全 文 ：分，它们能够与降糖组分协同作用，影响其降糖活性，其结构及作
用机理还有待进一步研究。
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收稿日期:2012-12-28; 修订日期:2013-06-27
基金项目:安徽中医学院大学生科研基金资助(201206)
作者简介:朱玲玲(1990-) ，女(汉族) ，江苏宿迁人，现为安徽中医学院学
生．
* 通讯作者简介:程惠娟(1953-) ，女(汉族) ，上海人，现任安徽中医药大
学副教授，硕士研究生导师，主要从事中药抗感染与免疫研究工作．
鱼腥草素钠对头孢他啶
抗铜绿假单胞菌生物被膜的增强作用及抗菌协同作用
朱玲玲，孙振新，程惠娟* ，陈逸杰，刘 彬，张昌峰，朱小明
(安徽中医学院，安徽 合肥 230038)
摘要:目的 研究鱼腥草素钠对头孢他啶抗铜绿假单胞菌生物被膜的增强作用及两药抗菌协同作用。方法 微量倍比稀
释法测定头孢他啶、鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC) ，棋盘稀释法测定两药协同抗菌作用，结晶紫染色
法［1］测定单药及联合用药对铜绿假单胞菌生物被膜的最小抑膜浓度(SMIC) ，肉眼观察药物对铜绿假单胞菌菌毛介导蹭
行运动的影响，扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)下观察药物对生物膜形态的影响。结果 头孢他啶对铜绿假
单胞菌的 MIC 4 μg /ml，鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的 MIC 512 μg /ml，两药联合后，头孢他啶对铜绿假单胞菌的 MIC 1
μg /ml，鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌的 MIC 64 μg /ml，部分抑菌浓度指数(FIC，FIC =联合用药时甲药 MIC /单独应用甲药
时 MIC +联合应用乙药时 MIC /单独应用乙药时 MIC)为 0． 375，表明两药有协同抗菌作用。头孢他啶对铜绿假单胞菌生
物被膜 SMIC50粘附期为 16 μg /ml ，早期生物被膜阶段 16 μg /ml，成熟期生物被膜阶段 32 μg /ml，两药联合后铜绿假单胞
菌生物被膜 SMIC50 粘附期为 8 μg /ml ，早期为 8 μg /ml，成熟期为 16 μg /ml，鱼腥草素钠对头孢他啶抗铜绿假单胞菌生
物被膜有增强作用。肉眼观察蹭行运动，协同组抑制效果最佳。电镜下，协同组抑制铜绿假单胞菌生物被膜效果最强。
结论 鱼腥草素钠能显著增强头孢他啶抗铜绿假单胞菌生物被膜的作用，且两药具有协同抗菌作用。
关键词:鱼腥草素钠; 头孢他啶; 铜绿假单胞菌; 生物膜
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 10． 017
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2013)10-2353-03
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是临床上重要的
条件致病菌，PA对几乎所有抗生素都有耐药性，其重要原因之
一是与生物被膜(biofilm，BF)的形成密切相关［2］。生物膜是细
菌为了适应生存环境而形成的与浮游细胞相对应的生存形式，是
指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的
水合性基质所组成的结构性细菌群落［3］。近年来有关生物膜研
究发现［4 ～ 7］，中药在防治细菌生物膜感染方面具有独特的优势。
据相关文献［8］显示清热解毒类中药鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌
的黏附有较强的清除活性，通过连续给药能抑制铜绿假单胞菌生
物被膜的形成。据报道［9］，头孢他啶也能抗铜绿假单胞菌生物
被膜的形成。本实验在此基础上，探究鱼腥草素钠对头孢他啶对
抗 PA 生物膜的增强作用及联合抗菌作用，为临床治疗提供依
据。
1 材料
1． 1 药物 鱼腥草素钠(中国药品生物制品检定所，100247 －
199601) ，头孢他啶(华北制药河北华民药业有限责任公司，国药
准字 H20063845)
1． 2 菌株及培养基 铜绿假单胞菌(临床菌 ATCC 27853) ，由安
徽中医学院第一附属医院细菌室提供。营养琼脂(青岛高科技
园海博生物技术有限公司 HB0109) ，LB 肉汤(北京奥博星生物
技术有限责任公司 02 － 136) ，胰酪胨大豆肉汤(TSB)培养基(北
京奥博星生物技术有限责任公司 02 － 102) ，MH(B)培养基，蹭行
运动培养基(1%胰化蛋白胨、0． 5 氯化钠%、0． 6%葡萄糖、和
0． 35%琼脂)。
1． 3 主要试剂及仪器 pH 7． 4 磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 10 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 10 期
Solutions，PBS) ，95%乙醇(上海苏懿化学试剂有限公司) ，结晶紫
(天津市光复精细化工研究所，分析纯) ，25%戊二醛溶液(湖南
湘药制药有限公司)。扫描电镜(SEM) (Sirion200，FEI 公司) ，96
孔平板、6 孔平板(杭州生友生物技术有限公司) ，DHP － 9162 型
电热恒温箱(上海一恒科技有限公司) ，Stat Fax － 2100 酶标仪
(美国 AWAＲENESS)。
2 方法
2． 1 菌液 通过麦氏管比浊法将 PA 的菌液浓度调整为 0． 5 号
麦氏管浊度，再稀释 200 倍约至 1 × 105 CPU /ml 备用(除特殊说
明以下细菌均用此浓度)。
2． 2 测定头孢他啶、鱼腥草素钠对 PA的 MIC 头孢他啶和鱼腥
草素钠分别用 MH(B)培养基稀释成 12 个浓度梯度:1024，512，
256，128，64，32，16，8，4，2，1 和 0． 5 μg /ml。上述各浓度的药物分
别加入 96 孔板中，100 μl /孔。每药物孔中加入约 1 × 105 CPU /
ml的菌液，100 μl /孔。37℃培养 24h 后，观察细菌生长状况，以
无菌生长的最小药物稀释浓度为 MIC。
2． 3 测定鱼腥草素钠和头孢他啶的协同的 MIC 鱼腥草素钠用
MH(B)培养基稀释成 8 个浓度梯度:2MIC、1MIC 依次至 1 /
64MIC。头孢他啶用 MH(B)稀释成 8 个浓度梯度:2MIC、1MIC
依次至 1 /64MIC。用棋盘稀释法向 96 孔板中加药物，100 μl /孔。
各药物孔中加入约 1 × 105 CPU /ml的菌液，100 μl /孔。37℃培养
24 h后，观察细菌生长情况，以无菌生长的最小药物稀释浓度为
MIC。
2． 4 测定鱼腥草素钠、头孢他啶单药及协同对 PA 生物被膜的
SMIC 单药:鱼腥草素钠用 TSB 培养基稀释成 7 个浓度梯度:
1024，512，256，128，64、32 和 16 μg /ml。头孢他啶用 TSB 培养基
稀释成 7 个浓度梯度:32，16，8，4，2，1 和 0． 5 μg /ml。取 3 套 96
孔板，分别标为 1、3 和 7d 检测，每块 96 孔板第 1 ～ 8 列，每列 4
个复孔加入 TSB 培养基和约 1 × 105 CPU /ml 的菌液各 100 μl /
孔，37℃培养 24 h后，用 PBS 溶液漂洗三次，再加入上述各浓度
鱼腥草素钠含药培养基，200 μl /孔，每个浓度 4 个复孔，第 8 列只
加 TSB培养基作为阴性对照。37℃培养 1，3，7d(每天换 1 次
药)。结晶紫染色法检测抑制生物被膜 50%(SMIC50)的药物浓
度:弃去培养液，将培养板用水漂洗以去除剩余的细菌及培养基，
加现配的 0． 1%结晶紫染液 250 μl /孔，室温 10 ～ 15 min，用水冲
洗瞌干多余的染料，干燥数小时或过夜后，再加入 30%的乙酸
250 μl /孔，室温 10 ～ 15 min，在酶标仪 OD630 nm 下检测吸光度。
同样的方法测定头孢他啶对 PA生物膜的 SMIC50。协同试验:鱼
腥草素钠用 TSB 培养基稀释成 1 024 μg /ml 。头孢他啶用 TSB
培养基稀释成 7 个浓度梯度:64，32，16，8，4，2 和 1 μg /ml，取 3 套
96 孔板，同单药一样处理后，连续给药(1 024 μg /ml鱼腥草素钠
和头孢他啶某个浓度)培养 1，3，7 d，每个浓度 4 个复孔，第 8 列
只加培养基作为对照，每天换药。同样的方法测定两药协同对
PA生物膜的 SMIC50。
2． 5 记录鱼腥草素钠、头孢他啶单药及协同对 PA 蹭行运动的
影响 培养方法同“2． 4”，取培养 1，3 和 7 d的鱼腥草素钠各浓度
的培养液 5μl /孔点于蹭行运动培养皿的底部，隔夜观察并记录
菌圈的大小。同样的方法观察并记录头孢他啶及协同菌圈大小。
2． 6 观察鱼腥草素钠、头孢他啶单药及协同对 PA 生物膜形态
的影响 鱼腥草素钠用 TSB培养基稀释成 1024，512 μg /ml，头孢
他啶用 TSB培养基稀释成 8，4 μg /ml。取 6 孔板 1 块其中 4 个孔
分别作为鱼腥草素钠组、头孢他啶组、协同组、对照组，每孔加入
180 μl TSB培养基和约 1 × 105 CPU /ml的菌液 40 μl，再分别放入
已灭菌的盖玻片 2 片作为载体，37℃培养 24 h后，用 PBS溶液漂
洗三次，鱼腥草组加入 2 ml的 512 μg /ml 的鱼腥草素钠溶液，头
孢他啶组加入 2 ml的 4 μg /ml的头孢他啶溶液，协同组加入 1 ml
的 1024 μg /ml鱼腥草素钠溶液和 1 ml 的 8 μg /ml 头孢他啶溶
液，对照组只加 2 ml TSB 培养基，每天换药。7 d 后各取 1 片经
PBS漂洗数遍后用 2． 5%的戊二醛固定过夜，再用 PBS 漂洗三
次，再分别用浓度为 20%，50%，70%，100%依次脱水，每个浓度
脱水 5 min，待干燥后镀金，用 SEM观察生物被膜形态结构。
2． 7 统计学方法 数据处理 SPSS11． 0 软件采用两独立样本方差
分析对相关数据进行统计，数据以 珋x ± s 表示，组间比较采用 t 检
验;图形处理 GＲAPHPAD软件。
3 结果
3． 1 药物对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)单独用药时
鱼腥草素钠 MIC512 μg /ml、头孢他啶 MIC4 μg /ml;联合用药后鱼
腥草素钠 MIC64 μg /ml、头孢他啶 MIC 1 μg /ml根据以上结果计
算分级抑菌浓度指数(FIC)为 0． 375，FIC ＜ 0． 5，表明鱼腥草素钠
和头孢他啶具有协同抗 PA作用。
3． 2 鱼腥草素钠、头孢他啶单药及协同对 PA 生物被膜的 SMIC
结果见表 1。1，3，7 d 的两药协同抗 PA 生物被膜作用都比各单
药的好。
表 1 鱼腥草素钠、头孢他啶及协同
对铜绿假单胞菌生物被膜的 SMIC50 μg·ml －1
药物 1d 3d 7d
鱼腥草素钠 128 128 256
头孢他啶 16 16 32
两药协同(头孢他啶) 8 8 16
3． 3 鱼腥草素钠、头孢他啶单药及协同对 PA 蹭行运动的影响
结果见图 1。数据显示两药协同作用显著，鱼腥草素钠显著增强
头孢他啶抗菌作用。
(珋x ± s，n = 4，与阴性对照组比较，1P ＜ 0． 05，3P ＜ 0． 001)
图 1 3 天鱼腥草素钠、头孢他啶及联合
对铜绿假单胞菌蹭行运动的影响
3． 4 扫描电镜下铜绿假单胞菌生物被膜的形态 结果见图 2。扫
描电镜下，阴性对照组黏附载体上有较多的生物被膜，生物被膜
还包裹着密集的细菌，与阴性对照组比较，两个单药组粘附载体
上生物被膜及细菌均较少，而协同组黏附载体上仅有少量细菌，
几乎没有生物被膜，显示鱼腥草素能钠显著增强头孢他啶抗铜绿
假单胞菌生物被膜及抗菌协同作用。
4 讨论
铜绿假单胞菌为条件致病菌［10］，是医院内感染的主要病原
菌之一。患代谢性疾血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些
治疗后的患者易感染。临床发现该菌对化学药物的抵抗力比一
般革兰氏阴性菌强大，对磺胺，链霉素，氯霉素敏感，但极易产生
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 10
耐药性。第三代头孢菌素中的头孢他啶是经典的抗铜绿假单胞
菌药物，但近年耐药菌株也在迅速增加，临床抗感染的经验证明，
单一抗生素对大多数 G －杆菌尤其是铜绿假单胞菌的治疗不理
想，因其很快就会出现耐药株，从而导致治疗失败。有不少文
献［11 ～ 15］报道两中抗菌药物联合可增强疗效。但是抗菌药物的大
量使用会导致耐药问题更加严重。
a －培养 7d鱼腥草素钠组(20000 ×) ;
b －培养 7d头孢他啶组(20000 ×) ;
c －培养 7d联合组(20000 ×) ;
d －培养 7d空白对照组(20000 ×)
图 2 扫描电镜下鱼腥草素钠组、头孢他啶组、两药联合组及
空白对照组对铜绿假单胞菌生物被膜的形态的影响及抗菌作用
近年有研究表明清热减毒的中药也有抗生物被膜作用，中药
具毒副作用小、不易产生耐药性、效果持久等优点，但中药体外实
验常显示抗菌作用弱于抗生素，而抗生素长期使用会产生耐药的
选择压力。因此，本实验尝试用中药有效成分鱼腥草素钠与头孢
他啶联合，中西医结合用药，优势互补，探究中药有效成分鱼腥草
素钠对抗生素抗铜绿假单胞菌生物被膜的增强作用及协同抗菌
作用。本实验研究发现两药联合前鱼腥草素钠 MIC 512 μg /ml、
头孢他啶 MIC 4 μg /ml，联合用药后鱼腥草素钠 MIC 64 μg /ml、
头孢他啶 MIC 1 μg /ml，部分抑菌浓度指数 0． 375(小于 0． 5) ，说
明两药具有抗菌协同作用。结晶紫染色法用来测定单药、联合用
药的最小抑膜浓度，实验结果表明鱼腥草素钠对各浓度梯度的头
孢他啶抗生物被膜都有增强作用。蹭行运动能够反映细菌粘附
性及运动能力，蹭行运动的实验结果显示，鱼腥草素钠头孢他啶
联合后对铜绿假单胞菌的蹭行运动抑制能力强于单药组，据报
道［15］纤毛介导的蹭行运动是早期生物被膜形成中黏附的重要方
式，可能影响成熟生物被膜的形态。以上结果表明鱼腥草素钠在
生物被膜形成的粘附阶段对头孢他啶康细菌粘附就有增强作用。
扫描电镜下对铜绿假单胞菌生物被膜形态的观察更证实了上述
实验结果，两药联合组未观察到生物被膜形态。
综上所述，头孢他啶与鱼腥草素钠联合用药时，鱼腥草素钠
能显著提高头孢他啶抗铜绿假单胞菌生物被膜的作用及协同抗
菌作用。由于 PA生物被膜的表达受基因控制［16］，鱼腥草素钠联
合头孢他啶如何抑制 PA 生物被膜基因表达还有待进一步的研
究，在体内鱼腥草素钠能否增强头孢他啶抗铜绿假单胞菌生物被
膜作用及协同抗菌作用还有待研究。
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