全 文 ：收稿日期:2010-10-25　　　修回日期:2010-12-10
作者简介:刘素琪(1972-),女(汉),山西太原人 ,讲师 ,主要从事植物源农药等方面的研究。
基金项目:山西农业大学科技创新基金(2009019)
J.SHANXI AGRIC.UNIV.(Natura l S cience Ed i tion)
学报(自然科学版)2011 , 31(2) 002760
地肤子活性组分对山楂叶螨体内保护酶活性的影响
刘素琪1 ,王海香2 ,郝晓娟1 ,莫海波1 ,李向花1 ,曹挥1
(1.山西农业大学农学院 山西太谷 030801;2.山西农业大学 林学院 ,山西太谷 030801)
摘　要:为探索地肤子活性组分对螨类保护酶的影响 ,进一步了解其作用机理 , 为开发新型植物性杀螨剂提供依据 , 用
地肤子活性流分(KFCE-2), 采用叶碟浸渍法处理苹果山楂叶螨 ,观察试螨的症状表现;并用生化的方法测定了用地
肤子活性组分处理山楂叶螨后其体内保护酶的变化。结果表明 , 试螨被处理后 ,症状表现为四个时期:静止期(0 ～ 4
h);兴奋期(4～ 8 h);痉挛期(8 ～ 16 h);死亡期(16 ～ 24 h)。处理后试螨体中的 SOD活性增高 , 显著高于对照组 , 尤其
是在 4 h 和 16 h ,其活力分别为对照组的 19.3倍和 42倍。处理组 POD活性在 6 ～ 10 h 和 22 h 以后 , 活性受到了不同
程度抑制 ,其余时间被激活;处理组螨体内 CAT 活性在 8～ 14 h 和 20 h 以后 , 活性受到了不同程度的抑制 ,其余时间
被激活。综合考虑用地肤子活性成分处理山楂叶螨后其体内三种保护酶和症状变化 ,自由基毒害可能是引起螨过度
兴奋和死亡的原因之一。
关键词:地肤子;山楂叶螨;保护酶
中图分类号:S482.1　　文献标识码:A　　文章编号:1671-8151(2011)02-0126-04
Effects of the Chloroform Extracts of Kochia Scoparia (L.)on the Activity of Protective Enzymes in
Tetranychus Viennensis
LIU Su-qi1 ,WANG Hai-xiang2 ,HAO Xiao-juan1 ,MO Hai-bo1 ,LI Xiang-hua1 , CAO Hui1
(1.College o f Agriculture , Shanx i Agricultural University , Taigu Shan xi , 030801 ;2.College of Foresty , Shan xi
Agricultural Univ ersity , Taigu Shan xi 030801 , China)
Abstract:This pape r aims to find the effects o f the activitive compounds o f Kochia scoparia on the protectiv e enzymes
of Tetranychus v iennensis , to provide scientific evidences for fur the r re sear ch on the mechanism of action and develop-
ment o f new bo tanical acaricides.The dip-moulding method w as used in this experiment.The symptom o f mites trea-
ted with KFCE-2 w as observ ed and the changes of the protectiv e enzymes of the se mites w ere tested by using bio-
chemical method.The re sults showed tha t the symptoms of t reated mites had four periods:stationary period(le ss than
4 hour s), excitement period (f rom 4 to 8 hours), spasm per iod (f rom 8 to 16 hours)and death period(fr om 16 to 24
hours).The activities of SOD in treated mites increa sed more significantly than those in the cont rol , especially from 4
to 16 hour s , when the SOD activities in tr ea tment wer e as 19.3 times and 42 times as tho se in cont rol.The activitie s of
POD in trea ted mites reduced to different deg rees f rom 6 to 10 hour s and in 22 hour s , but incr eased a t o ther times.The
activities of CAT in t reated mites were also reduced fr om 8 to14 hour s and in 20 hour s and increased at other times.In
consider ation of the changes of symptom s and three different pro tectiv e enzymes in treated mites , it w as conjectured
that the contamina ted free r adical in mites wa s one o f the reasons w hich caused t reated mite s exce ssiv e excitement and
death.
Key words:Kochia scoparia;Tetranychus viennensis;Protective enzyme
　　植食性螨类是公认的难以防治的有害生物群
落 ,近年来 ,由于专一杀螨剂的大量重复使用 ,导致
螨类抗性迅速上升 ,而具有杀螨谱广 、速效性和持
效性 、不易产生抗性 、对农作物安全的品种却很
少[ 1] 。深入研究杀螨剂的作用机理并寻找和设计
具有完全新型化学结构的先导化合物 ,是寻找全新
的或高效杀螨剂的主要途径。
地肤[ K ochia S coparia (L .)Schrad.] ,俗名
扫帚菜 ,扫帚苗 ,属藜科地肤属一年生草本植物 ,是
我国的传统野菜 ,也是一种传统的中药材 ,其以子
入药 ,可治赤白痢 ,泄泻 ,热淋 ,目赤 ,雀盲 ,皮肤内
热赤肿[ 2] 。地肤提取物的有很好的杀螨活性[ 3 , 4] ,
并且其氯仿提取物对山楂叶螨体内谷胱甘肽-S
-转移酶和羧酸酯酶有较强的激活作用 ,对单胺氧
化酶 、Ca2+ -ATP 酶活力有一定程度的抑制作
用[ 5] ,经对地肤不同部位提取物杀螨活性研究发
现 ,地肤子提取物的杀螨效果最好[ 6] 。
当生物体受化学药剂刺激后 ,体内通过代谢会
产生一些活性氧自由基。超氧化物歧化酶(SOD)、
过氧化氢酶(CA T)、过氧化物酶(POD)是生物体
内重要的保护酶 。它们能够清除细胞内的自由基 ,
防止自由基毒性 ,在维持生物体正常的生理活动中
起着重要的作用[ 7] 。但关于药剂处理后 ,螨类体内
保护酶的变化目前尚未见到报道。
本研究以地肤子为材料 ,研究了其活性成分对
山楂叶螨体内保护酶的影响 ,并结合药剂处理后螨
的症状进行了观察 ,旨在探索地肤子对螨类的影
响 ,为进一步了解其作用机理 ,开发新型植物性杀
螨剂提供依据。
1　材料与方法
1.1　实验材料
　　试验所用地肤子采自山西农业大学校园内
(2008年 8月),将采集的植物材料洗净后烘干(40
～ 45℃),磨碎 ,过 60目筛 。
山楂叶螨(Tetranychus viennensis)为室内饲
养的敏感品系 ,养虫温度(25±1)℃,相对湿度(50
±10)%,光照(L ∶D为 18∶6)。
1.2　活性组分的分离
准确称取一定量的植物干粉 ,装入广口瓶内 ,
加入干粉 5倍量的有机溶剂(氯仿),室温下(30±
2℃)分别浸提 3次 ,每次 3 ～ 5 d ,减压浓缩 ,合并 3
次的提取物。将提取物用常规层析柱进行分离 ,溶
剂系统为氯仿—甲醇 ,洗脱液的流速为 3 ～ 4 滴·
S
-1 ,每流分收集 50 mL ,共得流分 236个 ,经薄层
层析(T LC)后 ,置于荧光检测灯(254 nm , 356 nm)
下检测 ,将相同成分者合并 ,最终得到流份 11个 。
将 11个流份减压浓缩后 ,进行生物活性测定 ,以流
分 2(KFCE-2)活性最强[ 6] 。
1.3　症状观察
叶碟浸渍法:取平展的苹果叶片洗干净 ,叶面
朝下放到水培养台上 ,每一叶片挑入成螨 20 头以
上 ,待成螨稳定后 ,夹取叶片浸入药液 5 s ,对照为
清水 ,将叶面朝下放到水培养台上 ,叶片边缘用湿
棉条围住 ,防止螨体逃逸。从 2 h 到 24 h 每隔两
小时观察一次成螨的状况 ,并记录其活动情况及反
应[ 8] 。
1.4　保护酶活性测定
酶液制备:分别在触杀处理后 4 h 、8 h 、12 h 、
16 h 、20 h 、24 h取山楂叶螨雌成虫 100头 ,加少量
聚乙烯吡咯烷酮(pvp), 1.5 mL 0.05 mol · L-1
pH 7.0 磷酸缓冲液及少许石英砂 ,冰浴条件下充
分研磨成匀浆 ,转入离心管 , 10 000 r·min-1 ,4℃
下离心 15 min ,取上清液备用 。
超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定:参照
Beauchamp 和 Fridovich(1971)方法测定[ 9] ,并根
据具体情况和预备试验结果略加改进 。3 mL
NBT 反应液中含 50 mmol ·L-1磷酸缓冲液(PH
=7),13 mmol·L-1蛋氨酸 ,75 μmo l·L-1氮蓝四
唑(NBT),0.1 mmo l·L -1乙二胺四乙酸(EDTA)
和 50 μL 酶液 ,最后加 4μmol·L-1核黄素。置于
3000 lx 日光灯下进行光反应 ,反应温度为 25 ℃,
照光 15 min ,然后用黑暗终止反应 ,立即在 722分
光光度计 560 nm 处测吸光度值 ,以内装 NBT 反
应液但不加酶液的试管进行光照的作为对照 ,以内
装 NBT 反应液不加酶液但置于暗处的作为参比 。
一个酶活单位为相当于引起 3 mL 反应液达到
50%抑制所需的酶量。
过氧化氢酶(CA T)活性的测定:取粗酶液 0.1
mL ,加入 0.2%H2O2 1 mL ,蒸馏水 1.9 mL ,以不
加酶液为对照 ,混匀反应 3 min ,测定反应液在 240
nm处的吸光值 ,以每分钟吸光值变化 0.01 定义
为 1个酶活力单位 。
过氧化物酶(POD)活性的测定:参照改进的
Simon 等(1974)方法测定[ 10] 。反应体系中含 2
mL 0.05 mo l · L-1 磷酸缓冲液 、1.0 mL 2%
H 2O 2 、0.5 mL 0.05 mol · L -1愈创木酚和 0.15
mL 酶液 ,以不加酶液为对照 ,作用 5 min ,用 722
型分光光度计在 470 nm 波长下测吸光度值变化 。
放好后立即读数并记录 ,60 s读一次 ,共读 5次 。
12731(2) 刘素琪等:地肤子活性组分对山楂叶螨体内保护酶活性的影响
2　结果与分析
2.1　KFCE-2处理后雌成螨的症状表现
　　通过症状观察 , KFCE-2 对成螨的作用大致
可划分为 4个阶段:
静止期(0 ～ 4 h):少数螨不停地运动 ,但大部
分静止 ,足呈伸展放松状态 ,无明显反应;
兴奋期(4 ～ 8 h):站立不稳 ,频繁爬动 ,步态失
调 ,运动不停 ,四处扩散;
痉挛期(8 ～ 16 h):过度兴奋 ,身体倾斜 ,运动
失调 ,原地打转 ,身体重心抬高 ,足颤抖 ,有黑色排
泄物 ,产卵量急剧下降;
死亡期(16 ～ 24 h):身体逐渐收缩至死亡 。
2.2　对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
KFCE-2处理雌成螨体内 SOD 活性变化如
图 1所示 ,不论是对照组还是处理组 SOD活性都
呈波浪式变化 ,而且变化趋势大致相同 ,但处理组
SOD活性均高于对照组 ,尤其是在 4 h和 16 h时 ,
处理组 SOD活性显著高于对照组 ,其活力分别为
对照组的 19.3 倍和 42 倍。这表明在处理后的
24h中 ,螨体内对药剂的刺激能够做出相应的氧化
解毒反应 ,因此表现为 SOD活性的增高 。
图 1　KFCE-2 对山楂叶螨 SOD活性的影响
Fig.1　Effects of KFCE-2 on SOD
2.3　对过氧化物酶(POD)活性的影响
从图 2可以看出 , KFCE-2 处理山楂叶螨雌
成螨后 ,对照组和处理组体内 POD活性均呈波浪
式变化 ,在 2 h 时 ,处理组 POD活性高于对照组 ,
其活力为对照组的 1.5 倍;7 h 到 11 h ,处理组
POD活性受到一定程度的抑制;16 h到 20 h ,处理
组螨体内 POD活性均高于对照组 ,分别为对照组
的 1.38倍和 2倍;在 24 h时 ,处理组螨体内 POD
活性急剧下降 ,其活力只有对照组的 0.5 倍 ,可能
是药剂刺激后 ,氧自由基体内的聚集 ,破坏了生物
功能分子机能 ,使 POD的合成受阻所致 。
图 2　KFCE-2 对山楂叶螨 POD 活性的影响
Fig.2　Effects of KFCE-2 on POD
2.4　对过氧化氢酶(CA T)活性的影响
KFCE-2处理山楂叶螨雌成螨后 ,体内 CAT
活性变化结果如图 3 ,无论对照组还是处理组 ,螨
体内 CA T 活性变化趋势大致相同 , 0 h 到 4 h ,处
理组螨体内 CA T 活性高于对照组 , 是对照组的
1.31倍;在 8 h 和 12 h 时 ,处理组 CAT 活性被抑
制 ,为对照组的 0.84和 0.71;16h时 ,处理组 CAT
活力达到最高 ,为对照组的 1.7倍;但在随后的8 h
内 ,处理组 CA T 活力又开始下降 ,在 24 h 时下降
到最低 ,为对照组的 0.65倍 。处理组 CA T 活性
被抑制 ,可能会造成氧自由基在体内的聚集 ,从而
导致虫体死亡 。
图 3　KFCE-2 对山楂叶螨 CAT 活性的影响
Fig.3　Effec ts o f KFCE-2 on CAT
3　结论与讨论
当生物体受化学药剂刺激后 ,体内通过代谢会
产生一些活性氧自由基如超氧阴离子 、氢氧根负离
128 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2011
子 、过氧化氢 、羟自由基 、单线态氧等物质 ,它们有
很强的氧化能力 ,很可能把进入到体内的化学药剂
氧化解毒 ,使杀虫剂的功效降低或丧失[ 11 , 12] 。同
时 ,氧化能力很强的氧自由基也会在体内聚集 ,破
坏生物功能分子机能 ,使细胞功能受到威胁。生物
体会通过体内存在的过氧化物酶(POD)、过氧化
氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等保护酶系
统清除细胞内的自由基 ,防止自由基毒害 ,维持生
物体的正常生理活动 , Fridovish 将这三种酶称为
保护酶系统[ 7] 。
在正常情况下 ,细胞内自由基的产生 、清除与
SOD 、CA T 及 POD三种酶协调一致 , SOD氧化生
物体内的超氧物离子生成 H2O2 ,而 H 2O 2 通过细
胞内的 CA T 和 POD 来分解 ,它们之间处于一种
动态平衡状态 ,使细胞内自由基维持在一个低水
平 ,从而防止自由基毒害[ 13] 。
从本实验的结果可以看出 ,在药剂处理的初期
(0 ～ 8 h),三种保护酶均处于被激活的状态 ,螨体
在进行积极的解毒作用 ,从症状上来看 ,螨处于静
止期和兴奋期;但在 8 ～ 16 h左右 , POD(7 ～ 11 h)
和 CAT(8 ～ 14 h)的活性受到了不同程度的抑制 ,
可能会影响到氧自由基的清除 ,从而使其在螨体内
聚集 ,此时螨体表现为过度兴奋 ,身体倾斜 ,运动失
调 ,原地打转 ,身体重心抬高 ,足颤抖 ,有黑色排泄
物 ,产卵量急剧下降 ,处于痉挛期;随后 ,处理组的
三种酶活性都高于对照组 ,直到处理组的螨进入大
量死亡期(22 h 左右), POD(22 h)和 CA T(20 h)
活性又被强烈的抑制。
综合考虑地肤子活性成分处理山楂叶螨后 ,其
体内三种保护酶和症状的变化过程 ,虽然不能肯定
自由基毒害是引起螨过度兴奋和死亡的主要原因 ,
但可以看出它们之间有一定的关联。药剂处理山
楂叶螨后 ,螨体内酶的变化是一个比较复杂的过
程 ,从症状表现上可以推测 ,神经系统可能是地肤
子活性成分作用的一个重要位点 ,但仍需要进一步
的深入研究。
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(编辑:马荣博)
12931(2) 刘素琪等:地肤子活性组分对山楂叶螨体内保护酶活性的影响