如图 1(M :100 bp 的
DNA 分子量标记).由图 1可知东北刺人参基因组 DNA 电泳得到的条带比较整齐 、清晰 ,
基本无降解 ,完整性好 ,可用于 RAPD 扩增.
图 1　东北刺人参基因组总 DNA电泳图谱
Fig.1　Electrophresis atlas of the total genomic DAN of Oplpanax elatus Nakai
2
　第 1期 高日 ,等:东北刺人参 RAPD反应体系的优化
2.2　模板 DNA 浓度筛选
模板DNA浓度对 RAPD反应影响较大(图 2 ,M 为 200 bp DNA分子量标记 ,下同),DNA
用量太少或太多均对 RAPD反应不良 ,表现缺失或不明现.当 DNA 浓度在 10 ng 时东北刺人
参能扩增出比较清晰的条带 ,即模板DNA 用量取 10 ng 适合东北刺人参 RAPD反应体系.
2.3　dNTP浓度筛选
dNTP作为 PCR反应的原料参与新链 DNA 的合成过程 ,对循环数、产物扩增的量均有较
大的影响.浓度过低 ,偶然性大 ,无扩增产物或扩增产物不稳;浓度过高则会导致聚合酶错误掺
入 ,影响扩增的特异性和精确性.由图 3可知 , dNTP浓度低于 100 μmol/ L时 DNA 条带缺失
且不清楚 ,当浓度为 250μmol/ L时DNA 条带达到最多 ,但浓度超过 250 μmol/ L时部分条带
缺失 ,因此 , dNTP浓度为 250 μmol/L时扩增效果较好.
2.4　Taq DNA 聚合酶浓度筛选
Taq DNA 聚合酶浓度低于 0.5 U 时扩增的DNA 条带少 ,在 1.5 U 时扩增出较多的 DNA
条带 ,高于 2.0 U 时条带逐渐减少 ,因此 , Taq DNA 聚合酶浓度为 1.5 U 时适合东北刺人参
RAPD反应体系(图 4).
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延　边　大　学　农　学　学　报 第 30卷　
2.5　MgCl2 浓度筛选
MgCl2 是 PCR反应的一个重要影响因子 ,确定 Mg2+最佳浓度至关重要 ,过低时 Taq
DNA 聚合酶有所失活;过高时则会使引物的错配频率增加.由图 5可知 Mg2+浓度低于 1.5
mmol/ L时扩增的条带明显缺失 ,当浓度在 2mmol/L 时东北刺人参扩增条带数最多、图谱清
晰、扩增效果好 ,当浓度大于 2 mmol/L时 ,扩增条带数不再增加且部分条带缺失 ,因此 ,MgCl2
浓度为 2 mmol/ L时比较理想(图 5).
2.6　引物浓度筛选
引物浓度主要影响 RAPD扩增条带的出现和强度 ,当模板DNA 浓度一定时 ,引物浓度决
定着扩增效率与扩增片段的大小.引物浓度过高 ,就会过量扩增小片段(<500 bp);而浓度太
低 ,大的片段很容易被反复扩增.引物含量为 0.4 ～ 0.5 μmol/ L时 ,都能扩增出比较清晰且基
本一致的 DNA 条带 ,即引物浓度为 0.4μmol/L对东北刺人参 RAPD反应体系较好(图 6).
图 6　引物浓度对 RAPD扩增效果的影响
Fig.6　Effect of primer concentration on the amplification of RAPD
3　讨论与结论
PCR扩增反应受多种因素的影响 ,反应混合物中模板DNA 纯度不高 ,残留在模板中的蛋
白质 、酚类等成分都会使 DNA 与引物的结合效率降低 ,造成扩增产物在电泳过程中的弥散现
象[ 6] .本试验提取的 DNA 样品的色泽为白色或近白色 ,适合 RAPD 分析.Taq DNA 聚合酶的
用量不宜过大 ,否则易增加非特异扩增;也不宜过小 ,否则不能得到扩增产物.Mg2+浓度过低
会减少特异性扩增 ,过高又会增加非特异性扩增产物 ,使目标谱带不清晰 ,且还对 Taq DNA 聚
合酶的活性、引物退火 、模板与 PCR产物的变性温度等有影响 ,此外 , dNTP浓度过高会导致
错误参入率 ,对试验的后续工作克隆和测序均有一定影响 ,本试验重复 3次 , RAPD体系重复
性较高 ,能够满足 RAPD技术在东北刺人参种质资源和遗传关系等方面的研究.
通过试验确立了适合东北刺人参的 RAPD 反应体系 ,即 10 ng DNA 模板 , 250 μmol/L
dNTP ,2 mmol/ L MgCl2 ,1×Buffer ,0.4μmol/ L引物 ,1.5 U Taq DNA聚合酶 , 9.8μL ddH2O.反
应程序为:94 ℃预变性 5min ,94 ℃变性 45 s , 36 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 1.5min ,40个循环;最后
72 ℃延伸 7 min.
[下转第 57页]
4
　第 1期 崔昌范 ,等:烤烟降糖 、降淀粉及提高评吸评吸质量的烘烤工艺研究
Studies on decrease sugar starch and enhance smoking
quality of baked technology
CUI Chang-fan , 　XUAN Shou-xue , 　WU Guo-he , 　 SUN Li-juan , 　LIU Yuan-zhe
(Academy o f Agricultural S ciences of Y anbian Universi ty ,Longj ing J i l in 133400 ,China)
Abstract:Defined changing rule of sugar and starch in baked process.And suggested the
baked technology of decrease sugar and decrease starch and enhance smoking quality.
Key words:flue-cured tobacco;starch;sugar;smoking quality
[上接第 4页]
参考文献:
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Optimization of RAPD reaction system of Oplpanax elatus Nakai
GAO Ri
1 , 　LIAN Mei-lan1 , 　WU Song-quan1 , 　PIAO Xuan-chun1＊ , 　LIN Chang-chun2
(1.Agricultural Col lege o f Yanbian Universi ty , Long j ing J i lin 133400 ,China;
2.Forestry Bureau of Y anj i Ci ty ,Yanj i J i l in 133000 ,China)
Abstract:Optimization of RAPD reaction sy stem for Oplpana x elatus Nakai was es tab-
lished w ith fresh leaves.The results indicated that in 20.0 μL reaction system , include
250.0μmol/ L dNTP , 2.0 mmol/ L M gCl2 , 1×Buffer , 0.3 μmol/L primer , 10.0 ng tem-
plet DNA , 1.5 U Taq DNA polymerase and 9.8μL ddH 2O;amplification procedure was in-
itial denaturation of 5 min at 94 ℃;40 cy cles of 45 s at 94 ℃, 1 min at 36 ℃, 1.5 min at
72 ℃and finally 7 minute at 72 ℃.
Key words:Oplpanax elatus Nakai ;RAPD;optimization
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