全 文 :基金项目:贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字[2010]2213 号) ;贵州省重点支持建设学科项目(2011231)
作者简介:甘秀海,男,博士研究生,副教授 研究方向:中药有效成分及生物活性 * 通讯作者:梁志远,女,教授 研究方向:天然产物
化学 Tel /Fax:(0851)5816647 E-mail:gzwh24000@ sina. com
冷水花抗菌活性成分研究
甘秀海1,梁志远2* ,姜金仲1(1. 贵州师范学院化学与生命科学学院,贵阳 550018;2. 贵州师范学院药用植物研究所,贵阳 550018)
摘要:目的 研究冷水花的抗菌活性成分。方法 基于抗菌活性测试,利用硅胶、葡聚糖凝胶 LH - 20 及重结晶等方法分离冷
水花提取物的化学成分,并根据理化性质和光谱数据鉴定化合物的结构。结果 从冷水花乙醇提取物的乙酸乙酯抗菌活性
部位中分离鉴定了 9 个化合物,分别为豆甾-4-烯-3-酮(1) ,胆甾醇(2) ,豆甾醇(3) ,豆甾-7-烯-3β-醇(4) ,大黄素(5) ,芹菜素
(6) ,木犀草素(7) ,木犀草苷(8)和大波斯菊苷(9)。抗菌活性跟踪测试显示化合物 8、9 对所试菌株的抑制活性均高于阳性
对照药剂庆大霉素。结论 以上化合物均为首次从该植物中分离得到,其中化合物 8、9 具有明显的抗菌活性。
关键词:冷水花;抗菌活性;大波斯菊苷;豆甾-4-烯-3-酮;豆甾-7-烯-3β-醇
doi:10. 11669 /cpj. 2014. 23. 004 中图分类号:R284 文献标志码:A 文章编号:1001 - 2494(2014)23 - 2069 - 04
Antibacterial Constituents of Pilea notata C. H. Wright
GAN Xiu-hai1,LIANG Zhi-yuan2* ,JIANG Jin-zhong1(1. The School of Chemistry and Life Science,Guizhou Normal Col-
lege,Guiyang 550018,China;2. The Research Institute of Medicinal Plant,Guizhou Normal College,Guiyang 550018,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To study the antibacterial constituents of Pilea notata C. H. Wright. METHODS Compounds were i-
solated by silica gel,Sephadex LH - 20 and recrystallisation based on antibacterial activity test,and the structures were identified by
their physico-chemical properties and spectroscopic data. RESULTS Nine compounds were isolated and identified as sitosterone(1) ,
cholesterol(2) ,stigmasterol(3) ,stigmast-7-en-3β-ol(4) ,emodin(5) ,apigenin(6) ,luteolin(7) ,luteoloside(8)and cosmosiin
(9). Compounds 8 and 9 showed better potential inhibitory activity than the positive control gentamicin. CONCLUSION All of the
compounds are isolated from this plant for the first time,among which compounds 8 and 9 have potential antibacterial activity.
KEY WORDS:Pilea notata C. H. Wright;antibacterial activity;cosmosiin;sitosterone;stigmast-7-en-3β-ol
冷水花为荨麻科(Urticaceae)植物纤细冷水花
(Pilea notata C. H. Wright)全草,具有利湿,清热,退
黄等功效,是贵州常见苗族品种,可用于治疗黄疸,
肺结核等疾病[1]。药理活性研究表明,冷水花具有
抗菌作用[2],其抗菌活性部位为乙酸乙酯部位,但
关于其抗菌活性成分的研究未见报道。为探明冷水
花的抗菌活性成分,在前期冷水花化学成分研究的
基础上[3],本实验报道从中分离得到的其余 9 个化
合物,它们分别是:豆甾-4-烯-3-酮(1) ,胆甾醇(2) ,
豆甾醇(3) ,豆甾-7-烯-3β-醇(4) ,大黄素(5) ,芹菜
素(6) ,木犀草素(7) ,木犀草苷(8)和大波斯菊苷
(9) ,以上化合物均为首次从该植物中分离得到,抗
菌活性测试表明化合物 8、9 具有明显的抗菌活性,
这为冷水花的开发与利用奠定了基础。
1 仪器和材料
X -4 型双目镜显微熔点测定仪(未校正,北京
泰克仪器有限公司) ;ZF7三用紫外分析仪(巩义市
予华仪器有限责任公司) ;INOVO 400 MHz 型核磁
共振波谱仪(美国 Varian公司) ,以 TMS 为内标;HP
5973 质谱仪(美国安捷伦公司) ;柱色谱硅胶(200 ~
300 目)和薄层用硅胶 GF254(青岛海洋化工厂) ;
Sephadex LH - 20(Pharmacia Biotech 公司) ;溶剂均
为工业纯。
实验材料冷水花药材采自贵州省安顺市,经贵
州师范学院朱福寿教授鉴定为荨麻科冷水花属植物
纤细冷水花全草(Pilea notata C. H. Wright)。标本
保存于贵州师范学院药用植物研究所。
2 提取和分离
冷水花干燥药材 15 kg 粉碎后,用体积分数
80%工业乙醇冷浸提取 3 次,减压回收乙醇,加入适
量水分配,依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶剂,
干燥,分别得到乙酸乙酯、正丁醇及水萃取部位,经
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抗菌活性测试乙酸乙酯部位具有较好的抗菌活性
(表 1)。乙酸乙酯部分(142 g)经硅胶柱色谱分离,
以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,合并相同馏分得到 5
个部分。第 2 部分(20 g)经反复柱色谱(用石油醚-
乙酸乙酯洗脱) ,再经石油醚-乙酸乙酯重结晶得到
化合物 1(21 mg)和 2(16 mg)。第 3 部分(46 g)经
反复柱色谱(用石油醚-丙酮洗脱) ,再经石油醚-丙
酮得到化合物 3(22 mg) ,4(19 mg)。第 4 部分(28
g)经反复柱色谱(用石油醚-丙酮洗脱) ,再经丙酮
重结晶得到化合物 5(21 mg) ,6(15 mg) ,7(31 mg)。
第 5 部分(38 g)经反复柱色谱,用三氯甲烷-甲醇反
复洗脱并经 Sephadex LH - 20 纯化,再经甲醇重结
晶得到化合物 8(102 mg) ,9(1. 2 g)。
3 结构鉴定
化合物 1:无色针状晶体(石油醚-乙酸乙酯) ,
Libermann-Burchard 反应呈阳性,mp 84 ~ 85 ℃。相
对分子质量:412;EI-MS m/z:412[M]+。1 H-NMR
(CDCl3,400 MHz)δ:5. 71(1H,s,H-4) ,1. 18(3H,
s,H-19) ,0. 91(3H,d,J = 6. 2 Hz,H-21) ,0. 85(3H,
d,J = 6. 4 Hz,H-29) ,0. 82(3H,d,J = 6. 4 Hz,H-26
或 27) ,0. 81(3H,d,J = 6. 6 Hz,H-27 或 26) ,0. 70
(3H,s,H-18)。13 C-NMR(CDCl3,100 MHz)δ:35. 8
(C-1) ,34. 0(C-2) ,200. 0(C-3) ,123. 9(C-4) ,172. 0
(C-5) ,33. 1(C-6) ,32. 2(C-7) ,35. 8(C-8) ,53. 9(C-
9) ,38. 7(C-10) ,21. 2(C-11) ,39. 7(C-12) ,42. 5(C-
13) ,56. 0(C-14) ,24. 3(C-15) ,28. 3(C-16) ,56. 1
(C-17) ,12. 2(C-18) ,17. 5(C-19) ,36. 3(C-20) ,
18. 8(C-21) ,34. 1(C-22) ,26. 2(C-23) ,45. 9(C-
24) ,29. 2(C-25) ,20. 0(C-26) ,19. 2(C-27) ,23. 2
(C-28) ,12. 1(C-29)。以上数据与文献[4]报道的
豆甾-4-烯-3-酮(sitosterone)基本一致。
化合物 2:无色片状晶体(石油醚-乙酸乙酯) ,
Libermann-Burchard 反应呈阳性,mp 145 ~ 146 ℃。
相对分子质量:386;EI-MS m/z:386[M]+。1 H-
NMR(CDCl3,400 MHz )δ:5. 35(1H,t,J = 2. 5 Hz,
H-6) ,3. 51(1H,m,H-3) ,1. 02(3H,s,H-19) ,0. 91
(3H,d,J = 6. 4 Hz,H-21) ,0. 87(6H,d,J = 6. 2 Hz,
H-26,27) ,0. 69(3H,s,H-18)。以上波谱数据与文
献[5]报道的胆甾醇(cholesterol)数据基本一致。
化合物 3:无色针状晶体(石油醚-乙酸乙酯) ,
mp 166 ~ 167 ℃。相对分子质量:412;EI-MS m/z:
412[M]+。1H-NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5. 35(1H,
brs,H-6) ,5. 16(1H,dd,J = 15. 6,8. 2 Hz,H-22) ,
5. 04(1H,dd,J = 15. 6,8. 2 Hz,H-23) ,3. 54(1H,m,
H-3) ,1. 03(3H,s,H-19) ,0. 93(3H,d,J = 6. 8 H z,
H-21) ,0. 88,0. 83,0. 72(3H each,m,H-26,27,29) ;
13C-NMR(CDCl3,100 MHz)δ:31. 6(C-1) ,32. 0(C-
2) ,71. 9(C-3) ,39. 8(C-4) ,141. 2(C-5) ,121. 8(C-
6) ,32. 1(C-7) ,32. 2(C-8) ,50. 2(C-9) ,36. 8(C-
10) ,21. 3(C-11) ,39. 8(C-12) ,42. 4(C-13) ,56. 2
(C-14) ,24. 5(C-15) ,29. 1(C-16) ,56. 8(C-17) ,
12. 1(C-18) ,19. 7(C-19) ,40. 8(C-20) ,21. 2(C-
21) ,138. 5(C-22) ,129. 3(C-23) ,51. 4(C-24) ,33. 8
(C-25) ,19. 1(C-26) ,21. 5(C-27) ,25. 6(C-28) ,
12. 5(C-29)。以上数据与文献[6]报道的豆甾醇
(stigmasterol)数据一致。
化合物 4:白色片状晶体(石油醚-乙酸乙酯) ,
Libermann-Burchard反应呈阳性。mp 155 ~ 156 ℃。
相对分子质量:414;EI-MS m/z:414[M]+。1 H-
NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5. 18(1H,s,m,H-7) ,
3. 64(1H,m,H-3) ,0. 96(3H,d,J = 6. 4 Hz,H-21) ,
0. 89(3H,d,J = 7. 2 Hz,H-29) ,0. 85(3H,d,J = 6. 8
Hz,H-26) ,0. 82(3H,s,H-19) ,0. 60(3H,s,H-18)。
13C-NMR(CDCl3,100 MHz)δ:37. 6(C-1) ,31. 8(C-
2) ,71. 5(C-3) ,38. 0(C-4) ,40. 8(C-5) ,30. 5(C-6) ,
118. 0(C-7) ,139. 8(C-8) ,50. 1(C-9) ,34. 8(C-10) ,
21. 8(C-11) ,39. 9(C-12) ,43. 4(C-13) ,55. 4(C-
14) ,23. 5(C-15) ,27. 8(C-16) ,56. 2(C-17) ,12. 1
(C-18) ,13. 2(C-19) ,36. 8(C-20) ,19. 1(C-21) ,
34. 1(C-22) ,26. 3(C-23) ,46. 0(C-24) ,29. 2(C-
25) ,19. 1(C-26) ,21. 0(C-27) ,23. 3(C-28) ,12. 1
(C-29)。以上波谱数据与文献[7]报道的豆甾-7-
烯-3β-醇(stigmast-7-en-3β-ol)数据基本一致。
化合物 5:橙红色针晶(丙酮) ,mp 256 ~ 258
℃。相对分子质量:270;ESI-MS m/z:270[M]+。1
H-NMR(400 MHz,CD3 COCD3) δ:12. 09,12. 03,
10. 22(1H each,s,OH) ,7. 49(1H,s,H-4) ,7. 18
(1H,s,H-2) ,7. 12(1H,d,J = 2. 4 Hz,H-5) ,6. 60
(1H,d,J = 2. 4 Hz,H-7) ,2. 43(3H,s,CH3)。其氢
谱数据与文献[8]报道的大黄素基本一致,另外与
大黄素标准品共薄层 Rf一致,且与标准品混合熔点
不变,故确定该化合物为大黄素(emodin)。
化合物 6:黄色颗粒状晶体(丙酮) ,三氯化铁-
铁氰化钾反应呈阳性,盐酸-镁粉反应呈阳性,mp
353 ~ 354 ℃。相对分子质量:270;ESI-MS m/z:
270[M]+。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:12. 92,
11. 12,10. 84(1H each,brs,OH) ,7. 91(2H,d,J =
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8. 6 Hz,H-2,6) ,6. 92(2H,d,J = 8. 6 Hz,H-3,
5) ,6. 78(1H,s,H-3) ,6. 50(1H,d,J = 2. 2 Hz,H-
8) ,6. 19(1H,d,J = 2. 2 Hz,H-6) ;13 C-NMR(DMSO-
d6,100 MHz)δ:164. 5(C-2) ,103. 1(C-3) ,182. 0
(C-4) ,157. 6(C-5) ,94. 3(C-6) ,164. 1(C-7) ,99. 1
(C-8) ,161. 8(C-9) ,103. 9(C-10) ,121. 5(C-1) ,
128. 8(C-2,6) ,116. 2(C-3,5) ,161. 5(C-4)。以
上数据与文献[9]报道的芹菜素(apigenin)基本
一致。
化合物 7:黄色针状晶体(丙酮) ,盐酸-镁粉反
应呈阳性,TLC喷 5% AlCl3-乙醇溶液紫外灯下显黄
色荧光,mp 329 ~ 330 ℃。相对分子质量:286;
ESI-MS m/z(%) :286[M]+。1 H-NMR(DMSO-d6,
400 MHz)δ:12. 95,10. 81,9. 98,9. 45(1H each,
brs,OH) ,7. 43(1H,d,J = 8. 0 Hz,H-6) ,7. 40(1H,
s,H-2) ,6. 99(1H,d,J = 8. 0 Hz,H-5) ,6. 68(1H,
s,H-3) ,6. 45(1H,d,J = 2. 0 Hz,H-8) ,6. 20(1H,d,
J = 2. 0 Hz,H-6) ;13 C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:
164. 2(C-2) ,102. 5(C-3) ,181. 8(C-4) ,161. 8(C-
5) ,98. 8(C-6) ,163. 9(C-7) ,94. 2(C-8) ,157. 5(C-
9) ,103. 8(C-10) ,121. 7(C-1) ,113. 5(C-2) ,145. 6
(C-3) ,149. 8(C-4) ,116. 2(C-5) ,119. 8(C-6)。
以上波谱数据与文献[10]报道的木犀草素
(luteolin)一致。
化合物 8:黄色粉末(甲醇) ,mp 255 ~ 257 ℃,
三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性,Molish 反应呈阳
性,ESI-MS m/z:449[M + H]+。1H-NMR(DMSO-d6,
400 MHz)δ:13. 02,10. 01,9. 43(1H each,s,OH) ,
7. 52(1H,dd,J = 8. 2,2. 2 Hz,H-6) ,7. 45(1H,d,
J = 2. 2 Hz,H-2) ,6. 97(1H,d,J = 8. 2 Hz,H-5) ,
6. 83(1H,d,J = 2. 0 Hz,H-8) ,6. 78(1H,s,H-3) ,
6. 47(1H,d,J = 2. 0 Hz,H-6) ,5. 08(1H,d,J = 6. 8
Hz,H-1″) ;13 C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:164. 8
(C-2) ,103. 5(C-3) ,182. 3(C-4) ,161. 3(C-5) ,
100. 5(C-6) ,163. 3(C-7) ,95. 5(C-8) ,157. 8(C-9) ,
105. 8(C-10) ,121. 9(C-1) ,114. 0(C-2) ,146. 1(C-
3) ,150. 2 (C-4) ,116. 5 (C-5) ,119. 8 (C-6) ,
100. 2(C-1″) ,73. 5(C-2″) ,76. 6(C-3″) ,69. 9(C-
4″) ,77. 5(C-5″) ,61. 0(C-6″)。以上光谱数据与文
献[11]报道的木犀草苷(luteoloside)基本一致。
化合物 9:黄色粉末(甲醇) ,mp 212 ~ 214 ℃,
三氯化铁-铁氰化钾反应呈阳性,Molish 反应呈阳
性,ESI-MS m/z:455[M + Na]+。1 H-NMR(DMSO-
d6,400 MHz)δ:12. 97,10. 43(1H each,s,OH) ,7. 96
(2H,d,J = 8. 6 Hz,H-2,6) ,6. 93(2H,d,J = 8. 6
Hz,H-3,5) ,6. 87 (1H,s,H-3) ,6. 83 (1H,d,
J = 2. 0 Hz,H-8) ,6. 44(1H,d,J = 2. 0 Hz,H-6) ,
5. 07(1H,d,J = 5. 4 Hz,H-1″) ;13 C-NMR(DMSO-d6,
100 MHz)δ:164. 8(C-2) ,103. 6(C-3) ,182. 5(C-
4) ,157. 5(C-5) ,100. 0(C-6) ,163. 5(C-7) ,95. 4(C-
8) ,161. 9(C-9) ,105. 8(C-10) ,121. 5(C-1) ,129. 2
(C-2,6) ,116. 5(C-3,5) ,100. 4(C-1″) ,73. 6(C-
2″) ,76. 9(C-3″) ,70. 0(C-4″) ,77. 7(C-5″) ,61. 1(C-
6″)。以上光谱数据与文献[11]报道的大波斯菊苷
(cosmosin)基本一致。
4 抗菌活性测试
参照文献[12]的方法,以金黄色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)
和白色念珠菌(Candida albicans)为实验菌株,将各
样品配成 50 mg·L -1的供试液,采用纸片扩散法测
定冷水花各萃取部位及单体化合物的抑菌圈直径,
结果见表 1,冷水花的乙酸乙酯部位具有明显的抑
菌活性,化合物 8、9 对 3 种供试菌株具有很强的抑
菌活性。采用微量肉汤倍比稀释法测定化合物 8、9
的最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC) ,结
果见表 2,化合物 8、9 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌
和白色念珠菌 3 种供试菌株具有较强的抑菌活性及
杀菌活性,均优于阳性对照药剂庆大霉素,其中对金
黄色葡萄球菌的抑菌活性强于大肠杆菌和白色念
珠菌。
5 讨 论
以抗菌活性为指导从冷水花药材体积分数
80%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位分离得到 9 个
表 1 冷水花萃取部位及化合物的抑菌活性
Tab. 1 Antibacterial activity of extracts and compounds of
Pilea notata
Sample
Inhibition zone diameter /mm
S. aureus E. coli C. albicans
Ethyl acetate extracts 14 12 10
n-Butyl alcohol extracts 8 8 -
Water extracts - - -
Compd. 8 24 16 12
Compd. 9 28 14 23
注:样品质量浓度为 50 mg·L -1、菌液浓度为 1. 5 × 109 CFU·mL -1(白色念
珠菌为 1 × 106 CFU·mL -1) ,“ -”表示基本无抑菌作用(即抑菌圈 <8 mm)
Note:sample concentration as 50 mg·L -1,concentration of bacterium as 1. 5 ×
109 CFU·mL -1(C. albicans as 1 × 106 CFU·mL -1) ,“ -”shows no antibacte-
rial activity(inhibition zone diameter < 8 mm)
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表 2 冷水花抗菌活性化合物 8、9 对不同细菌的 MIC 和
MBC. mg·mL -1
Tab. 2 MIC and MBC values of compounds 8 and 9. mg·
mL -1
Bacterial strain
Compd. 8 Compd. 9 Gentamicin
MIC MBC MIC MBC MIC MBC
S. aureus 0. 015 0. 055 0. 010 0. 039 0. 015 0. 063
E. coli 0. 054 0. 216 0. 039 0. 156 0. 056 0. 227
C. albicans 0. 282 2. 513 0. 156 2. 480 0. 325 2. 540
注:菌液浓度为 1. 5 × 109 CFU·mL -1(白色念珠菌为 1 × 106 CFU·mL -1)
Note:concentration of bacterium as 1. 5 × 109 CFU·mL -1(C. albicans as 1 × 106
CFU·mL -1)
化合物,所有化合物均为首次从冷水花药材中分离
得到。文献[13-15]报道了其中的化合物 5、7 和 8
均有抗菌活性;实验中对量大的化合物 8、9 进行了
抗菌活性跟踪测试,结果显示化合物 8、9 对金黄色
葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌 3 种供试菌株具
有较强的抑菌活性及杀菌活性,均优于阳性对照药
剂庆大霉素,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌活性强
于大肠杆菌和白色念珠菌,由此可以推断冷水花中
的蒽醌及黄酮类化合物为其抗菌活性成分。本实验
为冷水花进一步的药效物质基础研究奠定了基础,
为冷水花药材资源的开发和应用提供了一定的科学
基础。
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(收稿日期:2014-05-26)
·2702· Chin Pharm J,2014 December,Vol. 49 No. 23 中国药学杂志 2014 年 12 月第 49 卷第 23 期