全 文 ：［收稿日期］ 20140519(008)
［基金项目］ 贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字［2010］2213 号) ;贵州师范学院自然科学基金重点项目(201006) ;贵州省重点支持
建设学科项目(2011231)
［第一作者］ 甘秀海，硕士，副教授，从事中药化学成分及质量控制研究，E-mail:gxh200719@ 163． com
［通讯作者］ * 梁志远，教授，从事天然产物化学研究，E-mail:gzwh24000@ sina． com
冷水花抗菌活性部位薄层指纹图谱
甘秀海1，梁志远1* ，赵超2，姜金仲1
( 1. 贵州师范学院 药用植物研究所，贵阳 550018;
2. 贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001)
［摘要］ 目的:建立冷水花药材抗菌活性部位薄层色谱指纹图谱。方法:通过抗菌活性研究确定冷水花药材抗菌活性部
位，进而采用薄层色谱法对贵州产 10 批冷水花药材抗菌活性部位进行薄层色谱比较分析。结果:冷水花药材乙酸乙酯部位具
有抗菌活性。另外，贵州产 l0 批冷水花药材的乙酸乙酯部位薄层色谱图十分相似，均有 8 个斑点和对应的 8 个峰，但峰强度
上有差异。结论:该方法操作简单，稳定，可用于冷水花药材的鉴别及质量控制。
［关键词］ 冷水花;抗菌活性;薄层色谱;指纹图谱
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)23-0079-04
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014230079
TLC Fingerprint Analysis of Pilea aquarum
GAN Xiu-hai1，LIANG Zhi-yuan1* ，ZHAO Chao2，JIANG Jin-zhong1
(1. The Ｒesearch Institute of Medicinal Plant，Guizhou Normal College，Guiyang 550018，China;
2. The Ｒesearch Center for Quality Control of Natural Medicine，
Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China)
［Abstract］ Objective:To establish TLC fingerprint of active antibacterial fraction of Pilea aquarum．
Method:The activity fraction of P． aquarum was confirmed by antibacterial activity assay，and then the TLC
fingerprint of 10 batches of P． aquarum from Guizhou was analyzed comparatively． Ｒesult:The EtOAc extraction
of P． aquarum is antibacterial activity． The TLC chromatograms of 10 bat ches were very similar，which had 8
spots and 8 corresponding peaks，but the intensity of each peak was different． Conclusion:The method is simple
and stabilized，and can be used for the quality control of P． aquarum Dunn．
［Key words］ Pilea aquarum;antibacterial activity;TLC;fingerprint
冷水花为贵州苗族常用药材品种之一，全草入
药，具有利湿、清热、退黄等功效，用于治疗黄疸、肺
结核等疾病［1-2］。目前有关冷水花的研究较少［3-7］，
本课题组前期对冷水花药材的薄层指纹图谱进行了
初步探讨［8］。为了进一步完善并建立冷水花药材
薄层色谱质量标准，在前期研究的基础上，本文通过
抗菌活性研究确定冷水花药材乙酸乙酯部位具有抗
菌活性，进而采用薄层色谱法对贵州产冷水花 10 批
药材的乙酸乙酯部位进行薄层色谱比较分析，并建
立了该药材抗菌活性部位的薄层指纹图谱，为评价
冷水花药材的品质和 GAP 规范化种植提供了科学
依据。
1 材料
1. 1 仪器 CAMAG TLC scanner 3 型薄层色谱成
像系统(瑞士卡玛公司) ，双槽展开箱，硅胶 G 预制
板(青岛海洋化工厂) ，EOS6D型数码照相机(Canon
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公司) ，CHＲOMAP 1. 5 色谱指纹图谱系统解决方案
软件(珠海科曼中药研究有限公司) ，BS224 型精密
天平(Sartorius公司) ，ＲE-52AA 型旋转蒸发仪(上
海亚荣生化仪器厂) ，LB-50L型高压灭菌锅(江阴滨
江医疗设备厂) ，pHS-3C 型超菌工作台(天津医疗
净化设备厂) ，DH600 型电热恒温培养箱(北京科
伟仪器有限公司)。
1. 2 菌种 枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃
希菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌，以
上菌种均由贵州省中国科学院天然产物化学重点实
验室提供。
1. 3 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配制:称
取牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 5 g、琼脂 18 g，用
1 mol·L －1 NaOH 调节 pH 于 7. 0 ～ 7. 2，然后蒸馏水
定容至 1 000 mL，加热溶解后分装，121 ℃灭菌 20
min，倒入已灭菌的培养皿中，制成平板，待冷却凝
固后作无菌检查，备用。
1. 4 试剂 石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮等均
为国产分析纯;豆甾醇对照品(自制，纯度 ＞ 98%)。
1. 5 药材 不同产地冷水花全株见表 1，于 2011
年采自贵州省境内，经贵州师范学院朱富寿教授
鉴定为荨麻 科 湿 生 冷 水 花 Pilea aquarum 的
全草。
2 方法与结果
2. 1 抗菌活性测定
2. 1. 1 供试品的制备 取干燥冷水花药材全草，粉
碎后用 80%乙醇回流提取 3 次，2 h /次，合并提取
液，减压回收溶剂得棕褐色固体浸膏。浸膏用适量
水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取 3 次，浓缩得
到石油醚、乙酸乙酯和水部位，真空干燥至恒重，即
得供试品，置于 4 ℃冰箱中，备用。
表 1 冷水花样品采收地点、时间
No． 采集地 采集时间
1 贵州纳雍 2011-10
2 贵州盘县 2011-08
3 贵州玉屏 2011-09
4 贵州天柱 2011-09
5 贵州凯里 2011-08
6 贵州息烽 2011-10
7 贵州正安 2011-10
8 贵州遵义 2011-08
9 贵州威宁 2011-09
10 贵州贵阳 2011-10
2. 1. 2 菌悬液的制备 将供试菌种分别接种在 LB
培养基上，37 ℃活化培养 24 h，挑取活化后的菌落
与无菌生理盐水混合，所得菌悬液中细菌数目为
106 ～ 108CFU·L －1。
2. 1. 3 活性的测定 采用平板打孔法:将 102 型新
华滤纸打成直径为 6 mm 的圆形滤纸片，灭菌、烘干
后放入冷水花提取物中充分浸泡，取出后低温干
燥，制成药敏纸片备用。
准确称取冷水花供试品，用 DMSO 配成质量浓
度为 10 g·L －1的溶液，用微型移液器吸取 40 μL 的
菌悬液加入到凝固的培养基上，涂布均匀，然后用镊
子取药敏纸片均匀贴在平板上。挥干溶剂后，放入
37 ℃恒温培养箱中倒置培养 24 h。观察有无抑菌
圈的产生，并用直尺测量抑菌圈大小，记录结果，求
其平均值。实验共设 3 个实验组，每 3 个平板为 1
组，每组重复 3 次。用庆大霉素(8 万单位)作为阳
性对照。
冷水花的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水
萃取物对 6 种供试菌的抑菌试验结果见表 2。
表 2 冷水花不同萃取部位的抑菌效果(珋x ± s，n = 3)
样品
抑菌圈直径 /mm
枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 藤黄微球菌 金黄色葡萄球菌 伤寒沙门菌
冷水花石油醚部位 － － － － － －
冷水花乙酸乙酯部位 10. 24 ± 1. 32 － － － － －
冷水花水部位 － － － － － －
空白 － － － － － －
庆大霉素 31. 38 ± 0. 71 29. 97 ± 0. 76 27. 04 ± 1. 1 8 26. 85 ± 1. 40 26. 45 ± 1. 26 26. 59 ± 1. 48
注:“ －”无抑菌圈。
表 2 显示，冷水花只有乙酸乙酯部位对枯草芽
孢杆菌有抑菌作用，对其他菌株无抑制活性，其余部
位对所试菌株均没有抑菌活性，冷水花的抑菌活性
部位为乙酸乙酯部位。
2. 2 薄层指纹图谱研究
2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重
的豆甾醇对照品适量，用乙酸乙酯制成 1 g·L －1的对
照品储备液。精密吸取以上对照品储备液 1 mL，至
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10 mL量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度制成为 0. 1 g
·L －1的对照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 分别精密称取干燥至恒
重的不同批次冷水花药材粉末(过 40 目筛)约 1. 0
g，按 2. 1. 1 项下的方法制成乙酸乙酯萃取物，挥干
溶剂，用乙酸乙酯定容至 10 mL，作为供试品溶液。
2. 2. 3 薄层色谱条件 照薄层色谱法(《中国药典》
2010 年版一部附录ⅥB)试验，吸取以上供试品溶
液、对照品溶液各 3 μL，分别点于同一硅胶薄层板
上，以石油醚-三氯甲烷-乙酸乙酯 (2 ∶ 1 ∶ 1)为展开
系统上行展开，展距 8 cm，取出，晾干，喷以 10%硫
酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，分别于可
见光及 366 nm荧光下检视，
2. 2. 4 薄层色谱指纹图谱的测定 将 10 批次冷水
花供试品溶液按 2. 2. 3 项下薄层色谱条件进行展
开，得到冷水花的薄层色谱指纹图谱(图 1)。图 1
为 366 nm荧光下的薄层色谱指纹图谱，1 ～ 10 为不
同产地冷水花的薄层色谱指纹图谱，s 为对照品豆
甾醇的薄层色谱图，其 Ｒf值为 0. 54。
图 1 冷水花薄层色谱指纹谱
2. 2. 5 指纹图谱的建立 将 2. 2. 3 项下 366 nm荧
光检视所得的薄层色谱图谱导入 CHＲOMAP 1. 5 色
谱指纹图谱系统解决方案软件，生成灰度扫描图并
积分。通过软件对不同产地冷水花样品的指纹图谱
进行叠加得到相应的轮廓图(图 2) ;以采自贵州纳
雍的冷水花作为参考药材，采用中位数法确定特征
峰，均数法计算特征值，共指认了 8 个特征色谱峰，
相对位移分别为 0. 08，0. 24，0. 33，0. 42，0. 54，0. 62，
0. 69，0. 87，构成了冷水花薄层色谱指纹图谱共有模
式(图 3) ，其中 5 号峰为豆甾醇。
2. 2. 6 聚类分析 对 10 批样本经标准化后的数据
进行聚类分析，其结果见图 4。由图可知，样品聚为
3 类，不同样品间化学成分存在一定差异。第Ⅰ类
包括序号 1，2，6，10 的 4 个样品，其中 1 号与 2 号样
品成分相似，6 号与 10 号样品成分相似;第Ⅱ类包
图 2 10 批冷水花药材薄层色谱谱叠加
图 3 冷水花薄层色谱指纹谱共有模式
图 4 冷水花样品聚类分析树状
括序号 3，4，5，7，8 的 5 个样品，其中 3 号与 4 号相
似，7 号与 8 号相似;第Ⅲ类仅包括序号 9 的 1 个样
品。由聚类分析可直观地区分出冷水花样品中的化
学成分差异与不同地理环境存在较大的相关性。
2. 2. 7 主成分分析 对 10 批样本经标准化后的数
据进行主成分分析，由 PC1-PC2 构成的投影图见图
5。由图可知，10 批样本聚为 3 类，各类分布效果明
显，与聚类分析结果一致，其 PC1 的贡献率为
68. 9%，图中 9 号样本与其他样本保存较远距离，与
其他样本之间具有明显的差异。
3 讨论
3. 1 抗菌活性研究 在抗菌活性研究中发现，湿生
冷水花乙酸乙酯部位对枯草芽孢杆菌具有抑菌活
性，其抑菌圈为(10. 24 ± 1. 32)mm，其抑菌效果强
于同属植物纤细冷水花［3］(Pilea notate)对枯草芽
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甘秀海，等:冷水花抗菌活性部位薄层指纹图谱
图 5 冷水花样品成分分析投影
孢杆菌的抑菌活性，其抑菌圈为 5. 86 mm。但试验
结果表明湿生冷水花的乙酸乙酯部位对其他菌株均
没有明显的抑菌活性，而后者对所试菌株均有一定
的抑菌活性，这说明冷水花属中不同冷水花品种之
间的抗菌活性具有差异性。
3. 2 影响因素的考察与优化
3. 2. 1 供试品制备方法的确定 为了真实反映冷
水花抗菌活性部位指纹图谱，指纹图谱研究与抗菌
活性研究为同一供试品的制备方法。
3. 2. 2 薄层色谱条件的优化及稳定性考察［9］考察了
供试品溶液点样量为 1，3，5 μL时，薄层色谱图的呈点
性及成像的清晰度，结果点样量为 3 μL时的成像清晰
且薄层色谱图未见明显的拖尾显现，呈点性好;点样量
为 1 μL时，斑点不清晰，成像过程中未能达到与基线
分离;而 5 μL时具有明显的拖尾，成像不清晰。
考察了石油醚(60 ～ 90 ℃)-乙酸乙酯、石油醚
(60 ～ 90 ℃)-丙酮、石油醚(60 ～ 90 ℃)-三氯甲烷
及石油醚(60 ～ 90 ℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯等展开
剂系统，结果显示石油醚(60 ～ 90 ℃)-三氯甲烷-乙
酸乙酯(2∶ 1∶ 1)时斑点分离度及清晰度上均比其他
展开系统好。另外，以调节展开剂比例考察了展开
系统的稳定性，分别考察了石油醚(60 ～ 90 ℃)-三
氯甲烷-乙酸乙酯(1. 5∶ 1 ∶ 1) ，(2. 5 ∶ 1 ∶ 1) ，(2 ∶ 0. 5 ∶
1) ，(2∶ 1∶ 0. 5)时样品的薄层展开效果，以上系统均
能有效的分离各点，且均较清晰，因此石油醚(60 ～
90 ℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯的上述系统均能用于冷
水花药材的薄层鉴别。
3. 2. 3 显色方法的考察 分别用 5%硫酸乙醇溶
液、10% 硫酸乙醇溶液、1%香草醛硫酸溶液及碘熏
4 种显色剂进行显色。结果显示，采用 10% 硫酸乙
醇溶液为显色剂时，置日光下检视，豆甾醇有清晰的
斑点，但斑点数目较少，而置于 366 nm 下检视，薄层
色谱图中出现 8 个清晰的荧光斑点，因此确定其显
色方法为展开后在薄层板上喷以 10% 硫酸乙醇溶
液，105 ℃ 加热 3 min后，于 366 nm 下检视。
3. 2. 4 温度湿度的考察 为了考察温度湿度对所建立
的薄层指纹图谱研究方法的影响，试验中分别在 10，
20，30，40 ℃ 4 种温度及 30%，40%，50%，60%，70% 5
种湿度的情况下进行薄层展开，发现10 ～30 ℃的温度，
湿度在 30% ～ 60% 时，均可以得到分离度较好、呈点
清晰的薄层色谱图;但温度大于 40 ℃，湿度超过 60%
后，环境条件会明显影响到薄层展开效果。
4 结论
通过冷水花不同提取物对所试枯草芽孢杆菌、
铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、藤黄微球菌、金黄色葡
萄球菌、伤寒沙门菌 5 种菌株的抗菌活性实验可知
冷水花的抗菌活性部位是乙酸乙酯部位;10 个不同
来源的冷水花样本中均含有豆甾醇，但含量有一定
的差异，主要化学成分的含量与地域存在较大的相
关性。
建立的薄层指纹图谱鉴别方法操作简单、稳定
性好、适应性强，可用于冷水花药材品种的鉴别，为
冷水花药材的质量控制提供了科学依据。
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［责任编辑 顾雪竹］
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