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响应面法优化对叶百部生物碱提取工艺的研究
刘颖坤1， 蔡铃潇2， 张爱莲1 * ， 汪云珍3， 包志泉4， 严红梅1
(1． 浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300;2． 临安市林业局，浙江
临安 311300;3． 建德市新安江林场，浙江 建德 311600;4． 建德市寿昌林场，浙江 建德 311612)
收稿日期:2014-05-16
基金项目:浙江农林大学校级教学项目 (yb1308，KCGX1302)
作者简介:刘颖坤 (1982—) ，男，硕士，实验师，从事质量控制研究。E-mail:liuyingkun1@ qq． com
* 通信作者:张爱莲 (1975—) ，女，博士，讲师，从事天然药物、质量控制等研究。E-mail:zhangailian@ 126． com
摘要:目的 得到一个快速、高效的对叶百部中生物碱的提取工艺，为对叶百部在医药、食品等方面的开发提供理
论支持。方法 以 PEG1000 用量、硫酸钠用量和料液比为响应因素，总生物碱提取率为响应值，采用响应面法考察
以上提取条件对对叶百部中生物碱提取效率的影响。结果 确定最佳提取条件为 PEG1000 质量分数 32. 4%，无水
Na2SO4 质量浓度 0. 353 g /mL，料液比 1 ∶ 27. 5，超声时间 50 min。经验证，响应面优化的最佳提取条件下对叶百部总
生物碱含有量最高，为 9. 01 mg /g，与理论预测值吻合良好。结论 与传统的加热回流法相比，本提取工艺提高了总
生物碱提取率，缩短了提取时间，降低了提取温度，在百部活性成分的提取分离方面展现了良好的应用前景。
关键词:对叶百部;生物碱;双水相;响应面法;超声辅助提取
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2015)09-2078-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 09. 049
对叶百部为百部科植物对叶百部 Stemona tuberosa Lour．
的干燥块根，分布于福建、台湾、江西、湖北和云南等省
市［1］，具有润肺下气、止咳和杀虫的功效，为 《中国药
典》2010 年版所收载百部药材的 3 个来源之一［2］。生物碱
是百部的主要活性成分，具有良好的杀虫、抗菌和镇咳祛
痰等作用［3］。目前，对叶百部总生物碱的定量测定研究很
少，且局限于有机溶剂提取［4］。双水相萃取 (aqueous two-
phase extraction，ATPS)［5］能够克服传统提取分离的耗时长、
工作量大和有机溶剂毒性大等缺点，是近年来引人注目的
新型分离技术［6］。
响应面分析法 (response surface methodology，ＲSM)是
一种优化工艺条件的有效方法［7］，可用于确定各因素及其
交互作用在工艺过程中对指标 (响应值)的影响，精确地
表述因素与响应值之间的关系，在试验设计与结果表达方
面比以往推广的正交设计法更加优良［8］。
本实验采用双水相体系提取，利用酸性染料比色法测
定对叶百部总生物碱提取率［9］，通过响应面优化法考察有
机物用量、无机盐用量和料液比 3 个因素对生物碱提取率
的影响，确定最佳提取工艺，以期为对叶百部生物碱的生
产开发奠定理论基础。
1 仪器与试剂
UV-2550 紫外分光光度计 (日本岛津公司) ，SHB-Ⅲ
循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司) ，BUCHI
旋转蒸发仪 (上海岛通应用科技有限公司) ，AB104-N 电
子天平 (上海精密科学仪器有限公司) ，SWB5200 型超声
清洗机 (上海必能信超声有限公司) ，DGG-9070 电热恒温
鼓风干燥箱 (上海森信实验仪器有限公司)。
对叶百部碱对照品 (纯度≥98%，成都曼斯特生物科
技有限公司，批号 A0326) ，溴甲酚绿 (上海三爱思试剂有
限公司) ，0. 05%溴甲酚绿缓冲液 (自制，取 0. 2 mol /L 醋
酸钠 70 mL和 0. 2 mol /L 醋酸 30 mL，配得 pH 5. 0 的缓冲
液;取溴甲酚绿 0. 05 g，加入 pH 5. 0 的缓冲液 100 mL，溶
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解，滤过，即得) ，聚乙二醇 1000 (PEG1000) (上海浦东
高南化工厂) ，无水醋酸钠 (温州润华化工实验公司) ，硫
酸钠 (湖州湖试化学试剂有限公司) ，其他试剂均为分
析纯。
百部药材购买于浙江临安钱王大药房 (按参考文献
［10］的方法对药材进行鉴定，结果表明其为对叶百部)。
将药材置于 50 ℃烘箱中烘干至恒定质量，粉碎，过 60
目筛。
2 方法
2. 1 标准曲线的制作 精密称取对叶百部碱 5. 0 mg，甲醇
定容至 5 mL，制得质量浓度为 1. 0 mg /mL 的对照品贮备
液。取贮备液逐级稀释，得质量浓度分别为 0. 1、0. 2、
0. 4、0. 6、0. 8 mg /mL的系列对照品溶液。
分别精密吸取系列对照品溶液 0. 1 mL，置分液漏斗
中，依次加入蒸馏水 5 mL、0. 05%溴甲酚绿缓冲液 2 mL、
三氯甲烷 10 mL，振摇 1 min，静置 1 h 后，取三氯甲烷层
在 417 nm波长测定吸光度。另取 0. 1 mL甲醇，同法操作，
作为空白对照。以吸光度为纵坐标 (Y) ，对照品质量浓度
为横坐标 (X) ，进行回归计算，得到标准曲线及回归方程
Y = 1. 570 45X － 0. 003 53，r2 = 0. 999 1 (n = 5)。实验表明，
对叶百部碱在 0. 1 ～ 0. 8 mg /mL范围内与吸光度呈良好的线
性关系。
2. 2 对叶百部生物碱的提取与测定 精密称取药材 0. 5 g
于锥形瓶中，按一定料液比加入双水相体系溶液
(PEG1000 溶液-Na2SO4 溶液体积比 3 ∶ 2) ，超声提取一定
时间，抽滤，滤液置于分液漏斗静置分层，取上层
PEG1000溶液，50 ℃减压浓缩回收溶剂，用甲醇定容至 10
mL，得供试液。按“2. 1”项下操作测定吸光度，根据回
归方程计算出供试液中生物碱质量浓度，按下式计算得生
物碱的提取率，每组试验重复 3 次。
生物碱提取率 (mg /g) =
供试液中生物碱质量浓度 (mg/mL) ×供试液体积 (mL)
供试品质量 (g)
2. 3 单因素设计
2. 3. 1 Na2SO4 用量比较 精密称取 5 份 0. 5 g样品，保持
其他条件不变 (PEG1000 质量分数 30%，超声时间 50
min，料液比为 1 ∶ 30) ，调整 Na2SO4 质量浓度分别为
0. 25、0. 3、0. 35、0. 4 和 0. 45 g /mL，按“2. 2”项下方法
检测提取物中的生物碱提取率，重复 3 次。
2. 3. 2 PEG1000 用量比较 精密称取 5 份 0. 5 g 样品，保
持其他条件不变 (Na2SO4 质量浓度为 0. 35 g /mL，超声时
间 50 min，料液比 1 ∶ 30) ，调整 PEG1000 的质量分数分别
为 10%、20%、30%、40%和 50%，按“2. 2”项下方法
检测提取物中的生物碱提取率，重复 3 次。
2. 3. 3 料液比优化 精密称取 5 份 0. 5 g 样品，保持其他
条件不变 (Na2SO4 质量浓度 0. 35 g /mL，PEG1000 质量分
数 30%，超声时间 50 min) ，调整料液比 1 ∶ 10，1 ∶ 20，
1 ∶ 30，1 ∶ 40，1 ∶ 50，按“2. 2”项下方法检测提取物中
的生物碱提取率，重复 3 次。
2. 3. 4 超声时间比较 精密称取 5 份 0. 5 g 样品，保持其
他条件不变 (Na2SO4 质量浓度 0. 35 g /mL，PEG1000 质量
分数 30%，料液比 1 ∶ 30) ，分别超声 10、20、30、40、
50、60 min，按“2. 2”项下方法检测提取物中的生物碱提
取率，重复 3 次。
2. 4 响应面设计试验 根据单因素试验的结果，选择
PEG1000 用量、Na2SO4 用量和料液比 3 个因素，按照
“2. 2”项下操作测定提取物中对叶百部生物碱提取率，进
行 3 因素 3 水平共 15 个试验点 (3 个中心点)的响应面分
析试验，使用 Design-expert software 7. 1. 3 Trial 软件 (美
国)进行数据分析，求出数学模型，进而得到最佳的提取
工艺条件。
2. 5 回流法提取百部中生物碱 精密称取百部样品粉末
0. 5 g，加 15 mL 体积分数为 70%的乙醇，回流时间 1 h，
提取温度 80 ℃。滤过，滤渣用少量提取试剂冲洗滤过，合
并所有滤液，50 ℃减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移
至 10 mL 量瓶中，定容，摇匀，作为供试品溶液，按照
“2. 2”项操作，测定样品中的生物碱提取率。
3 结果与分析
3. 1 单因素试验结果
3. 1. 1 Na2SO4 用量对生物碱提取率的影响 从图 1 可以
看出，随着 Na2SO4 用量的增大，生物碱提取效率逐渐增
加，在 Na2SO4 质量浓度 0. 35 g /mL时，生物碱提取率达到
最高，之后生物碱提取率出现下降，故选择 Na2SO4 用量在
0. 35 ～ 0. 4 g /mL为宜。
图 1 Na2SO4 用量对生物碱提取率的影响
3. 1. 2 PEG1000 用量对生物碱提取率的影响 从图 2 可以
看出，随着 PEG1000 质量分数的增加，生物碱提取率逐渐
增加，在 30%时，提取率达到最高，之后提取率出现下
降，故选择 PEG1000 的用量在 20% ～40%为宜。
3. 1. 3 料液比对生物碱提取率的影响 从图 3 可以看出，
随着料液比的增加，生物碱提取率随之增加。在料液比
1 ∶ 30 时，生物碱提取率达到最高，之后生物碱提取效率
出现下降，故选择料液比在 1 ∶ 40 ～ 1 ∶ 20 为宜。
3. 1. 4 超声时间对生物碱提取率的影响 随着超声时间的
增加，生物碱提取率不断增加，在 40 min 前增加较为明
显;在 50 min时，生物碱含有量达到最高;50 min 后，生
物碱提取率变化不大，趋近平行。观察供试液发现，随着
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图 2 PEG1000 用量对生物碱提取率的影响
图 3 料液比对生物碱提取效率的影响
提取时间的延长，色泽加深。考虑到超声时间过长，温度
会有所升高，可能对生物碱的结构有一定的影响，且从缩
短工时节省能源而得到较高的提取效率角度来考虑，选择
超声时间 50 min为宜。
3. 2 响应面法优化百部中生物碱提取工艺 对百部生物碱
提取工艺进行响应面分析的具体试验方案及实验结果见表
1。15 个试验分为析因点和零点，试验号 1 ～ 12 是析因试
验，13 ～ 15 是中心试验。其中析因点为自变量取值在 X1、
X2、X3 所构成的三维定点，零点区域为中心点，零点试验
重复 3 次，以估计试验误差。
表 1 响应面分析方案及试验结果
编号
X1 Na2 SO4 /
(g·mL －1)
X2
PEG1000 /%
X3
料液比 /(m/V)
生物碱提取
率 /(mg·g － 1)
1 0. 3 20 1 ∶ 30 6. 07
2 0. 4 20 1 ∶ 30 5. 61
3 0. 3 40 1 ∶ 30 5. 98
4 0. 4 40 1 ∶ 30 5. 67
5 0. 3 30 1 ∶ 20 7. 35
6 0. 4 30 1 ∶ 20 7. 01
7 0. 3 30 1 ∶ 40 6. 68
8 0. 4 30 1 ∶ 40 6. 54
9 0. 35 20 1 ∶ 20 7. 65
10 0. 35 40 1 ∶ 20 7. 38
11 0. 35 20 1 ∶ 40 7. 44
12 0. 35 40 1 ∶ 40 7. 23
13 0. 35 30 1 ∶ 30 8. 79
14 0. 35 30 1 ∶ 30 8. 92
15 0. 35 30 1 ∶ 30 8. 97
采用 Design Expert 7. 1. 6 软件对中心组合试验数据进
行回归分析的结果见表 2。以百部生物碱提取率为响应值，
经回归拟合后，得到回归方程
Y = － 88. 477 08 + 494. 341 67X1 + 0. 722 12X2 + 0. 063 500X3
+ 0. 075 000X1X2 + 0. 100 00X1X3 + 0. 027 473X2X3 －
718. 166 67X21 － 0. 012 654X
2
2 － 0. 101 03X
2
3
表 2 ＲSM分析拟合回归方程的方差分析
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 显著性
X1 1 0. 2 0. 2 7. 56 0. 040 3 *
X2 1 0. 033 0. 033 1. 26 0. 026 2 *
X3 1 0. 28 0. 28 10. 89 0. 021 5 *
X1X2 1 0. 28 0. 28 0. 22 0. 660 4
X1X3 1 0. 010 0. 010 0. 39 0. 561 1
X2X3 1 0. 16 0. 16 0. 035 0. 583 9
X21 1 11. 90 11. 90 460. 82 ＜ 0. 000 1 ＊＊
X22 1 5. 91 5. 91 228. 91 ＜ 0. 000 1 ＊＊
X23 1 0. 15 0. 15 5. 89 0. 059 7 *
失拟项 3 0. 11 0. 037 4. 32 0. 193 7
纯误差 2 0. 017 8. 43
总误差 14 17. 28
注:＊＊表示极显著;* 表示显著
由表 2 的方差分析可知，上述回归方程在描述各因子
与响应值之间的关系时，其因变量和全体自变量之间的线
性关系显著 (Ｒ2 = 0. 999 8) ;失拟项的 P = 0. 165 2 大于
0. 1，说明失拟项是不显著的。以上结果说明该回归方程对
试验拟合情况很好，可以很好地反映各因素与响应值之间
的真实关系。在一次项和二次项中都有显著性因素，因此
各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。响应值
Y与 X21，X
2
2 呈极显著相关，与 X1，X2，X3，X
2
3 呈显著
相关［11］。
响应曲面图和剖面图是响应值对各试验因子 V、P、t
所构成的响应面图形，从响应面分析图上可形象地看出最
佳参数及各参数之间的相互作用，剖面图的形状反映出两
因素交互作用的强弱，图中等高线越趋向于椭圆，则反映
出两因素交互作用越强［11］。由图 4 ～图 6 可较为直观地看
出各因素对百部中生物碱提取效率的影响，曲线越陡峭，
表明该因素对百部生物碱提取效率的影响越大，响应值的
变化亦愈大。由等值线图可以看出存在极值的条件在圆心
区域。对回归方程求一阶偏导数代入变换公式即得最佳提
取条件 PEG1000 质量分数 32. 4%，Na2SO4 质量浓度 0. 353
g /mL，料液比 1 ∶ 27. 5，此条件下百部生物碱含有量预测
值为 9. 09 mg /g。在此条件下进行 3 次平行验证试验，得到
总生物碱含有量 9. 01 mg /g，与理论预测值吻合良好。
3. 3 不同提取方法的比较 将本法与常规回流提取方法进
行比较研究，常规回流提取法提取百部中总生物碱含有量
为 7. 21 mg /g，小于聚乙二醇 1000 (PEG1000) /无水
Na2SO4 双水相组合在最佳提取条件下对对叶百部的生物碱
的提 取 率。结 果 表 明，超 声 耦 合 聚 乙 二 醇 1000
(PEG1000) /无水 Na2SO4 双水相体系用于提取百部中的生
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图 4 硫酸钠 (A)与 PEG1000 用量 (B)对生物碱提取效率影响的曲面图和剖面图
图 5 硫酸钠用量 (A)与料液比 (C)对生物碱提取效率影响的曲面图和剖面图
图 6 PEG1000 用量 (B)与料液比 (C)对生物碱提取率影响的曲面图和剖面图
物碱，不仅用时短，常温下可进行，避免了某些活性成分
因高温分解而损失，而且生物碱得率也高于常规方法，证
明了超声耦合双水相体系的优越性，具有一定的实用价值。
4 讨论
本实验通过单因素试验考察了 PEG1000 用量、Na2SO4
用量、液料比和超声时间对百部生物碱提取效率的影响，
确定了进一步试验的范围，再应用响应面分析法对各因素
的最佳水平范围及其交互作用进行研究和探讨，建立了影
响生物碱提取效率的二次多项数学模型，依据回归分析结
果可知，百部生物碱提取的最佳条件为 PEG1000 质量分数
32. 4%，Na2SO4 质量浓度 0. 353 g /mL，料液比 1 ∶ 27. 5。
采用此优化条件进行提取试验，与理论预测值相符。
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PEG1000 /Na2SO4 双水相体系中，生物碱分配于上相有
机相，而其他水溶性成分则分配于盐水下相中，从而在提
取的同时也实现了生物碱与某些无效成分如糖类等的分离，
有效提高了产物的纯度。另外，在提取过程中，生物碱转
移至 PEG1000 相，可改变提取过程中的化学平衡，有利于
更多生物碱的溶出。实验研究表明，与传统的加热回流法
相比，超声辅助提取与 PEG1000 /Na2SO4 双水相体系可方
便实现集成，并能缩短提取时间、提高效率，降低提取温
度，避免了某些活性成分因高温分解而损失，从而获得了
高纯度和活性的生物碱。该提取工艺在百部活性成分的提
取分离方面展现了良好的应用前景。
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微波提取对桂枝-甘草药对化学成分影响的研究
黄一可1，2， 万敬员1* ， 夏之宁2
(1． 重庆医科大学药学院，重庆 400016;2． 重庆大学创新药物研究中心，重庆 400030)
收稿日期:2015-01-21
作者简介:黄一可 (1990—) ，女，硕士，研究方向为天然药物化学。Tel:18996354295，E-mail:crystalkeke@ sohu． com
* 通信作者:万敬员 (1972—) ，男，教授，硕士生导师，研究方向为炎症与免疫药理学、药物化学。Tel:13629714392，E-mail:jy-
wan@ cqmu． edu． cn
摘要:目的 研究微波提取对桂枝-甘草药对化学成分的影响。方法 微波提取桂枝-甘草药对，测定主要化学成分甘
草酸和桂皮醛的含有量，考察微波功率和提取溶剂对提取率的影响。结果 当提取溶剂为 40%乙醇，微波功率为 200
W时，甘草酸和桂皮醛的提取率分别为 5. 65、2. 52 mg /g。结论 微波提取法效率较高，但微波功率和提取溶剂分别
对不同极性成分的提取率和相对含有量会产生较大影响。因此，在微波提取中药复方或药对时，应关注其对化学成分
的影响。
关键词:桂枝-甘草药对;微波提取;甘草酸;桂皮醛;功率;溶剂
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2015)09-2082-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 09. 050
中药复方和配伍是中医临床用药的重要形式，而药对
是中药配伍中最简单的组合，其功效并非仅是单味药物的
简单相加，而是具有协同和拮抗作用，从而发挥综合疗效。
目前，对中药的全面研究最终都落在复方上，而对复方的
研究又是以中药药对的化学成分为切入点［1］。
中药的质量关键在于中药的有效成分，而提取工艺是
否合理将直接影响到药材有效成分的提出，以及最终摄入
人体中的药物的各种化学成分含有量和相对比例，尤其是
对于复方中药制剂而言，正确的提取工艺是重要的一环。
如今，常见的中药提取方法有很多，但大多存在提取率不
高、原料浪费严重等缺点，不能满足高效、快速的要求［2］，
而微波辅助提取被引入到中药化学成分的提取已有多年，
并产生了理想的效果。微波辅助提取 (microwave-assisted
extraction，MAE)［3-5］，又称微波萃取或微波提取，是微波
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2015 年 9 月
第 37 卷 第 9 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
September 2015
Vol． 37 No． 9