全 文 ：　复旦学报(医学版)Fudan Univ J Med Sci 2007 Nov , 34(6)
掌叶半夏有效提取物单独或与顺铂联合对体外
培养宫颈癌 HeLa细胞的作用
李桂玲1 　归绥琪1■ 　朱德厚2 　陈松华2 　叶 　阳3
(1复旦大学附属妇产科医院中西医结合科　上海　200011;2中国科学院上海生命科学院细胞资源中心　上海　200031;
3 中国科学院上海药物研究所　上海　201203)
【摘要】　目的　观察中药掌叶半夏有效提取物(PE)对体外培养宫颈癌 H eLa 细胞的作用 , 以及 PE 对 HeLa细
胞对顺铂(DDP)敏感性的影响 ,以期寻找药物治疗宫颈癌更完善的途径。方法　体外培养宫颈癌 HeLa 细胞 ,
分别用 PE、DDP 及 DDP+PE 处理细胞;用倒置相差显微镜观察细胞生长及摄影 , M TT 法检测细胞活性 , 流式
细胞术检测细胞凋亡。结果　PE及 DDP 对宫颈癌 H eLa细胞的生长均表现出明显的抑制作用 ,低剂量 PE 可
加强 DDP 对 HeLa 细胞的抑制作用;流式细胞术检测结果显示 PE 作用后 HeLa细胞呈现出凋亡 , 且随着作用
时间的延长 ,凋亡细胞的比例明显增加。结论　PE 对宫颈癌 HeLa细胞有明显的抑制生长和促凋亡作用 ,同时
能提高 H eLa 细胞对顺铂的敏感性。
【关键词】　掌叶半夏;　宫颈癌;　H eLa细胞株;　生长抑制;　凋亡
【中图分类号】　R 373.33　　【文献标识码】　A
上海市医学重点学科建设项目(No.05-Ⅲ-016)
■通讯作者　T el:021-63455050 , E-mail:lgl700529@126.com
Effects of pinellia extraction only or combined with
cisplatin on growth of HeLa cells of cervical cancer
LI Gui-Ling1 , GUI Sui-qi1 ■ , Zhu De-hou2 , CHEN Song-hua2 , Ye Yang3
(1 Department of Integrated Traditional and Western Medicine ,Obstetrics and Gynecology Hosp ital , Fudan
University , Shanghai 200011 ,China;2 Cell Resourses Center , Shanghai Institutes o f Biological Sciences ,
Chinese Academy o f Sciences , Shanghai 200031 ,China;3 Shanghai Institute of Materia Medica ,
Chinese Academy o f Sciences , Shanghai 201203 ,China)
【Abstract】　Purpose　To investigate the effect s of pinellia ext raction(PE)on HeLa cell line of cervi-
cal cancer cultured inv itro and it s effect on the sensitivity of HeLa cells to DDP , in order to find a pure
t raditional Chinese reagent t o treat cervical cancer effectively and ultimately to optimize medication of
cervical cancer.　Methods　HeLa cells were treated with PE in dif ferent concentrations.The effect s
of PE on cell proliferation was tested by M TT assay.The ef fects of PE on cell morphology and
apopt osis were studied by phase-cont rast microscope and f low cy tomet ry (FCM), respectively.　Re-
sults　PE could obviously inhibit the proliferation of H eLa cells in a time and dose dependent manner.
It could induce apoptosis of HeLa cells.PE could also elevate the sensi tivity of HeLa cells to DDP.　
Conclusions　PE can suppress proliferation of cervical cancer cells and induce apoptosis.It may be a
pure t raditional Chinese reagent with non-side effects to prevent and treat cervical cancer effectively.
【Key words】　Pinellia;　cervical cancer;　HeLa cell line;　grouth inhibition;　apoptosis
　　宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤 ,占女性生殖
系统恶性肿瘤的半数以上 ,其死亡率居女性恶性肿
瘤的首位[ 1] 。近年来随着人乳头状瘤病毒(HPV)
感染率的上升 ,宫颈癌的发病率呈上升趋势 ,且高发
年龄趋于年轻化 , 成为严重危害妇女健康的疾
病[ 2 ～ 5] 。掌叶半夏为天南星科植物掌叶半夏的块
茎 ,又名虎掌南星 , 有定惊祛风 、化痰散结之功。
1978年上海第一医学院妇产科医院首先报道应用
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复旦学报(医学版)　2007年 11 月 , 34(6)　
掌叶半夏治疗宫颈癌疗效确切[ 6] 。近年来 ,科研人
员对掌叶半夏的药理进行了深入研究 ,发现其抗肿
瘤作用明显。本文利用中国科学院上海药物所采用
现代工艺提取的掌叶半夏有效提取物(Pinellia Ex-
t raction ,以下简称 PE)作为研究对象 ,观察其对体
外培养宫颈癌细胞株HeLa的作用 ,以及 PE 对 He-
La细胞对顺铂(DDP)敏感性的影响 ,为寻找一种能
有效防治女性宫颈病变的纯中药制剂奠定理论基
础 ,以期为宫颈癌的药物治疗寻找更完善的途径。
材料 和 方法
药物 、细胞 、培养液与主要仪器　PE由中国科
学院上海药物所天然药化研究室提供 , DMSO 溶
解 ,过滤除菌 ,冷藏备用;RPM I1640 培养液(GIB-
CO)、胎牛血清(GIBCO);二甲基噻唑二苯基四唑溴
盐(MTT)(Sigma);Annxin-V 、PI 双染试剂盒
(BD);人宫颈癌细胞株 HeLa 引自美国典型培养物
保藏中心(A TCC),经中国科学院细胞库复苏后提
供;倒置相差显微镜(Nikon)、 CO 2 细胞孵育箱
(Heraeus)、超净工作台(苏州净化设备有限公司)、
连续光波酶标仪(Bio-Rad)、流式细胞仪(Becton
Dickinson)。
HeLa细胞培养　细胞培养于含 10%FBS 的
RPM I1640培养液 , 37 ℃、5% CO 2 、饱和湿度条件
常规培养;细胞培养至铺满瓶底后用含 0.25%胰蛋
白酶消化液消化细胞并按 1.0×105/mL 分瓶 , 3-5
d传代一次 。
细胞增殖抑制实验(MTT法)　取对数生长期
的 HeLa 细胞 ,胰酶消化后吹打成单细胞悬液(2×
10
4/mL)接种于 96孔培养板 ,培养 24 h细胞贴壁
后加入不同浓度的 PE , 使最终浓度分别为 0 、
0.008 、0.031 、0.125及0.5 mg/mL ,同时设空白对
照及溶剂对照 ,每一浓度设 3副孔 ,分别培养 1 、3 、5
d ,每孔加 20 uL 5 mg/mL 的 M TT 液 ,37 ℃孵育 4
h ,弃培液 ,加 150μL DMSO ,室温下振荡 10 min ,使
充分溶解后于 570 nm/630 nm 测定吸光值 A 。本
实验重复 3次 ,绘制细胞生长曲线 。另设 DDP 处理
组 ,使终浓度分别为 5 、2 、1 及 0.5 mg/ L;同时设
DDP +PE(0.05 mg/mL)组 ,即上述 DDP 作用浓度
分别加0.05 mg/mL 的 PE 。计算 PE 、DDP 、DDP +
PE(0.05 mg/mL)作用 3 d 对细胞生长的抑制率 ,
抑制率(%)=(A对照-A 处理)/A 对照×100%。
倒置相差显微镜摄影　取对数生长期的 HeLa
细胞 ,胰酶消化制成单细胞悬液(2×104/mL)等量
接种于 24孔培养板 ,培养 24 h 细胞贴壁后加入 0
或 0.15 mg/mL 的PE ,分别培养 1 、2 、3 d ,倒置相差
显微镜下观察摄影 。
流式细胞检测　取对数生长期的 HeLa 细胞稀
释至 1×10 5/mL 种植于培养瓶 ,24 h细胞贴壁后 ,
加入 0.15 mg/mL 的 PE ,继续培养不同的时间 ,
0.25%胰酶消化后 2 000 r/min 离心 5 min ,弃上
清 ,PBS 洗 2 次 ,加 70%的冷乙醇固定 , PBS 洗 2
次 ,加入 RNA 酶 0.1 mg/mL 37 ℃孵育 30 min ,再
加入 50 mg/L 的碘化丙啶(PI)1 mL ,染色 30 min ,
用流式细胞仪(Becton Dickinson 公司)进行检测 ,
结果用 B.D.公司 CELLQUEST 和 ModFIT LT
for mac v 1.01软件进行分析 。主要指标为细胞凋
亡 。激光工作条件为氩离子激光器 Innova90-5 ,激
光功率为 15 mw ,激光波长为 488 nm 。
统计学方法　采用 SPSS 软件进行统计分析 ,P
<0.05为差异有显著意义。
结　　　果
细胞增殖抑制实验结果 　MT T 试验结果显
示 ,低剂量 PE(0.008 mg/mL 、0.031 mg/mL)及溶
剂对细胞的生长无明显抑制作用 ,中等剂量 PE
(0.125 mg/mL)对 HeLa细胞的生长已表现出明显
的抑制作用 ,与对照组比较差异有显著意义;当 PE
的浓度达到0.5 mg/mL 时 ,细胞的生长完全受抑
制 ,如表 1所示。 5 、2 、1及0.5 mg/L 的 DDP 作用 3
d 后 , 对 HeLa 细胞的抑制率分别为 59.6%、
37.7%、12.7%及11.8%,DDP +PE(0.05 mg/mL)
作用 3 d后 ,对 HeLa细胞的抑制率分别达71.1%、
54.7%、38.5%及29.1%,明显高于 DDP 组 ,差异有
显著性(P<0.05)。
表 1　MTT分析 PE对 HeLa细胞的增殖抑制作用
Tab 1　Inhibitory effects of PE on HeLa cells by MTT assay
Densi ties of
PE(mg/mL) Absorbance(A) Inhibit ion ratio(%)
b lan k 0.148±0.010 0
0.008 0.136±0.018 8.0
0.031 0.131±0.021 11.5
0.125 0.104±0.029(1) 29.8(1)
0.500 0.008±0.001(2) 94.6(2)
　(1)P<0.05 , (2)P<0.01 vs cont rol
　　PE作用后 HeLa细胞形态学变化　正常生长
的 HeLa细胞 ,胞质透亮(图 1 H1-H3)。0.15 mg/
mL 的 PE 作用于细胞 1 d 后 ,细胞胞质即减少 ,形
态轮廓不清晰 ,随着作用时间延长 , 2 ～ 3 d 后细胞
逐渐皱缩直至脱离瓶壁 ,而呈悬浮状态(图 2 HE1-
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　李桂玲 ,等.掌叶半夏有效提取物单独或与顺铂联合对体外培养宫颈癌 HeLa细胞的作用
HE3)。流式细胞术检测结果显示近半数悬浮细胞
已凋亡。
流式细胞术检测结果　PE 作用后 HeLa 细胞
出现很大比例的凋亡 ,并且随着作用时间的延长 ,凋
亡细胞比例明显增加 。如图 3 所示:PE 作用 3 d
后 , HeLa细胞凋亡率为 48.76%;作用 5 d后 , He-
La细胞凋亡率高达 83.37%,与正常对照组比较有
显著性差异 。
图 1　0.15 mg/mL PE作用不同时间后细胞形态的变化(×100)
Fig 1　Morphologic changes of HeLa cells treated by PE(0.15 mg/mL)for dif ferent times(×100)
H1-H3:unt reated HeLa cell s for 1 t o 3days;HE1-HE3:H eLa cel ls t reated by PE for 1 t o 3 days
图 2　PE作用不同时间后细胞凋亡率
Fig 2　Apoptosis rates of HeLa cells treated with PE for Dif ferent times
A:cel ls growing for 3 days;B:cells t reated w ith PE for 3 day s;C:cells growing for 5 days;D:cel ls t reated wi th PE for 5 days
表 2　DDP 单独或与 0.05 mg/mLPE联合
作用 72 h对 HeLa细胞的抑制
Tab 2　Inhibitory ef fects of DDP or DDP plus
PE(0.05 mg/mL)on HeLa cells for 72 hs
Den siti es of DDP
or DDP plu s PE
Ab sorban ce(A) Inhibi ti on rat io(%)
DDP(m g/ L)5 0.092±0.01 59.6
2 0.147±0.02 37.7
1 0.199±0.02 12.7
0.5 0.201±0.02 11.8
DDP(m g/ L)5+
PE(0.05 mg/mL) 0.075±0.01 71.7(1)
2 0.120±0.01 54.7(1)
1 0.163±0.02 38.5(1)
0.5 0.188±0.03 29.1(1)
blank 0.228±0.04 0
　(1)P<0.05 vs DDP group
讨　　　论
迄今为止 ,宫颈癌仍是引起妇女死亡的主要原
因之一 。世界卫生组织 20世纪 80年代的统计结果
表明[ 1] ,全世界每年的新发宫颈癌病例约为 45.94
万 ,我国每年新发病例约为 13.15万 ,占全世界宫颈
癌新发病例的 1/3 ,每年死亡约为 5.3万 ,平均死亡
率为 14.6/10万 ,居世界第 2位 。因此 ,有效地预防
和治疗宫颈病变已成为全球性挑战[ 9] 。虽然宫颈癌
的治疗包括基因治疗 、免疫治疗等已取得了不少突
破性进展 ,以及欧美等发达国家宫颈癌疫苗的上
市[ 1 0] ,确实为宫颈癌的预防和治疗带来了福音 ,但
是在中国 ,疫苗普及还是很遥远的事情。因此 ,如何
发掘中医药治疗肿瘤的潜力 、开展中医药治疗肿瘤
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复旦学报(医学版)　2007年 11 月 , 34(6)　
的机制研究已受到国内外的重视。
中医妇科学将宫颈癌列入“癥瘕”范畴。其中痰
湿结聚为最常见病因 ,常与血瘀相伴 ,终积为“癥” ,
故中医以辩证为痰湿癥瘕型为多见 。治则为化痰软
坚散结 ,活血祛瘀消癥。传统中药掌叶半夏(Pinella
pedat isecta schot t)系天南星科半夏属掌叶半夏的
块茎 ,味辛 ,性平 ,有毒 ,具有祛风定惊 、化痰散结的
功效 ,临床上常外用治疗毒蛇咬伤及无名肿毒 。 20
世纪 70年代 ,上海第一医学院妇产科医院用掌叶半
夏治疗宫颈癌 ,研究分三个阶段:第一阶段用新鲜掌
叶半夏煎汤代茶口服并捣烂外敷患处;第二阶段提
取成分制成片剂口服 ,并制成栓剂 、棒剂外用;第三
阶段以浓醇提取物制成片剂和栓 、棒剂内服外用 。
用此法先后治疗宫颈癌 247例 ,治疗期在两个月以
上 , Ⅰ期有效率 96.67%, Ⅱ期有效率为 74.66%, Ⅲ
期有效率 74.21%[ 6-8] 。研究还发现 , 掌叶半夏浸
出液对 HeLa 细胞有明显的抑制作用 ,表现为细胞
凝缩成团块 ,失去正常细胞结构 ,而且部分细胞脱
落。由掌叶半夏等中药制成的薄膜对宫颈癌前病变
有一定的阻断作用。但对该药的药理作用机制未进
行过深入研究。此外 ,孙光星等[ 11] 发现掌叶半夏蛋
白成分对 S-180 小鼠肉瘤有明显抑制作用 ,朱铭
伟[ 12]则观察到掌叶半夏总蛋白对多种卵巢癌细胞
株有明显抑制作用。随着中医药现代化的进程 ,中
药提纯工艺的不断优化 ,使得对掌叶半夏有效成分
的提取 、纯化及鉴定成为可能 。本文采用中科院上
海药物所天然药化研究室提供的 PE 作为研究对
象 ,观察其对体外培养的宫颈癌细胞株 HeLa 生长
的作用。PE 为脂溶性半固体物质 , DMSO 可以使
它充分溶解后加入培养液中 , 制成实验所需浓度
备用 。
本文的研究结果显示:中等剂量 PE(0.125
mg/mL)作用 3 d对 HeLa 细胞的生长已表现出明
显的抑制作用 ,与对照组比较差异有显著意义;当
PE 的浓度达到 0.5 mg/mL 时 ,细胞的生长完全受
到抑制 。倒置相差显微镜下观察到正常生长的 He-
La细胞 ,胞质透亮 ,轮廓清晰;0.15 mg/mL 的 PE
作用于细胞 1 d后 ,细胞胞质即减少 ,形态轮廓不清
晰 ,随着作用时间延长 , 2 ～ 3 d后细胞逐渐皱缩直
至脱离瓶壁 ,而呈悬浮状态 。流式细胞术检测结果
显示 PE作用 3 d 后近半数细胞已凋亡。本研究同
时观察到低剂量 PE(0.05 mg/mL)即可以提高 He-
La细胞对 DDP 的敏感性 ,DDP 作用 于 HeLa细胞
72 h的半数抑制量(IC50)由 5 mg/ L 降至 2 mg/L
左右。由此推测 PE有可能成为宫颈癌治疗的辅助
药物 ,这为完善宫颈癌的药物治疗提供了更广阔的
思路。
从以上实验已初步观察到 , PE对体外培养的宫
颈癌细胞株 HeLa的生长有明显的抑制作用及促凋
亡作用 。PE对 HeLa细胞的促凋亡机制 ,以及是否
通过影响癌基因 、抑癌基因及病毒癌基因的表达 ,从
而抑制 HeLa细胞生长的作用机制将在进一步的研
究中明确。
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(收稿日期:2007-03-29;编辑:沈玲)
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