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板栗共生菌根食用菌固体接种剂制备的研究



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FOREST SCIENCE AND TECHNOLOGY  59 









 






板栗共生菌根食用菌固体接种剂制备的研究*
郑来友
(中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091)
摘要:对大红菇(Russula alutacea,菌株编号2014-10)、红绒盖牛肝菌(Xerocomus chrysenteron,菌株编号2014-14)和
美味牛肝菌(Boletus edulis,菌株编号50559)3种板栗共生菌根食用菌袋装固体接种剂的制备进行了研究,分别确定了
二级种培养和固体接种剂培养中最适营养液的种类,培养成功了质量稳定的固体接种剂。通过对上述3个菌种培养好
的固体接种剂在约20℃室温下不同保存期菌丝的取样培养,分别确定了它们的最佳保存期和最长保存期,为固体接种
剂的异地运输及使用提供了依据。
关键词:板栗;菌根食用菌;固体接种剂
图书分类号:S664.2;S646  文献标识号:A  文章编号:1671-4938(2015)12-0059-04
DOI:10.13456/j.cnki.lykt.2015.12.022
*本文来源于2013年中国林科院与浙江省省院合作科技项
目———“浙江省板栗林下优良菌根食用菌筛选及其利用的研究”
(2013SY08))中的部分内容。
作者简介:郑来友(1971-),助理研究员,主要从事林木菌根的研
究与推广。
板栗(Castanea mollissima)是壳斗科栗属植物,
是一种果、材两用树种,其果实是一种经济价值很高
的干果,尤其中国板栗品质优良,涩皮易剥除,被誉为
“东方珍珠”;同时它又是一种典型的外生菌根树种,
林下常有多种菌根真菌子实体出现,其中多种均为优
良的菌根食用菌,例如红菇、牛肝菌等,它们不仅营养
丰富、口味鲜美,而且对树体还具有多方面的有益作
用[1]。菌根食用菌正成为森林除木材之外又一重要
产品和收入来源[5]。例如红菇富含甾醇、脂肪酸和游
离氨基酸,其粗蛋白含量占干物重的26.72%,可与豆
类籽实媲美[2],干物总氨基酸含量为14.79%,个别种
更高,氨基酸中必需氨基酸占48.9%,各种必需氨基
酸分别占总量的百分比值超过联合国粮农组织推荐
值 ,而且红菇有补血、治疗痢疾、抗诱变及抑制癌症的
药用及保健价值,可食并可提炼珍贵药物[3]。所以将
板栗种植与食用菌根菌栽培结合起来,发展板栗林下
优良食用菌根菌将是一条双赢的措施,既能促进树体
生长发育、延长盛果期、改良土壤提高土壤可持续性
生产力,又能较稳定地采收珍贵的菌根食用菌,拓展
林农的经济收入来源。目前国际上以生产菌根食用
菌子实体为目的的松属菌根合成技术已取得了一定
的进展[6]。而在壳斗科植物板栗上研究的很少,尤其
是目前我国一些地区板栗发展近年来已趋于饱和,目
前除需要进行逐步的树体更新之外,尤其需要引入新
的经济增长点,即向营建新型生态经济林———菌根食
用菌经济林方向发展[4]。但要实现上述目标,首要条
件是要有合格的菌根食用菌接种剂。菌根食用菌接
种剂与腐生型食用菌相比,具有生长速度慢、易污染、
对营养液要求严格等特点。
本文进行了板栗优良菌根食用菌袋装固体接种
剂的制备研究,已培养出能够直接用于板栗苗接种使
用的制剂,为培育板栗菌根食用菌苗木做准备。袋装
固体接种剂相比于液体接种剂来说,虽然培养时间要
长一些,但却具有保存期相对较长、使用方便、接种方
法多样、效果好、易于运输等优点,对于较大规模的异
地使用具有明显优势。
1 材料和方法
1.1 供试菌根食用菌种类及来源
本文供试食用菌根菌共3种:大红菇(Russula
alutacea),菌株编号:2014-10,由中国林科院菌根研
究开发中心于板栗林中采集分离;红绒盖牛肝菌(Xe-
rocomus chrysenteron),菌株编号:2014-14,由中国
林科院菌根研究开发中心于板栗林中采集分离;美味
牛肝菌(Boletus edulis)菌株编号:50559,由中国农业
菌种保藏中心提供。以上菌种均为试管一级母种,培
养基为PDA。
1.2 二级菌种的培养
采用直径9cm的玻璃培养皿,分别采用2种琼脂
培养基,分别为改良 M培养基和PDAM培养基,以上
2种培养基是菌根真菌培养中最常使用到的[1]。将试
管母种菌丝接种于培养基中间,25℃培养箱中培养
7d后,取其直径6mm的边缘菌丝圆片,再分别进行
继代培养,每个菌种每种培养基分别做10皿,每隔3d
观测1次,记录菌丝颜色、菌丝块生长变化。
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1.3 袋装固体接种剂制备
(1)选用圆直径12cm、高30cm的聚丙烯塑料
袋,加入1 500cm3 的蛭石,蛭石粒径约2~5mm,其
中混有300cm3 的细草炭土,此基质配方为中国林科
院菌根研发中心生产菌根制剂的常用配方[1]。加入
750mL营养液,营养液种类分2种,分别为改良 M营
养液和PDAM 营养液[1]。各做10袋,用棉花塞封口
后于高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌1h,自然凉至室
温后待用。
(2)选用合格的二级菌种,在超净工作台上,将直
径10mm的菌丝片移入上述塑料袋中的基质表面,每
袋放8片。每个菌种每种营养液各做10袋。置于
25℃培养箱中培养。每2周观测1次,记录菌丝生长
状况。
1.4 袋装固体接种剂活性测定
利用上述试验中选出的最适营养液进行固体接
种剂的培养,待菌丝长满整个菌袋后,基质内部硬实
充满菌丝后,原包装不变,保存于约20℃的室温中,
分别于保存后30d开始取样,以后每10d取样1次,
直至第90d为止,在无菌操作的条件下,取菌袋中的
约绿豆粒大小的接种剂,分别置于其最适平板培养基
上,于25℃培养箱中培养,观察菌丝是否生长,并记
录菌落生长的皿数、菌落直径、污染的皿数及菌落无
生长的皿数,从而判断经过一段时间的保存后接种剂
菌丝的活性,为将来制剂的运输和使用提供依据。
2 结果和分析
2.1 二级菌种制备中培养基种类的选择
选择了中国林科院菌根研发中心进行二级菌种
制备时最常用的改良 M 培养基和PDAM 培养基,通
过菌丝生长状况的对比,从而确定在板栗共生菌根食
用菌二级种培养中所用培养基种类。经过1次培养
和1次继代培养后,培养结果表明(见表1):第1次培
养7d后,大红菇(2014-10)在PDAM培养基上的生
长速度和菌丝外观质量要优于改良 M培养基,经过继
代培养7d后,仍表现出上述差别,即PDAM 培养基
上的菌丝生长更快,继代培养7d时菌落平均直径可
达到6.6cm(而改良 M 培养基上菌落直径仅为5.8
cm),菌丝颜色更白,更浓密,生长势更好。可以确定
PDAM培养基更适合大红菇二级种的培养。
表1 各菌种二级种培养比较
菌种编号
2014-10
(菌落平均直径/cm)
2014-14
(菌落平均直径/cm)
50559
(菌落平均直径/cm)
培养基种类 改良 M  PDAM 改良 M  PDAM 改良 M  PDAM
第4天 2.8  3.1  5.4  5.5  3.5  3.8
第7天 5.2  6.0 长满 长满 6.7  7.0
继代第4天 3.0  3.5  6.0  6.5  3.5  3.8
继代第7天 5.8  6.6 长满 长满 6.2  6.8
菌丝颜色
较白,较浓
菌丝颜色更白
更浓密,生长
势更好
菌丝浓密,
粗长,白色
长势好
菌丝浓密,
粗长,白色,
长势好
菌丝颜色
灰白,菌丝

菌丝颜色
更白,生
长势更好
  而红绒盖牛肝菌(2014-14)在两种培养基上的
生长状况基本一致,差别很小,继代培养7d时即可长
满整个培养基表面,菌丝浓密,粗长,并泛有淡淡的粉
红色。所以这两种培养基均可作为红绒盖牛肝菌二
级种培养基。
美味牛肝菌(50559)在第1次培养和继代培养
后,菌丝在PDAM 培养基上的生长速度优于改良 M
培养基,继代培养7d时,PDAM 培养基上的菌落直
径平均为6.0cm(而改良 M 培养基上的菌落直径平
均为5.1cm),菌丝颜色更白,菌丝短、密,生长势更
好。因此PDAM培养基更适合做美味牛肝菌二级种
的培养。
2.2 袋装固体接种剂制备
各菌种在菌袋固体基质中培养,通过观察记录菌
丝长势区别发现(见表2),大红菇(2014-10)在
PDAM营养液菌袋中长势明显好于改良 M 培养液,
菌丝约4周长满菌袋固体基质表面,约8周长满整个
菌袋,菌袋硬实,固体基质中充满白色菌丝体。而改
良 M培养液的菌袋,菌丝生长速度要慢,培养8周时
菌丝体长到整个菌袋体积的4/5,固体基质内部也不
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硬实,说明基质内部菌丝体并未充满。结果表明,与
改良 M营养液相比,PDAM 营养液更适合于大红菇
固体接种剂的培养。
红绒盖牛肝菌(2014-14)在PDAM 营养液菌袋
中和在改良 M 营养液菌袋中生长均很好,生长速度
快,约6周时即可长满整个菌袋,而且固体基质内部
硬实,充满了菌丝体。结果说明这2种营养液均适合
红绒盖牛肝菌固体接种剂的培养。同时说明红绒盖
牛肝菌对营养液中成分的要求并不是特别严格,尤其
对于矿物质种类的多寡耐受力较强。
美味牛肝菌(50559)在PDAM营养液菌袋基质中
生长正常,约6周菌丝可长满固体基质表面,约12周
时菌丝长满整个菌袋,固体基质内部硬实,充满菌丝
体,菌丝白色。而在改良 M 营养液菌袋基质中,菌丝
基本没有生长。原因可能是改良 M 营养液中矿物质
种类过于丰富,而美味牛肝菌可能对矿物质的耐受力
较差,但还需另设试验以验证。
表2 各菌种在不同营养液固体基质中生长情况
菌种编号
营养液种类
2014-10
改良 M  PDAM
2014-14
改良 M  PDAM
50559
改良 M  PDAM
菌丝生长状况 约10周长满基质
表面,但内部并不
硬实。
约4周长满基质
表面,约8周长满
整个菌袋,内部硬
实,充满菌丝。
约4周长满 基质
表面,约6周长满
整个菌袋,内部硬
实,充满菌丝。
约4周长满基质
表面,约6周长满
整个菌袋,内部硬
实,充满菌丝。
基本不生长。 约6周长满基质
表面,约12周长
满整个菌袋,内部
硬实,充满菌丝。
2.3  固体接种剂活性测定
经过取样培养,结果表明(见表3),大红菇(2014
-10)固体接种剂中的菌丝体在约20℃温度下保存
60d后,菌丝体仍可生长,但较30d时生长速度明显
下降,保存80d后,菌丝基本无生长活性;红绒盖牛肝
菌(2014-14)在保存70d后,菌丝仍具有生长活性,
但菌丝生长速度变慢,保存90d时,菌丝基本无生长;
美味牛肝菌(50559)在保存60d后菌丝生长活性明显
下降,生长速度缓慢,保存80d时菌丝基本没有了生
长活性。
根据上述结果分析,为保证袋装固体接种剂菌丝
的生长活性,满足其与板栗的菌根合成要求,大红菇
最佳保存期应不超过50d,最长保存期不超过70d;
红绒盖牛肝菌最佳保存期应不超过70d,最长保存期
不超过80d;美味牛肝菌最佳保存期应不超过50d,
最长保存期不超过70d。
表3 固体接种剂不同保存期菌丝活性
菌株编号 天数 菌落生长的皿数/个 1周后菌落直径平均/cm 污染的皿数/个 菌落不生长的皿数/个
2014-10  30  9  5.2  1  0
40  9  5.0  1  0
50  7  4.1  2  1
60  5  3.0  2  3
70  3  2.8  2  5
80  0  0  1  9
90  0  0  1  9
2014-14  30  10  5.5  0  0
40  9  5.4  1  0
50  8  5.2  0  2
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(续表3)
菌株编号 天数 菌落生长的皿数/个 1周后菌落直径平均/cm 污染的皿数/个 菌落不生长的皿数/个
60  8  4.1  0  2
70  6  3.7  2  2
80  2  3.0  3  5
90  0  0  0  10
50559  30  9  5.0  1  0
40  8  5.0  2  0
50  6  4.4  2  2
60  4  3.5  2  4
70  2  3.0  4  4
80  0  0  1  9
90  0  0  0  10
3 结论
(1)本文通过对板栗3种共生菌根食用菌的培养
研究,分别确定了它们在二级种培养和袋装固体接种
剂培养时较适合的营养液种类。在3种菌根食用菌
固体接种剂制备过程中,二级种培养和固体接种剂培
养所用营养液种类基本一致,即大红菇(2014-10)二
级种培养用 PDAM 较适合,其固体培养时也是
PDAM较适合;红绒盖牛肝菌(2014-14)则为改良 M
和PDAM2种均适合其菌丝生长;美味牛肝菌(50559)
则为PDAM较适合其菌丝生长。改良 M 和PDAM
营养液配方是中国林科院菌根研发中心在菌根菌培
养中最常用的2种营养液,虽然适用于本文3种菌根
食用菌的培养,但其配方成分应该还有进一步优化的
余地,在下一步研究中还将继续探讨。
(2)通过对培养好的固体接种剂在约20℃室温
下不同保存时间菌丝的培养测定,确定了上述3种板
栗菌根食用菌最佳保存期和最长保存期,其中大红菇
(2014-10)最佳保存期为不超过50d,最长可保存
70d;红绒盖牛肝菌(2014-14)最佳保存期为不超过
70d,最长可保存80d;美味牛肝菌(50559)最佳保存
期为不超过50d,最长可保存70d。在实际应用中,
随着保存和使用环境温度的上升,其活性维持期还会
相应的缩短。因此在实际育苗接种中,在条件允许的
情况下应该尽量缩短接种剂保存的时间,最好不超过
30d,否则会直接影响菌根合成效果。
(3)以上3种菌根食用菌在理论上均是板栗的共
生菌根菌,且大红菇和红绒盖牛肝菌菌种就采集分离
自板栗林下,但经过固体培养后,其菌丝体与板栗苗
的菌根合成效果如何,将另设育苗试验,其结果也将
另文报道。
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