全 文 ：收稿日期:2013-11-29; 修订日期:2014-05-06
基金项目:国家自然科学基金面上项目(No． 81173629)
作者简介:黄卫锋(1986-) ，男(汉族) ，安徽界首人，安徽中医药大学中西医结合临床学院在读硕士研究生，主要从事中药抗生物被膜研究工作．
* 通讯作者简介:程惠娟(1953-) ，女(汉族) ，上海人，安徽中医药大学中西医结合临床学院副教授，硕士研究生导师，主要从事微生物与免疫教学研究
工作．
鱼腥草素钠预防生物被膜引起的
早期肺气虚证的研究
黄卫锋，段强军，吴大强，濮燕屏，邵 菁，程惠娟*
(安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽 合肥 230038)
摘要:目的 研究鱼腥草素钠早期抗大鼠呼吸道生物被膜菌感染预防肺气虚证发生的作用。方法 健康 SD 大鼠随机分
为正常对照组、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)标准株(ATCC27853)和铜绿假单胞菌临床株(AH16)分别包括
模型组、鱼腥草素钠(SH)治疗组和阿奇霉素(AZM)阳性对照组。将呼吸道生物被膜菌铜绿假单胞菌标准株(Pa)和临床
株(AH16)以滴鼻法感染大鼠，并辅以寒冷、疲劳刺激引起大鼠呼吸道慢性感染，诱导大鼠肺气虚证的发生。治疗组与阳
性对照组于感染成功后分别用鱼腥草素钠及阿奇霉素治疗。观察各组证候表现、血气变化，酶联免疫吸附法测定肺泡灌
洗液中白细胞介素 － 8(IL － 8)的含量变化，HE染色镜下观察肺支气管组织器官病理改变。结果 模型组的大鼠证状符
合肺气虚证的证候表现;药物治疗组肺气虚证状不明显;血气分析表明，模型组大鼠血液中动脉氧分压(Partial pressure of
oxygen，PO2)均显著下降，与正常对照组比较，P ＜ 0． 05，或 P ＜ 0． 01，而二氧化碳分压(Partial pressure of carbon dioxide，
PCO2)均显著升高与正常对照组比较(P ＜ 0． 05) ;治疗组大鼠血液中 PO2 和 PCO2 变化不明显，与正常对照组比较
P ＞ 0． 05;模型组大鼠肺部灌洗液中的 IL － 8 的含量均明显升高，与正常对照组比较，P ＜ 0． 05，或 P ＜ 0． 01;病理学检查模
型组肺及支气管炎症明显，肺部特征符合慢性支气管炎、肺气肿病理变化 ，鱼腥草素钠治疗组和阿奇霉素阳性大鼠肺部
无病理变化出现。结论 鱼腥草素钠早期干预铜绿假单胞菌生物被膜呼吸道感染的大鼠能预防肺气虚证的发生。
关键词:鱼腥草素钠; 铜绿假单胞菌; 生物被膜; 肺气虚证
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 11． 005
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2014)11-2577-03
Effects of Sodium houttuyfonate prevent the happening of the lung Qi deficiency syn-
drome in early － infected rats inducted by bacterial biofilm
HUANG Wei-feng，DUAN Qiang-jun，WU Da-qiang，PU Yan-ping，SHAO Jing，CHENG Hui-juan*
(School of Chinese and Western Integrative Medicine，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，Chi-
na)
Abstract:Objective To explore the effects of Sodium houttuyfonate initially prevent the happening of the lung Qi deficiency syn-
drome in rats inducted by pseudomonas aeruginosa biofilm． Methods Healthy SD rats were randomly divided into normal control
group，P． aeruginosa standard strains (ATCC27853，Pa)group and clinical strains of P． aeruginosa (AH16)group including the
model group，Sodium houttuyfonate(SH)treatment group and azithromycin(AZM)positive control group，respectively． The cul-
tures of standard (Pa)and clinical (AH16)strains were dropped into the noses of the rats combined with stimulations of cold and
fatigue ，respectively，causing respiratory tract of chronic infection in rats to induce the occurrence of lung Qi deficiency syndrome
in rats． After successful infected，the treatment group and positive control group of animals were treated by sodium houttuyfonate
and azithromycin，respectively． The syndrome changes in blood gas were observed． The changes of Interleukin － 8 (IL － 8)in alve-
olar lavage fluid were determined using Enzyme － linked immunosorbent assay． The HE dyeing observation lung and bronchial tis-
sue pathological variations were identified under microscope． Ｒesults The rat features in model group accorded with the symptoms
of lung Qi deficiency syndrome;the symptom of the drug therapy group was not significant comparing to the lung Qi deficiency
symptoms of． Blood gas analysis showed that significant change compared with normal control group in the model group rats;the
infections blood arterial partial pressure of oxygen (PO2)were dropped significantly (P ＜ 0． 05，or P ＜ 0． 01)，while partial pres-
sure of carbon dioxide(PCO2)were significantly higher (P ＜ 0． 05)． Between treatment group compared with normal control
group，PO2 and PCO2 in rat blood were no significant difference (P ＞ 0． 05);Compared with normal control group，IL － 8 levels of
model group rats lung lavage fluid were significantly elevated (P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01) ;Pathological analysis showed that model
group existed apparent lung and bronchial inflammation，to conform to the lung tissue changes in chronic bronchitis，and emphyse-
ma． Pathological changes in sodium houttuyfonate treatment group and azithromycin positive control group were not significant in
lungs of rats． Conclusion Sodium houttuyfonate can initially prevent the happening of the lung qi deficiency syndrome in rats in-
duced by Pseudomonas aeruginosa biofilm．
Key words:Sodium houttuyfonate; Pseudomonas aeruginosa; Biofilm; Lung qi deficiency syndrome
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 11 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 11 期
肺气虚证是肺系病的常见病理证候［1］，是以肺功能减退为
主要特征的全身性多系统、多脏器功能衰退综合征，其发病率随
年龄增长而增加，且证候发展较为缓慢，多为渐进性、持续性，进
而累及多系统、多器官功能障碍，后果严重，难以逆转，已成为老
年人死亡的第一位直接病因。因此，有效预防肺气虚证的发生，
提高老年人的生存质量有着重要意义。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性
(G －)条件致病菌［2，3］，极易形成生物被膜，常导致呼吸道慢性、
反复发作的难治性感染，根据中医久病必虚的理论，感染后往往
诱导肺气虚证的发生。
鱼腥草素钠［SH，CH3(CH2)8COCH2CHOHSO3Na)］是鱼腥
草 (三 白 草 科)鱼 腥 草 素 的 衍 生 物［癸 酰 乙 醛，CH3
(CH2)8COCH2CHO］，我们的实验提示其在体外有抗铜绿假单胞
菌生物被膜作用［4 ～ 8］。本实验探索鱼腥草素钠对铜绿假单胞菌
生物被膜引起呼吸道感染的大鼠肺气虚证的预防作用。
1 材料与仪器
1． 1 菌株 铜绿假单胞菌标准株(Pa)ATCC27853 购于中国药品
生物制品检定，铜绿假单胞菌临床株 AH16，从安徽中医药大学
第一附属医院呼吸道患者痰液中分离、纯化、并经 Vitek 32 全自
动微生物鉴定 /药敏分析仪鉴定。
1． 2 动物 健康 SD雄性大鼠，6 个月龄，体质量(250 ± 10)g，由
江苏大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证:SCXK(苏)
2009 － 0002。
1． 3 主要仪器和试剂 LB 培养基(北京奥博星生物技术有限责
任公司)，鱼腥草素钠片(上海青平药业有限公司 批号:国药准字
H31020701) ，阿奇霉素分散片(沈阳双鹤恩世药业有限责任公司
批号:国药准字 H20057400)，Vitek 32 全自动微生物鉴定 /药敏分
析仪(法国) ，DPH － 9162 型恒温培养箱(上海一恒科技有限公
司)，IL － 8、酶联免疫检测试剂盒(Assay． USA) ，GEM Premier
3000 血气分析仪(Instrumentation Laboratory ，USA) ，SpectraMax
M2e 多功能酶标仪［美谷分子仪器(上海)有限公司］，扫描电镜
(SEM) (Sirion200，FEI公司)等。
2 方法
2． 1 铜绿假单胞菌的检测及体外生物被膜测定 铜绿假单胞菌
接种于 LB 培养基在 37℃下，220 r /min 恒温摇床培养 24h，2000
r /min 离心 10min，倾去上清液，用生理盐水悬起菌团并调到 0． 5
麦氏比色，再用胰蛋白胨大豆肉汤稀释 200 倍，调整菌液浓度为
0． 75 × 106 cfu /ml。将 1ml 该浓度的菌体混悬液接种于 24 孔板
中置入无菌玻片，37℃培养 7d，镀银染色后，扫描电镜观察细菌
形成的生物被膜(扫描电镜在中国科学技术大学电镜室完成)。
2． 2 大鼠肺气虚证模型建立和治疗 健康 SD 大鼠随机分为正
常对照组、铜绿假单胞菌标准株(Pa)和铜绿假单胞菌临床株
(AH16)分别包括模型组、鱼腥草素钠(SH)治疗组和阿奇霉素
(AZM)阳性对照组。每组 15 只。正常对照组正常饲养不做任
何处理。Pa组和 AH16 组分别采用滴鼻法感染菌液 50μl /每鼠
(菌液培养和处理同“2． 1”)。滴鼻当天置入桶内游泳 1 次，水温
控制在 4℃ 左右，游泳时间以大鼠头沉入水中游不动为限，后每
周 1 次。重复 3 次休息 1 周，然后继续上法刺激，直至动物处
死［9］。治疗组和阳性对照组分别于感染成功后，用鱼腥草素钠
和阿奇霉素进行灌胃给药治疗，用药量分别为 100mg /(kg·d)和
10mg /(kg·d)。模型组灌胃生理盐水。正常对照组不作任何处
理正常饲养。连续用药 3 周后停药，60d后观察证候表现。
2． 3 检测项目与方法 各组随机取 10 只大鼠，禁食 24h后，腹主
动脉取血处死，进行各项指标检测。
2． 3． 1 血气分析的检测 将经过抗凝处理的腹主动脉血用血气
分析仪检测，检测指标包括二氧化碳分压(PCO2)和动脉氧分压
(PO2)。
2． 3． 2 大鼠肺部灌洗液中细胞因子 IL － 8 含量的变化 用酶联
免疫检测试剂盒(ELISA) ，按照说明书测不同组别大鼠肺部灌洗
液中白细胞介素 － 8(IL － 8)的含量。
2． 3． 3 病理学检查 大鼠处死后，取右肺组织上叶相同部位肺组
织一块，置 10%甲醛固定 24h，常规脱蜡至水，石蜡包埋切片，HE
染色，光镜观察肺组织变化。
3 结果
3． 1 铜绿假单胞菌检测及体外生物膜测定 扫描电镜(SEM)观
察到 Pa标准株和 AH16 株培养 7d能形成的生物被膜(见图 1)。
A － Pa 生物被膜 (10000 ×) B － AH16 生物被膜 (10000 ×)
图 1 扫描电镜下 Pa和 AH16 的生物被膜的形态
3． 2 观察证候表现 正常对照组大鼠反应灵敏活泼、毛发光泽、
食欲旺盛、体重增加明显、呼吸平稳、口鼻清洁红润;模型组大鼠
出现咳嗽后逐渐气虚喘鸣、呼吸急促、精神萎靡、嗜睡、食欲不振、
体重增加缓慢、行动迟缓、蜷伏不动、口鼻潮湿发红且有分泌物流
出、消瘦便溏、毛发松散脱落发黄、早晨可闻及气道痰鸣音，参照
2002 年《中药临床研究指导原则》，符合肺气虚证候表现。各治
疗组大鼠及阳性对照组经治疗后咳嗽证状渐轻，一般体征缓慢恢
复，未见有肺气虚证候表现。
3． 3 血液二氧化碳和氧的分压 模型组与正常对照组大鼠比较
PCO2显著升高(P ＜ 0． 05) ，PO2 显著下降(P ＜ 0． 05) ;治疗组与模
型组比较，PO2 显著上升(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ;而正常对照组
与 SH 治疗组和 AZM 阳性对照组比较，PO2 和 PCO2 差别不明
显，且无统计学意义(见图 2)。
均与模型组对比，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01，＊＊＊P = 0． 000;n = 8;
SH:鱼腥草素钠 AZM:阿奇霉素
图 2 各组大鼠血气分析变化
3． 4 大鼠肺部灌洗液中 IL － 8 含量的变化 模型组与正常对照
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 11
组比较，肺部灌洗液中的 IL － 8 含量均有高于正常对照组
(P ＜ 0． 05或 P ＜ 0． 01) ;SH 治疗组和 AZM 阳性对照组与正常对
照组比较差异不明显，无统计学意义(见表 1)。
表 1 肺气虚证模型大鼠肺部灌洗液中 IL － 8 含量变化(珋x ± s)
ng·ml －1
组别 PaIL － 8 AH16 IL － 8
正常对照组 0． 276093 ± 0． 001164＊＊ 0． 276093 ± 0． 001164 *
模型组 0． 279996 ± 0． 001163ΔΔ 0． 278821 ± 0． 001854 Δ
SH治疗组 0． 276190 ± 0． 001952＊＊ 0． 276097 ± 0． 000358 ＊＊
AZM阳性对照组 0． 275112 ± 0． 003240* 0． 276247 ± 0． 001228 *
与模型组比较，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01;＊＊＊P = 0． 000;与正常对照
组比较，ΔP ＜ 0． 05;ΔΔP ＜ 0． 01;ΔΔΔP = 0． 000;n = 8
3． 5 病理学检查 正常对照组(A)肺组织结构正常，气管及各级
支气管上皮完整;模型组(B)支气管上皮细胞纤毛粘连脱落，支
气管上皮杯状细胞增多小动脉管壁轻度增厚，周围肺组织气肿;
SH治疗组(C)肺组织结构基本正常，有肺泡管及肺泡囊扩张;
AZM阳性对照组(D)肺组织结构基本正常。见图 3。
A －正常对照组(100 ×) B －模型组(100 ×)
C － SH治疗组(100 ×) D － AZM阳性对照组(100 ×)
图 3 Pa组病理学变化
4 讨论
本实验用生物被膜菌铜绿假单胞菌复制的大鼠肺气虚证模
型，证候表现符合肺气虚证断标准(诊断标准参照 2002 年《中药
临床研究指导原则》)，说明模型复制是成功的。
铜绿假单胞菌感染对人体危害极大，目前大多数菌株具多重
耐药性，形成生物被膜是铜绿假单胞菌具有高度的耐药性的重要
因素之一，也是细菌抵抗外部不利环境的重要机制之一。细菌生
物被膜(bacterial biofilm )是由细菌分泌的多糖基质、脂蛋白、纤
维蛋白等并将细菌自身包裹其中形成有结构的细胞群体膜样物，
是相对于单个独立分散的浮游状态的细菌生存形式而言的一种
独特的细菌生存形式。当细菌处于不利条件下，生物膜内的细菌
会转变处于休眠状态，从而增强了对外界的抵抗力，如抗菌药物
等。由于细菌处于暂时休眠状态，因此感染进入静止期。在一定
环境条件下生物膜能不断地释放浮游细菌并引起持续性感染，进
入发作期，发作期的铜绿假单胞菌又粘附在新的部位，从而形成
新的生物膜，感染再次进入静止期。这种周而复始，迁延不愈的
感染方式和肺气虚久病咳喘，或气的生化不足所致的病机是相符
的［10］。《诸病源候论》说:“肺主于气，邪乘于肺则肺胀，胀则肺
管不利，不利则气道涩，故气上喘逆，呜息不通”。
目前用于临床治疗铜绿假单胞菌感染的药物主要是大环内
酯类抗生素，其他西药治疗效果不佳。从中药中寻找有效的抗
生物被膜具有重要的理论及应用价值。鱼腥草素钠在国内鱼腥
草素钠作为抗菌药用于临床多年，据报道，临床用于呼吸道感染
的治疗取得了很好的疗效，我们在以往的研究中发现鱼腥草素钠
在体外有抗生物被膜的活性，且毒副作用小，较少出现耐药性。
据临床研究发现，肺气虚患者有肺功能和血液循环参数等
异常表现，本实验结果表明(图 1)，模型组大鼠比正常对照组指
标异常率明显，表明肺气虚证大鼠存在低氧血证和高碳酸血证。
SH治疗组与正常对照组比较 PO2 和 PCO2 差别不明显，且无统
计学意义。说明 SH 能够提高肺部的通气功能，将外界的 O2 吸
入体内供应给机体组织、器官，并把体内的 CO2 排出体外，从而
提高肺部中 O2 的含量，降低肺组织的损伤。
IL － 8 是至今所发现的最强的中性粒细胞趋化与活化因子
之一［11］。在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞、单核细胞、
肿瘤浸润细胞和嗜碱性粒细胞表面均有 IL － 8 受体的表达。本
实验中模型组肺部灌洗液中的 IL － 8 含量均有高于正常对照组
(表 1);SH治疗组与正常对照组有差异但不明显，且无统计学意
义。揭示 SH能够降低 IL － 8 含量，降低炎证反应，减轻气道慢性
炎性和持续损伤［12］。
综上所述，鱼腥草素钠在体内通过抑制 IL － 8 的产生减轻气
道慢性炎性和持续损伤，改善肺功能和血液循环，是预防肺气虚
证发生的重要因素。
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