全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 November 2011, 30(6): 938-943

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2011 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.





基金项目：中国科学院知识创新工程重要方向项目（No. KSCX2-YW-G-068）；国家自然科学基金青年科学基金（No. 31000010）
*Corresponding author. E-mail: zhqm@im.ac.cn, weijc2004@126.com
收稿日期: 2011-05-31, 接受日期: 2011-06-13

石耳属 ITS 条形码物种的快速鉴定
郑方圆 1,2 曹叔楠 2 张涛 2 刘川鹏 1 周启明 2* 魏江春 2*
1哈尔滨工业大学理学院生命科学与工程系 哈尔滨 150001
2中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室 北京 100101



摘 要：生物 DNA 条码是利用一个短的 DNA 标记进行生物的快速鉴定。以真菌界的石耳目、石耳科中的石耳属地衣的部
分种类为材料，应用地衣共生菌的 rDNA-ITS 序列，对 29 种石耳属地衣进行鉴定，并初步探究其中部分种类特异的微型条
码，为石耳属地衣的快速鉴定提供依据。
关键词：地衣，地衣型真菌，微型条码，物种鉴定树，ITS

A rapid identification for Umbilicaria species using rDNA-ITS as
barcodes
ZHENG Fang-Yuan1, 2 CAO Shu-Nan2 ZHANG Tao2 LIU Chuan-Peng1 ZHOU Qi-Ming2*
WEI Jiang-Chun2*
1Department of Life Science and Engineering, School of Science, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China
2Key Laboratory of Systematic Mycology and Lichenology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: DNA barcode is a technique to identify species using short sequence of DNA. This paper deals with rDNA-ITS as a
barcode and microbarcode to identify the species of Umbilicaria. Our study would be a foundation for the aid of Umbilicaria rapid
identification.
Key words: lichen, lichenized fungi, microcoding, species identification tree, ITS

自从林奈的《植物种志》于 1753 年 5 月 1 日
问世以来，人类辨认生物种系的系统分类学研究已
经进行了整整 258 年。在 DNA 聚合酶链式反应
（PCR）技术发明之前的 237 年，生物种系的系统
DOI:10.13346/j.mycosystema.2011.06.019
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分类学主要是以表型性状为基础的。以真核生物域
中的真菌界为例，据专家的保守估计，不包括植物
内生真菌，自然界存在的真菌物种总数不少于 150
万，而已命名的仅占其中的 10%（Hawksworth
1991）。对于这 10%的已定名物种进行快速鉴定是
工农业生产及检疫工作所急需的技术。
自从 DNA 聚合酶链式反应（PCR）技术（Mullis
et al. 1986；Mullis 1987，1990）问世以来，该技术
已在医学和生命科学的各个领域得到了广泛的应
用，促进了生物分子系统学的飞速发展，也为生物
物种的快速鉴定提供了有力手段。其中利用非编码
高变区的 rDNA-ITS （ Ribosomal DNA Internal
Transcribed Spacer）区序列（ITS1-5.8S-ITS2）（White
et al. 1990）为属内、种间以及种内不同居群之间的
系统发育分析和物种的快速鉴定提供了新的手段。
该方法在地衣型与非地衣型真菌的物种鉴定中也
得到了广泛应用。以分类鉴定的分子阶元
（molecular criteria）为基础的分子检索系统概念
应运而生（屈良鹄和陈月琴 1999）。在动物分类
鉴定中，利用细胞色素 C 氧化酶（mitochondrial
cytochrome C oxidase I，COI）基因作为 DNA 条码，
对动物物种进行快速鉴定曾被提出（Hebert et al.
2003a，b）。此外，COI 也被试用于青霉菌 Penicilium
的分类鉴定中（Seifert et al. 2007）。不过，在地衣
型与非地衣型真菌的系统发育和分类鉴定中更常
使用的却是 rDNA-ITS 区的碱基序列。
DNA 条码是利用一种生物的 DNA 中的一个短
的基因标记以鉴定该种生物。它不同于分子系统发
育学之处在于其主要目标不是为了确定生物的分
类，而是为了借助于已知的分类系统对于未知的生
物样品进行鉴定。
在美国冷泉港召开的分类学与脱氧核糖核酸
（DNA）学术研讨会提出了对全球所有动物物种
COI 基因进行大规模的测序计划，以建立生命 DNA
条码数据库（Barcode of Life Data Systems，BOLD），
为全球的动物物种鉴定提供服务。
本研究旨在以 rDNA-ITS 序列作为 DNA 条码
对部分石耳属地衣种类进行快速鉴定，并以其中的
寡核苷酸序列作为微型条码，为后续物种快速鉴定
芯片等研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究以中国科学院菌物标本馆地衣标本室
（HMAS-L）保存的石耳属地衣种类为实验材料，
其中采自吉林吉安的美味石耳 Umbilicaria esculenta
(Miyoshi) Minks 供试标本 9 份；采自吉林汪清及通
化的放射盘石耳 Umbilicaria muehlenbergii (Ach.)
Tuck.供试标本 3 份（表 1）。同时该属其他种类的
ITS 数据来自 GenBank（表 2）。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取、PCR及测序：采用CTAB法（Cubero
et al. 1999）提取石耳属地衣的总 DNA，并用真菌
DNA 提取试剂盒对提取产物纯化。所得产物稀释
表 1 用于扩增 ITS 序列的石耳及其产地
Table 1 The localities of specimens of Umbilicaria spp. used for this
study
物种
Species
采集地
Location
标本名称
Specimen
number
ITS 序列 GenBank
序列号
GenBank accession
numbers nuITS
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin J5 JF796682
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin J9 JF796683
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin J10 JF796684
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin J12 JF796685
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin J14 JF796686
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin J16 JF796687
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin u19 JF796690
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin u20 JF796691
U. esculenta 吉林吉安 Ji’an, Jilin u27 JF796692
U. muehlenbergii
吉林通化
Tonghua, Jilin
TH14 JF796688
U. muehlenbergii
吉林汪清
Wangqing, Jilin
TH19 JF796689
U. muehlenbergii
吉林汪清
Wangqing, Jilin
W14 JF796694
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表 2 来自 GenBank 的 ITS 数据
Table 2 The ITS sequences used for this study obtained from GenBank
物种
Species
GenBank 序列号 nuITS
GenBank accession numbers nuITS
U. africana HM161482
U. antarctica AF096213, AJ431595, AJ431601,
AJ431603-AJ431605, AY603123,
AY603125-AY603128, FN185922-FN185929,
FN185932
U. arctica HM161454
U. americana AF096218
U. calvescens HM161459, HM161484, HM161485
U. caroliniana EU909464, EU909475
U. cinereorufescens HM161503, HM161511
U. decussata HM161510, AY603122
U. dendrophora HM161504, HM161505, HM161509
U. esculenta DQ394397, EU534208
U. flocculosa AF297670
U. grisea HM161491
U. haplocarpa HM161467-HM161469, HM161471,
HM161476, HM161474,HM161477
U. hirsuta EU266088, HM161494, HM161495
U. hyperborea AF096216
U. kappenii AY603129, AY603131, AY603132
U. karascheninnikovii AY603134
U. leiocarpa AF096211
U. loboperipherica AF297671
U. mammulata AF284448, DQ782851
U. muehlenbergii AF096204, AF297667, FJ854363, FJ854364
U. nylanderiana AY603133, HM161488, HM161489
U. polyphylla FN185976-FN185979
U. rigida AF096212, HM161455
U. virginis AF297673
U. ruebeliana AF096219
U. spodochroa AF096207
U. torrefacta DQ660906
U. umbilicarioides AF096210, AY603121
50 倍用于后续 PCR 操作。真菌 ITS rDNA 由通用引
物 ITS5 （ 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-
3′ ）、 ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ ）
（White et al. 1990）扩增。引物由上海 Sangon 公
司生工合成。普通 Taq DNA 酶、dNTP 混合物等均
购自 TaKaRa 公司；真菌 DNA 提取试剂盒购自
Omega 公司。PCR 反应条件：95℃预变性 5min；
95℃变性 30s，52℃退火 30s，72℃延伸 2min，反
应 32 个循环；72℃延伸 10min，4℃保存。反应结
束后，PCR 产物通过 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验，
ABI3730DNA 分析仪测序。测序结果由 Seqman
（Lagergene）软件分析及手动编辑。
1.2.2 序列比对、物种鉴定树建立及遗传距离分析：
所获测序结果序列包含小亚基部分结尾序列、
ITS1-5.8S-ITS2、大亚基部分起始序列，去除大小
亚基部分序列后所得片段大小约 500bp。为建立物
种鉴定树，下载 GenBank 数据库中 77 条 ITS 序列，
共 29 个种，序列号见表 2。利用 DNAMAN（Lynnon
Biosoft）软件将测序结果同 GenBank 下载数据进行
比对分析，如果序列长度不同，则只保留共有区段。
使用 Mega 5.0 软件（Tamura et al. 2011）中 ML 法
及 Bootstrap 分析，建立分类单元鉴定树（Taxon
Identification Tree）。应用 Species identifier（Meier et
al. 2006）比较种内及种间的遗传距离差异，并用
SigmaPlot 分析（Systat Software, Inc., CA）。
2 结果
2.1 总 DNA 质量及 PCR 检测
应用上述 CTAB 方法提取出地衣总 DNA 并用
试剂盒纯化。经真菌 ITS序列特异引物 ITS5 和 ITS4
特异扩增后凝胶检测，即可见到长度在 750bp 左右
的明亮片段。如片段长度大于 750bp，则可能为核
糖体小亚基有 I 型内含子插入。
2.2 聚类分析树的建立
测序结果手动编辑，去除大小亚基部分序列后
即可获得 ITS 完整序列，包括 ITS1、5.8S、ITS2，
长度约 500bp，如 U. esculenta 的 ITS 序列总长度为
494bp。序列比对之后，利用 Mega5.0 软件建立物
种鉴定树（ML Tree）。由于 5.8S 的遗传保守性较高，
在建树的过程中将其删除，以获得差异明显的聚类
效果。ITS 序列可以将研究所用石耳属 29 个种较好
地区分开。然而由于属于有性型和无性型而被处理
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为 种 对 的 U. antarctica 和 U. kappenii 、 U.
krascheninnikovii 和 U. decussata、U. hirsuta 和 U.
grisea 以及 U. rigida 和 U. leiocarpa 在分类树中两
两聚在一起；由于地理隔离而形成地理替代种的
U. esculenta 和 U. mammulata 也显示较近的亲缘关
系（图 1）。
2.3 种内与种间差异度分析
应 用 Taxon DNA/Species identifier 软 件
Pairwise Summary 功能对所获得的各物种 ITS 序列
进行分析。参考系统树结果，将种对按同一物种处
理。根据统计所得的种内及种间差距绘制图 2。种
内差异（intraspecific distance）主要集中在 0－2.0%
间，而种间差距（interspecific distance）则在 3%－
13%之间，种间距离显著大于种内距离。证明 ITS
序列在区分石耳属地衣过程中，在石耳属内各物种
种间的差异度较高，而在种内的差异度较小，是合
适的 DNA 条形码区段。其中仅有≤0%的差异序列
就占所测物种总数的 52.55%。
2.4 ITS 微型条码分析
经序列比对后即可见 ITS1 和 ITS2 区域有明显
的碱基差异，而 5.8S 区具有高度的保守性，仅 210
和 275 位出现单碱基差异。据此，可在 ITS1 和 ITS2
的 高 变 区 寻 找 适 合 有 关 物 种 的 微 型 条 码
（Summerbell et al. 2005；Diaz et al. 2006）。
每一物种在 ITS1 区域都有高度的变异，以 U.
dendrophora、U. polyphylla 及 U. umbilicarioides 为
例（图 3）。以上 3 种在物种聚类树中得以很好地
区分，进而在 ITS 序列内部查找物种各自的特有片
段。其中，124 位 CCC、139T、143TGC 是 U.
polyphylla 同另两种区分的特异碱基组合。同时，
差异最显著的 143－145 三碱基将 3 个种特异性区
分开来。
在 ITS2 区同样存在能较好区分物种的微型条
码。以 U. esculenta、U. muehlenbergii、U. mammulata
为例，ITS2 区 360 位，“TTTC”四碱基成为 U.
esculenta 和 U. mammulata 区别于 U. muehlenbergii

图 1 石耳属 29 种地衣的 ITS 序列的物种聚类分析树
Fig. 1 The tree of cluster analysis based on ITS sequences of 29 Umbilicaria species.
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“C…”的特征基序；364A 和 388T 为 U. esculenta
的 特 有 碱 基 ； 377A 、 381A 和 384G 为 U.
muehlenbergii 特征碱基；364G 为 U. mammulata 特
征碱基，此位点在 3 个物种中均存在差异（图 4）。

图 2 石耳属地衣种内种间差异度 横坐标为物种差异距离，纵
坐标为处于同一差异度区段内的物种比例；黑色条带为种内差距，灰色
条带为种间差距.
Fig. 2 Intraspecific and interspecific distances in Umbilicaria species.
The abscissa refers to specific distances, and the vertical axis refers to
the percentage of species in the same specific degree; the black bands
mean the intraspecific distances, and the grey bands mean the
interspecific distances.

图 3 Umbilicaria dendrophora、U. polyphylla 及 U.
umbilicarioides部分序列比对结果及ITS1微型条码 种内
特异碱基用方框标出，左侧所示为种名及 GenBank 序列号，每个种仅
显示 3 个个体.
Fig. 3 Partial sequence alignment and microbarcode in ITS1 region in
species of Umbilicaria dendrophora, U. polyphylla and U.
umbilicarioides. Bases surrounded with boxes are specific bases among
each species. The species names and corresponding GenBank accession
number are indicated on the left. Only three individuals was showed
above in each species.

图 4 Umbilicaria esculenta 、 U. mammulata 及 U.
muehlenbergii 部分序列比对及 ITS2 微型条码 方框标记为
各物种差异位点. 种名及 GenBank 登录号在每条序列的左侧列出. 每个
物种仅显示 2 个个体.
Fig. 4 Partial sequence alignment and microbarcode in ITS2 region in
species of Umbilicaria esculenta, Umbilicaria mammulata and
Umbilicaria muehlenbergii. Bases surrounded with boxes are specific
bases among each species. The species names and corresponding
GenBank accession number are indicated on the left. Only two
individuals were showed above in each species.
同时，在对下列物种进行序列比对时，发现其
序列具有高度的相似性，其自举值均在 99%以上。
其中 U. antarctica 和 U. kappenii 在 ITS1 区仅有 2
个位点的差异；而 U. rigida 和 U. leiocarpa 全序列
也仅有 2 个差异位点；U. krascheninnikovii 和 U.
decussata 全序列则含有 9 个差异位点。
3 讨论
上述石耳属29种地衣的 rDNA-ITS序列的物种
聚类分析结果（图 1）表明，用于本研究的 29 种石
耳属地衣基本被分别聚在不同的单系类群中，只是
其中的 10 个种，即 Umbilicaria rigida 和 U.
leiocarpa；U. antarctica 和 U. kappenii；U. decussate
和 U. krascheninnikovii；U. hirsuta 和 U. grisea；以
及 U. esculenta 和 U. mammulata 则被分别两两聚在
不同的 5 个单系类群中（图 1）。而对其中 6 个种进
行的微型条码分析结果表明，该方法对于物种之间
的差异比较敏感。
至于分别被聚在不同的 5 个单系中的 10 种石
耳，其中的 U. esculenta 和 U. mammulata 基于相似
的表型性状及其截然不同的地理分布区被认为是
东亚和北美的地理替代种。该两种在聚类分析中被
聚在同一个单系类群中，而在微型条码分析中，却
发现了它们之间的差异（图 4）。这一结果表明，通
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过 rDNA-ITS 聚类分析及其微型条码分析，以及与
包括地理分布在内的表型性状相结合的综合分析，
是研究地理替代种的发生及其时空演化的有效手
段之一。4 对种对中的 8 种石耳地衣两两分别聚在
不同的 4 个单系类群，虽然使用 ITS 序列对于种对
间可以很好地区分，但却无法将种对内部的两种地
衣完全分开。由于现在普遍认为就地衣型真菌而
言，同一种对内的两个物种只是相同物种的有性型
和无性型，因此根据 Buschbom & Mueller（2006）
对种对的观点，在本研究中也将种对内物种按同一
个种处理。但对于如何将种对内两个物种处理成同
一个物种，还需要进一步的详细分析研究以及分类
学上综合处理。
本研究的结果表明，以 rDNA-ITS 作为条码及
其微型条码对于石耳属的物种快速鉴定以及对其
地理替代种的分辨都是可行的。
[REFERENCES]
Buschbom J, Mueller GM, 2006. Testing “Species Pair” hypotheses:
evolutionary processes in the lichen-forming species complex
Porpidia flavocoerulescens and Porpidia melinodes. Molecular
Biology and Evolution, 23: 574-586
Cubero OF, Crespo A, Fatehi J, Bridge PD, 1999. DNA extraction and
PCR amplification method suitable for fresh, herbarium-stored,
lichenized and other fungi. Plant Systematics and Evolution, 216:
243-249
Diaz MR, Boekhout T, Theelen B, Bovers M, Cabañes FJ, Fell FJ,
2006. Microcoding and flow cytometry as a high-throughput
fungal identification system for Malassezia species. Journal of
Medical Microbiology, 55: 1197-1209
Hawksworth DL, 1991. The fungi dimention of biodiversity:
magnitude, significance, and conservation. Mycological Research,
95: 641-655
Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR, 2003a. Biological
identifications through DNA bareodes. Proceedings of the Royal
Society of London, Series B, 270: 313-322
Hebert PD, Ratnasingham S, deWaard JR, 2003b. Barcoding animal
life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely
related species. Proceedings of the Royal Society of London,
Series B, 207: S96-S99
Meier R, Kwong S, Vaidya G, Ng KL, Peter KL, 2006. DNA barcoding
and taxonomy in Diptera: a tale of high intraspecific variability
and low identification success. Systematic Biology, 55: 715-728
Mullis K, 1987. Process for amplifying nucleic acid sequences. US
Patent. 4, 202, 683
Mullis K, 1990. The unusual origin of the polymerase chain reaction.
Scientific American, 262: 56
Mullis K, Falcoona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H, 1986.
Specific amplification of DNA in vitro: the polymerase chain
reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology,
51: 260
Qu LH, Chen YQ, 1999. Key to molecular taxonomy-principles and
methods. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,
38(1): 1-6 (in Chinese)
Seifert KA, Samson RA, deWaard JR, Houbraken J, Lévesque CA,
Moncalvo JM, Louis-Seize G, Hebert PD, 2007. Prospects for
fungus identification using CO1 DNA barcodes, with Penicillium
as a test case. Proceedings of the National Academy of Sciences,
104(10): 3901-3906
Summerbell RC, Levesque CA, Seifert KA, Bovers M, Fell JW, Diaz
MR, Boekhout T, de Hoog GS, Stalpers J, Crous PW, 2005.
Microcoding: the second step in DNA barcoding. Philosophical
Transactions of the Royal Society of London, Series B, 360:
1897-1903
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S, 2011.
MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using
maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum
parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 28(10):
2731-2739
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J, 1990. Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In:
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds.) PCR
protocols: a guide to methods and applications. Academic Press,
San Diego. 315-322
[附中文参考文献]
屈良鹄，陈月琴，1999. 生物分子分类检索表——原理与方法. 中山大
学学报（自然科学版）分子进化与系统学专辑，38(1): 1-6