全 文 ：第2卷 第11期
2007 年 11 月

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华细辛遗传多样性的初步分析

刘 忠
1,2
，近藤直子
1
，徐暾海
3
，蔡少青
1

（1. 北京大学药学院, 北京 100038；2. 上海交通大学药学院, 上海 200030;
3. 北京中医药大学中药学院, 北京 100102）

摘 要：本文利用 AFLP 分子标记方法对华细辛的遗传多样性进行了初步分析。25 对引物在华细辛 9 个种群
中共扩增出 1 334 个条带，其中多态条带 318 条，多态位点百分率(PPB)为 23.84%。各种群之间平均 Jaccard
相似性系数为 0.943，平均 Nei遗传距离为 0.030。UPGMA聚类分析显示，华细辛 9个种群在 Jaccard相似性
系数约为 0.93和 Nei遗传距离约为 0.04处被分为 2个分枝，其中，来自华东的 6个样本聚为一群，来自秦巴
山区的 3个样本聚为另一群。对 Jaccard相似性与 Nei遗传距离矩阵的 Z-test分析表明，基于 Jaccard相似性系
数得到的表型相似关系和基于 Nei遗传距离得到的遗传关系具有极强的一致性。结果显示，华细辛遗传多样性
水平非常低，种群之间具有一定的遗传分化且与地理距离呈正相关。人为活动导致华细辛种群规模变小，由此
带来的瓶颈效应、近交衰退和遗传漂变可能是华细辛遗传多样性贫乏的主要原因。
关键词：中药资源学；遗传多样性；AFLP；华细辛
中图分类号：R931.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7180(2007)11－0808－6

0 引言
细辛是常用中药，关于细辛的研究并不少，包括
本草学、资源学、栽培学、植物化学、药效学、药理
学、毒理学等诸多方面[1~14]。细辛为多来源中药，其基
源植物有三个品种，即马兜铃科 Aristolochiaceae 细辛
属 Asarum 植物华细辛 A. sieboldii Miq.、汉城细辛 A.
sieboldii Miq. f. seoulense (Nakai) C.Y. Cheng et C.S.
Yang 和北细辛 A. heterotropoides Fr. Schmidt var.
mandshuricum 的干燥全草（后二种习称“辽细辛”）
[15,16]。其中，华细辛是用药历史最早也是记载最多的
正品细辛。华细辛以秦岭–大巴山地为分布中心，向
南辐射到长江中下游流域的广大地区，包括河南、湖
北、湖南、安徽、江西、浙江等省，往西达甘肃南部，
往东至山东崂山。历来认为陕西华山周围出产的华细
辛质量上乘，是细辛传统道地药材[17~20]。然而，对华
细辛的系统性研究却很缺乏，尤其是从遗传学角度对
不同产地来源的华细辛进行的比较研究还未见有报
道。此外，由于人工滥采和生境破坏等原因，野外华
细辛种群呈日渐缩减的趋势。因此，本研究以华细辛
为对象，从遗传多样性角度分析该品种不同产地来源
的种群在遗传背景方面的差异，为华细辛药材道地性
形成规律的阐明提供生物学依据，同时亦为华细辛野
生资源的保护提供遗传分析资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
依照种群概念，以至少相距 5 km 的距离确定样本
采样点，每种群采集 15～20 个个体（表 1）。选取幼嫩
健康的叶片置于装有变色硅胶的封口袋内，将其迅速
干燥保存。
表 1 实验材料
Table 1 Materials used in the research
采集类群 采集地点 采集号
江西：庐山 2001－021 华细辛
Asarum sieboldii 浙江：西天目山 2001－028
作者简介：刘忠（1967－），男，副教授。
通讯联系人：蔡少青，教授，E-mail: sqcai@bjmu.edu.cn
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2001－029
2001－037
2001－038
安徽：黄山
2001－039
2001－049 重庆：城口县
2001－053
陕西：华阴县 2001－056

1.2 实验方法
1.2.1 DNA 的提取
提取缓冲液 A：0.35mol/L Sorbitol, 100mmol/L
Tris-HCl (pH 7.5), 5mmol/L EDTA (pH 7.5), 1mol/L
亚硫酸氢钠。
提取缓冲液 B：0.2mol/L Tris-HCl (pH 8.0),
50mmol/L EDTA (pH 8.0), 2% CTAB, 2mol/L NaCl。
提取步骤：取适量干燥叶片，充分研磨后加入
提取缓冲液 A 和 B各 300μL，室温下用力振荡数下；
加入 120μL 5％的 Sarkosyl 后于 65℃水浴 0.5 h；冷
却至室温后，加等体积氯仿 /异戊醇 (24:1)，以
12000r/min转速离心 10min；取上清，加 800μL 95%
乙醇/1 M乙酸钠(pH 5.2)沉淀液，以 12000r/min转速
离心 10min；弃上清夜，获沉淀物 DNA；用 70%乙
醇洗 DNA沉淀 2次，干燥后溶于灭菌超纯水中；将
提取得到的 DNA 分装，置于 4℃冷藏保存或于-20
℃下长期冻存。
1.2.2 AFLP反应
1) 酶切反应: 本研究采用 Tru1Ⅰ和 PstⅠ双酶
切。Tru1Ⅰ是 MseⅠ的同裂酶，识别位点为 T▼TAA，
酶切反应条件：10 μL / 每反应，其中 10×R+ buffer
1.0 μL，Tru1Ⅰ0.5 μL，H2O (8.5－X) μL，模板 X μL，
反应在 65℃恒温水浴中进行 1.5~2 h。PstⅠ的识别位
点为 CTGCA▼G，酶切反应条件：20 μL / 每反应，
其中 10×H buffer 2.0 μL，PstⅠ0.5 μL，H2O 12.5 μL,
模板 5.0 μL，反应在 37℃恒温中进行 2 h。两次酶切
反应完成后，于 70℃水浴灭活酶活力 15 min，酶切
产物作为连接反应的模板。
2) 接头连接：
Tru1Ⅰ的接头为：
5’ –GACGATGAGTCCTGAG- 3’
3’-CTACTCAGGACTCAT- 5’
PstⅠ的接头为：
5’ -CTCGTAGACTGCGTACCTGCA-3’
3’-CATCTGACGCATGG- 5’
连接反应条件：25 μL / 每反应，其中 10×B
buffer 2.5 μL，Mse I接头 0.5 μL，Pst I接头 0.5 μL,
H2O 8.5 μL，T4连接酶 0.5 μL，模板（酶切产物）
12.5 μL，4℃下过夜。
3) 预扩增反应：预扩增引物中 Tru1Ⅰ引物为
5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’（即 M+C），PstⅠ
引 物 为 5’-GTAGACTGCGTACCTGCAGA-3’( 即
P+A)。预扩增反应在以下条件下完成：25 μL / 每反
应，其中 10×B buffer 2.5 μL，M + C 1.0 μL，P + A 1.0
μL, Mg2+ 1.5 μL，dNTPS 2.0 μL，Taq polymerase 0.2
μL，H2O 15.8 μL，模板（连接产物）1.0 μL。 预
扩增反应程序为：94℃ 1min；94℃ 30s, 56℃ 30s,
72℃ 1min, 26 Cycles；72℃ 5min。预扩增产物稀释
20 倍后，用作选择性扩增的模板，未稀释的则储存
于-20℃待用。
4) 选择性扩增反应：反应条件为：12.5 μL / 每
反应。其中 10×B buffer 1.25 μL，Mg2+ 0.75 μL，
dNTPS 0.5 μL，Taq polymerase 0.1 μL，H2O 7.4 μL，
引物 0.5 μL，模板（预扩增产物）2.0 μL。扩增程序
为：94℃ 4min； 94℃ 45s, 65℃ 45s, -1℃ per cycle,
72℃ 1min, 10 times；94℃ 45s, 56℃ 45s, 72℃ 1min,
30 times。扩增产物的分离和检测：PCR反应结束后，
在样品中加入适量的甲酰胺染料（98%甲酰胺
19.6mL, 10mmol/L EDTA 0.4mL, 溴酚兰 0.125g, 二
甲苯氰 0.125g），90℃中变性 3~5min 后立即置于冰
浴中冷却。电极缓冲液为 1×TBE。凝胶板在 40W
恒功率下预电泳 20min，样品以 4~5μL 的量加入鲨
鱼齿梳子形成的加样孔，在 40W恒功率下泳动约 2.5
h，至二甲苯氰到达胶长的 2/3处时结束电泳。小心
分开两块玻璃板，将带胶的凹槽玻璃板置入银染反
应盘中，经脱色、染色、显影、定影等一系列反应，
检测扩增产物。胶板在室温下自然干燥后，拍照或
永久保存。
1.2.3 数据分析
在各种群样本内，同一迁移率的 AFLP 扩增条
带按其有、无分别计为“1”和“0”，建立原始二元
数据矩阵。首先，利用 Jaccard 相似性系数计算样品
之间的表型相似性，并利用类平均聚类法(UPGMA,
unweighted pair group method using arithmetic
average)对样品进行聚类分析。其次，在假设每一个
AFLP标记均为具有双等位基因分子标记的前提下，
利用 Nei(1972)遗传距离估计各样品之间的遗传相似
性，并用 UPGMA 法进行聚类分析。表型多样性和
遗传多样性分析的一致性和显著性程度利用 Z 检测
(Z-test)进行分析。以上分析均在 NTSYS 软件中进
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行。
2 结果
2.1 遗传多态性
本研究利用 25 对引物对来自江西、浙江、安徽、
重庆、陕西的华细辛 9 个种群进行了遗传多样性分
析。这些引物组合共扩增出 1 334 个可重复、条带清
晰的条带，分子量大小为 120～1 000bp，平均每个
引物组合能够扩增出 53.36 个条带（图 1）。其中，
多态条带的数量为 318，多态位点百分率(percentage
of polymorphic bands, PPB)为 23.84％，平均一对引
物能够扩增得到 12.72 个多态条带。


图 1 PM59（左）和 PM62（右）两个引物组合扩增后的 Acr-Bis 凝胶电泳图
Fig.1 Banding patterns of amplified products in Acr-Bis PAGE, using the primer combinations
PM59 (left half) and PM62 (right half) respectively

根据 Hamrick 对 165 属 449 种植物遗传变异研究
结果进行的总结[21]，华细辛的多态位点百分率低于双
子叶植物(44.8%)、长寿多年生草本(39%)，甚至特有种
(40％)的平均多态位点百分率，而与自交类型(20％)相
近，显示出非常低水平的遗传多样性。
2.2 遗传关系
利用表型相似性系数（Jaccard 系数）和遗传距离
（Nei 遗传距离）对各华细辛样品之间的遗传关系进行
了统计和分析（表 2）。

表 2 Jaccaed 相似性系数（左下角）和 Nei(1972)遗传距离（右上角）
Table2 Jaccard similarity coefficients (below diagonal) and Nei (1972) genetic distances (above diagonal)
021 028 029 037 038 039 049 053 056
021 － 0.020 0.020 0.021 0.024 0.024 0.036 0.036 0.033
028 0.963 － 0.016 0.022 0.024 0.024 0.038 0.040 0.036
029 0.961 0.969 － 0.023 0.026 0.025 0.041 0.042 0.040
037 0.959 0.958 0.956 － 0.018 0.020 0.035 0.035 0.033
038 0.955 0.952 0.950 0.963 － 0.016 0.037 0.036 0.034
039 0.955 0.953 0.951 0.962 0.969 － 0.036 0.036 0.034
049 0.932 0.923 0.921 0.929 0.925 0.925 － 0.029 0.031
053 0.934 0.921 0.920 0.929 0.925 0.925 0.966 － 0.030
056 0.936 0.928 0.927 0.929 0.927 0.926 0.962 0.961 －
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结果表明，各样品之间的平均 Jaccard 相似性指
数为 0.943，平均 Nei 遗传距离为 0.030。其中，种
群 029 和 053 之间的相似度最低(0.920)，遗传距离
最大(0.042)；种群 028 和 029、038 和 039各自相互
之间表现出最高的相似度(0.969)和最小遗传距离
(0.016)。利用 Z-test 对 Jaccard 相似性与 Nei 遗传距
离矩阵的分析表明，它们的差异不显著，基于 Jaccard
相似性系数得到的表型相似关系和基于 Nei 遗传距
离得到的遗传关系具有极强的一致性（图 2）。

图 2 基于 Jaccard 相似性系数的表型相似关系和基于 Nei(1972)遗传距离的遗传关系的比较
Fig.2 Comparison of phenetic and genetic relationships,resulting from Jaccard similarity coefficients
and Nei (1972) genetic distances respectively

图 3 Jaccad 相似性系数聚类图
Fig.3 UPGMA dendrogram based on Jaccard similarity coefficients

图 4 Nei（1972）遗传距离聚类图
Fig.4 UPGMA dendrogram based on Nei (1972) genetic distances

图 3和图 4分别表示利用 Jaccard 相似性系数和利 用 Nei 遗传距离进行的 UPGMA聚类结果。对 Jaccard
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相似性系数进行的聚类分析表明：华细辛 9 个种群被
分为 2 个分枝，其中，来自华东的 6 个样本聚为一群，
而来自秦巴山区的 3 个样本聚为另一群。这两个聚类
群在相似性系数约为 0.93处被分开，表明它们之间产
生了一定的分化。对 Nei 遗传距离进行的聚类分析结
果与之类似，来自华东的 6 个样本和来自秦巴山区的 3
个样本在遗传距离约为 0.04处被分开。
3 讨论
多态位点百分率(PPB)是量度物种遗传多样性的
主要指标之一[22]。不同的标记方法因检测灵敏度有异，
对同一物种获得的多态位点百分率可能存在差别。但
是，它们对该物种遗传多样性格局的揭示是一致的，
Wang 等[23]在台湾穗花杉、Owuor 等[24]在 Hordeum
spontaneum、Aagaard 等[25]在 Douglas-fir、崔继哲等[26]
在羊草中的研究结果都佐证了这一点。Nybom[27]的研
究进一步表明，来自显性遗传标记(RAPD、ISSR、AFLP)
的检测具有直接的可比性。因此，尽管目前缺乏有关
华细辛近缘类群在 AFLP 分析方面的研究数据，其它
植物类群的研究结果仍然可以为分析华细辛的遗传多
样性提供有效的参考。
华细辛在中国的分布较为广泛，秦岭淮河以南的
华东、华中的长江流域是其分布的主要区域。对来自
分布中心和东南边缘的9个种群进行的初步分析显示，
华细辛遗传多样性非常低(PPB=23.84％)，种群间存在
一定程度的遗传分化，并且这种分化模式与地理分布
呈正相关。延龄草[28]也是遗传多样性处于非常低水平
的物种(PPB=34.07%)，遗传分化主要存在于种群间。
根据研究结果，自交、地理隔离和遗传漂变是延龄草
种群分化的主要原因。裸芸香[29]物种遗传多样性低
(PPB=42.2%, Ht=0.0971) ， 种 群 分 化 系 数 大
(Gst=0.5096)，遗传多样性主要分布于种群间。造成裸
芸香低水平遗传多样性的因素主要有生境单一、瓶颈
效应和自交或近交衰退。永瓣藤(PPB=39.2%)[30]和明党
参(PPB=33.35%)[31]遗传多样性的贫乏也都是由于种群
分布片断化后，遗传漂变和近交衰退造成的。细辛作
为大宗中药材，市场需求量和消耗量一直很大，随着
华细辛野生药材收购价格的不断上扬，华细辛资源遭
到了极大破坏。野外调查发现，除自然保护区外，华
细辛种群数量严重不足，种群内个体数量十分有限，
不少种群甚至仅见寥寥几株幼苗。显然，华细辛正经
历着人为活动造成的种群和数量规模萎缩的严峻局
面。种群规模的急剧减小，不但使种群内杂合子遭到
瞬间丢失，而且将造成自交或近交率的显著提高[32]。
因此，与上述几个物种相类似，瓶颈效应、近交衰退
和遗传漂变可能是华细辛物种遗传多样性贫乏的主要
原因。

致谢 衷心感谢西天目山国家自然保护区管理局和
重庆市城口县林业局在研究材料收集上提供的大力支持！

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A preliminary study on genetic diversity of Asarum siebldii Miq.

LIU Zhong1,2，KONDO Nako1，XU Tunhai3，CAI Shaoqing1
(1. School of Pharmaceutical Sciences, Beijing University, Beijing 100038；
2. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030；
3. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102)

Abstract: The genetic diversity of Asarum sieboldii Miq. is preliminarily analyzed with the approach of AFLP molecular
marker. 1334 bands are accounted in nine populations by using 25 pairs of primer, 318 bands out of which are
polymorphic. The percentage of polymorphic bands (PPB) is 23.84%. The mean Jaccard similarity coefficients and Nei
genetic distances are 0.943 and 0.30 respectively. UPGMA analysis shows that the nine populations are gathered in two
clades at 0.93 level of Jaccard similarity coefficient and 0.04 level of Nei genetic distance respectively, with six of them
from eastern China in one clade and the rest from Qinling-Dabashan district in the other one. Z-test analysis based on the
matrices of Jaccard similarity coefficients and Nei genetic distances show that the phenetic similarity relationships and the
genetic relationships are of strongly coherent. The results indicate that the genetic diversity of A. sieboldii is very low and
the populations have been differentiated to some extend. Moreover, the differentiation pattern of the populations is
positively correlated with geographical distances. It is discussed that the population size of the species has sharply
decreased because of human beings activity. The bottleneck effect, inbreeding depression and genetic drift resulting from
population size decrease maybe the main reason for low genetic diversity of A. sieboldii.
Key words: science of chinese medicinal resources；genetic diversity；AFLP；Asarum seiboldii