全 文 ：徽 生 钱 学 报 27 ( 4 ): 3, 0一 3 5 6 , 1 9 8 7
盛时 . 几打` or 配讨。砂“ 习时“
海枣曲霉地衣多糖酶和木聚糖酶的底物特异性
曾宇成 张树政
(中国科学院微生物研究听 , 北京 )
海枣曲霉木聚塘酶 x 一 I 、 x 一 1 和 x 一 m 作用于不同底物时 , x 一 I 对地衣多塘的水解活性
最强 ,对麦鼓半纤维素 H和 B 也有一定的水解活性 , 因而该酶为具有木聚塘酶活性的地衣多塘
酶 ( L王c h e n a , e , 1 , 3 一 1 , 。一月一 D 一 G lu e a n 4 一 g lu cn o h , d r o las e , CE 3 . 2 . 1 . 7 3 ) 。 X 一 1 对燕麦木聚
糖 、麦扶半纤维素 B 和 H均有很高的水解活性 , 对其他木聚糖及地衣多糖的水解活性也较高 ,
因而为具有地衣多塘酶活性的木聚糖酶 。 x 一 1 对落叶松木聚塘的水解活性最高 , 对其他木
聚塘也有较高的水解活性 ,但不能水解地衣多搪等 价葡聚塘 ,故为一种专一的木聚糖酶 。 x 一 I
水解麦献半纤维素 B 、 x 一 u 水解燕麦木聚搪及 X 一川 水解落叶松木聚塘的 K m 值分别为 9 . , 、
2
·
1和 1· s m g / ml 。 酶水解产物的纸层析分析结果表明 , x 一 l 水解不同木聚塘后的产物主 要
为分子量较大的寡聚木塘 , 未发现木二塘 、木塘及阿拉伯糖 。 x 一 1 的水解产物主要为木二塘
及木二糖以上的寡塘 ,并有少量木糖和阿拉伯塘 ,且阿拉伯塘远多于木糖 。 x 一 1 的水解产物
中以木二塘为最多 ,也有较多的木二搪以上的寡聚木塘 ,木糖和阿拉伯塘的量较少 , 且阿拉伯
塘远少于木塘 .
关健诃 海枣曲霉 ; 地衣多塘酶 ;木聚塘酶 ;底物特异性
前文报道了海枣曲霉木聚糖酶的提纯
及性质山 , 本文进一步报道该酶的底物特
异性 、 动力学参数及水解产物的类型等。
材 料 和 方 法
(一 ) 蔺的制备与提纯
(三 ) 木获抽阵活力及蛋白质浓度的侧 定均
同前文` : , O
(四 ) 纸层析
采用 w h a t m a n 1. 滤纸 ,展开剂为正丁醉 : 毗
咤 : 水 ( 6 : 斗: 3 ) ,上行法展开 2 次后 ,以苯胺一二苯
胺或苯胺一邻苯二甲酸试剂显色 。
按前文方法 , 用海枣曲霉 A s . .3 3 1 , 3 作为木
味搪酶 x 一 l 、 x 一 u 和 x 一 1 的产生菌 ,制备粗酶 ,
并将其提纯到凝胶电泳均一“ 1。
(二 ) 主要化学试剂
落叶松木聚塘 、 燕麦木聚塘和各种对 一硝基苯
基一。 或卜糖葺 ( p N p 一。 一 g a l , p N p一月一 g a l , p N p -
。 一 g le , p N p 一夕一 g le , p N p 一月一 m an , p N p 一尹一 x , l ) , 均
为 is g m : 公司产品 。 稻草木聚塘为我所方一澄
伺志制备 。 矮甲基纤维素钠 ( C M C ) 为中国长红
塑料厂产品 。 月一 1 , 2一葡聚塘 、 昆布多搪 (户一 1 , 3 -
葡聚糖 ) 、 地衣多塘 (尹一 1 , 3一 1 , 任一葡聚糖 )及石脐
素 (月一 1 , 6 一葡聚糖 ) 、 均为 M ile 。 公司何方先生
所赠 。
结 果 和 讨 论
(一 ) 底物的制备
1
. 稻草半纤维素的制备 : 基本上按福
本寿一郎等的方法切 。 将稻草 3 0 09 切成小
段 ,加水煮沸 , 自来水漂洗过夜后 , 再用次
氯酸钠 ( p H 6 . 0 ) 浸泡及 自来水漂 洗 , 以
除去木质素 、 淀粉和蛋 白质等成份。 然后 ,
挤去水份 ,按 A da m s 方法 3t] , 加 Z L 抽过
气的 1 0多 N a o H , 于 2 4℃ 浸泡 2 4 小时 ,
本文于 1 9 86 年 6 月 1 4 日收到 。
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1987. 04. 014
曾宇成等 : 海枣曲霉地衣多塘酶和木聚塘酶的底物特异性
图 l各种半纤维素的酸水解产物的纸层析图谱
日 9. 1 Pa p e e rh r om a ` og ra m o f H c l
hy d rO ly s a ts e
l, z , 3
· 麦袱 H A ,
o f v a r io u s h e m ic e ll u lo s` s
H B
,
H H w h o a t b r . n H ^
,
H B
,
H H
,
. 稻草 H A , H B R i e , n r ` w
稻草木聚箱 R ic o tS r . w x 萝l a n
5
. 标准糖 妞a r k o r ; D 一 x y l璐。
( G l
e
): L
一 A r a b墓b o , e ( A r a )
H A
,
H A
( x , l ) , D
一 G l u c OS .
过滤后 , 滤渣再用 N a o H 重浸一次。 合
并两次碱抽提的滤液 , 用 H。 调 p H 到
.4乡左右 , 离心取沉淀 , 此即稻草半纤维素
A ( H A )
, 于上清液中加等体积丙酮 , 离心
取沉淀 , 即为稻草半纤维素 (B H B ) 。
2
. 麦数半纤维素的制备 : 麦鼓 2 0 0 9 ,
先以苯一乙醇浸泡以除去脂溶性物质 , 再按
制备稻草半纤维素的方法进行预处理 。 然
后挤千水份 ; 加蒸馏水 4 0 lm , 煮沸 3小
时 , 过滤取滤液 , 向此滤液中加 2 倍体积乙
醉 ,离心 ,并收集沉淀 。 为方便起见 , 我们
将此成份称之为麦鼓半纤 维素 H ( H H ) 。
过撼后的撼渣按制备稻草半纤维素的同样
方法 , 制备得麦狱半纤维素 A (H A ) 及 B
( H B )
o
(二 ) 农物半奸姐素的抽组成分析
将按上述方法制备的 , 种半纤维素及
原先的稻草木聚糖用 2多 H CI 水解 , 再用
N : O H 中和 , 离子交换树脂脱盐后 , 用纸
层析法分析底物的组成 , 结果如图 l 。 除
麦鼓 H H 外 , 其他半纤维素均含有较多木
糖 ,少量阿拉伯糖 ,不同来源的 H B 含阿 拉
伯糖量均高于 H A 。 麦鼓 H B 和 H A 中的
阿拉伯糖含量均相应地高于 稻 草 H B 和
H A
。 麦鼓 H H 是按我们 自己设计的方 法
制备的 , 其特点是除了含有较多木搪和较
少阿拉伯糖外 , 还含有较多葡萄糖 , 该成份
的具体结构还有待进一步研究 。
(三 ) 醉的底物特异性
以各种木聚糖 、 芦一葡聚糖及其他多糖
为底物时 , 按常法测定酶的水解活力。 以
纤维二糖和麦芽糖为底物时 , 按标准条件
反应 , 并用葡萄糖氧化酶法测定产生的葡
·萄糖。 以对一硝基苯基一 a 或户糖昔作底物
时 , 则测定酶水解 l m m ol / L 底物产生的
对 一硝基酚 (测 编。 n m) , 结果如表 l 。 x 一 I对
地衣多糖的水解活力最高 , 对麦鼓 H H 的
水解活力次之 ,对麦鼓 H B 也有一定的 水
解活力 , 对其他木聚糖的作用则很弱 。 因
此 , 该酶实际上是具有木聚糖酶活性的地
衣多糖酶。 X一 IL 对燕麦木聚糖 、 麦鼓 H B
和 H H 均有很高的活力 ,对稻草 H B 、 稻草
木聚糖及地衣多糖的水解活力也较高 , 对
稻草 H A 、 麦献 H A 及落叶松木聚糖的水
解活力则要相对弱些 。 这表明 , x 一 1 为
具有地衣多糖酶活性的木聚糖酶。 X 一 I 和
X
一 1 均对 C M C 有微弱的水解作用 , 但都
不能水解 户 1 , 2 一葡聚糖 、 昆布多糖和石脐
素等 , 因而二者虽有微弱的水解 价 l , 4 一葡
萄搪昔键的活力 , 却完全不 能 水解 价 1 ,
2一 、 口一 1 , 3 一 、 尹一 1 , 6一葡萄搪昔键 。 X 一 111
对落叶松木聚糖的水解活力最高 , 对其他
木聚糖也有较强的水解作用 , 但对麦鼓 来
源的木聚糖 , 特别是对麦鼓 H H 的水解作
微 生 物 学 报 2 7卷
T a b le
衰 l曲的雇物特异性
s u b s t r a t e s P e e汪i e i t i e s o f lie h e n a s e a n d x, l a n a s e -
底 物 相对活力 R e l a t i , e a e t i v i t丫 (% )
S u b s t r a t e X 一 111
燕麦木聚塘
o a r s P e l t s x y l a 。
落叶松木聚塘
L a r c h w o o d x y l a n
麦获 H H
W h
e a t b r a n H H
发鼓 H A
W h
e a t b r a n H A
麦鼓 H B
W h
e a t b r a n H 皿
稻草 H A
R i e e s t r a w H A
稻草 H B
R ie e s t r a w H B
稻草木聚塘
R i e e s r r a w x y l a n
狡 甲基纤维素
C M
一
C e l l u l o s e N a
地衣 多塘
L ie h e n i n
昆布 多塘
L a r m i n a r in
石脐素
P u s t u l a n
声一 1 , 2一葡聚塘
1 0 0
2 9
。
7
88
。
4
2 4
。
8
犷 . 4
2 4
。
9
76
。
l
5 8
。
9
3
。
2
5 7
。
6
0
76
。
6
1 0
2 3
。 `
3 0
。
5
4 ,
。
,
3
。
9
10 0
月一 1 , 2一 G l u ` a n ! ! }
用相对较弱 。 该酶对 C M C 、 地衣多糖及
其他 户葡聚糖均无水解活力 , 因而为一种
专一的木聚糖酶 。
高等植物来源的木聚糖的骨架结构均
为 户 1 , 4一木聚糖 ,但侧链不同 。 禾本科植
物木聚搪的侧链主要为 a 一 1 , 3一键连接的
L一阿拉伯糖 , 而裸子植物 、 硬木等来源的
木聚糖的侧链则多为 a 一 1 , 2一键连接的 4 -
O
一甲基葡萄糖醛酸「月 , 习。 因此 ,本 实验所用
的落叶松木聚糖应为侧链主 要 为 4一 0 一甲
基葡萄糖醛酸的 价 1 , 4 一木聚搪 ,而其他木
聚糖则为侧链为阿拉伯糖的 户 l , 4 一木聚
糖。 从本实验的测定结果看 , 虽然 X 一丁、
x 一 u 和 x 一川 均显示 户 1 , 4一木聚糖酶活
性 , 但 x 一 l 和 x 一 1 对阿拉伯糖侧链较 多
的木聚糖活力较高 , x 一川 则对 4 一 0 一甲基
葡萄糖醛酸侧链较多的木聚糖活力较高。
在已报道的木聚糖酶中 , 有不少都同
时具有纤维素酶活性 , 如黑曲霉 (才, cP r岁 -
11“ , n i g e r )
` 6J 、 奇异长嚎壳菌 ( C o r r o c y , t i;
P a r a d o xa )
〔, , 脱 叶 链 霉 菌 ( s r r e 户t o m 夕c。 ,
。 x fo zi a , u , )
`8 , 等来源的木聚糖酶 。 然 而 ,
x 一 l 和 x 一 u 对 C M c 的水解作用很 微
弱 , 却对地衣多糖和木聚糖均有很高的水
4 期 曾宇成等 : 海枣曲霉地衣多塘酶和木聚糖酶的底物特异性
032251
解活性。 拟笔者所知 , 这一性质还未见报
道过 。 X 一 H l 对 C M C 和地衣多糖 等 口-
葡聚糖均无水解作用 , 因而与短小芽抱杆
菌 ( B a .ic l l u , P。 , 11“ s )『, , 、 盾状芽抱杆 菌
( T
o r , j, o , , y c e , c l帅 。 a t u , ) L` o , 等来源的专一
的木聚糖酶相似 。
除表 1所列底物外 , 本实验还 表 明 ,
X 一 I
、
X 一 H 和 X 一 n l 对可溶性淀粉 、 支链
淀粉 、 右旋糖醉 、 果胶 、 田著胶 、 菊糖 、 蜜二
糖 、 乳糖 、 蔗糖 、 麦芽糖 、 纤维二搪 、 水杨素
及各种对一硝基苯基一 。 或 户糖昔均无水解
作用 。
(四 ) 酶的 K m 值及 V m a 二 值
根据底物特异性的测定结果 , 以燕麦
木聚糖作 X 一 1 的底物 , 落叶松木聚糖作
X 一 H l 的底物 , 由于地衣多糖及麦鼓 H H 的
量太少 ,代之次麦鼓 H B 作 x 一 l 的底物 ,于
50 ℃ 按常法测定上述酶水解相应底物 (最
终浓度 为 0 . 1一 1 0 m g /m l) 的活力 , 并计算
反应速度 ( 严m ol · m i n 一 ` · m g一 ` ) 。 将测定
结果按 w o lf 法作图 (图 2一 4 ) 。 结果求
得 X 一 I 、 X 一 H 和 X 一川 水解各自底物 的
K m值分别为 9 . 9 、 2 . 1和 l . s m g /m l , V m。 : 分
别为 3 3 4 、 2 6 8 和 1 0 3 0群 m o l · m i n 一 ` · n i g 气 `
蛋白。 X 一 11 和 X 一川 的 K m 值与乳 白耙
图 3
F ig
.
3
2 0 4门 6 0 s t ) I「) (1 1 2 0 1 4 0
、 · 了〔 S 〕
x 一 x l 水解燕麦木聚糖的 w 《、 〔, lf l妇
w o o l f P I
。, t f。 ) r t h e h y d r ( ) l y s i s 《 ) f
o a t s P e l t s x y l a 幻 b y X 一 11
v /〔 S 〕
X
一川 水解落 ,1十松木聚钠的 w 。,` , I f 图
4 w o o l f p l
。、 t f o r t h e 手l y d r ` , ly s i s 。 , f
l a r e h w o o d x y l a n b y X
一川
18 2了
v / 〔S〕
图 Z X 一 l 水解麦鼓 手I B 的 w ` , o lf 图
F ig
.
2 w o
o
l f p l o t f o r t h e h y d r o l y s i s o f
w h e a t b r幼 H B b y X 一 I
菌 ( I r P e x l a ct e u s ) 〔川 、 芽抱 杆 L钧 1 1一 1 s L, , ’
木聚糖酶的 K m 值相似 , X 一 I 的 K m 则 , J
环状芽抱杆菌 ( B . c ; , c u l` , n , )〔, ’ l 不} I裂褶 菌
( s
c hi z o Ph , l l u m c o。 , n u n ` ) !川 木米糖酶的
K m 值较接近 。
(五 ) 酶的水解产物
将麦鼓 H A 、 H B 、 H H 、 不改i草 H A 、 H R 、
或稻草 木 聚 糖 等 配 成 5沁 ( W / V ) , 取
o
.
3 m l
, 加 p H S . 0 、 0 . 1 , n o l / L 乙酸 缓 冲 液
0
.
l m l
, 酶液 0 . l m l (其中含蛋 白趾分别为 :
x 一 I 、 5 0那 g , x 一 l一 1 0 一` g , X 一川 5产 g ) , 分
” . 橄 生 物 竿 狱 习
别于 4 0℃ 保温 4 2小时后 , 加热中止反应 ,
以纸层析法分析水解产物。 结果表明 , X 一 I
水解不同半纤维素底物时 , 产物主要为分
子 t 较大的不同链长的寡聚糖 , 没有木糖 、
木二糖及阿拉伯糖。 该酶水解麦鼓 H B 和
HH
、 稻草 H B 及稻草木聚糖时 , 产物中还
有微量葡萄糖及小分子量的寡糖 。 而水解
麦数 H A 和稻草 H A 时 , 则不易检测到这
种葡萄糖及小分子寡糖。 将 X 一 I的水解产
物进行纸层析后 , 以苯胺一二苯胺 试 荆显
色 , 则该酶水解半纤维素所产生的大分子
寡聚糖大都显示寡聚木糖所特 有的 棕黄
色 , 只有少数聚合度不大的寡聚糖点显示
寡聚葡萄糖的蓝灰色。 在水解 麦鼓 H H
时 , 这种寡聚葡萄搪的蓝色点要比水解其
图 ` x 一 n 水解不同半纤维素产物的纸层析圈
igF
.
6 P a p e r c h r 。 , m o t叩 r a m o f 义一 u h了d or l , 盆 e d
甲 吕 r 1O U 吕 h e m i e e il u lo . e -
I一 8 . 同图 5 S a m e a . f ig .
图 , X一 I 水解不同半纤维素产物的纸层析图
igF
.
5 P a p e r e h r o m a t叩 r a m o f x 一 L h丫d r o l了 z e d
v a r io u s h e 口 i e e ll u l o s e s
l , 2 一 3 . 麦欺 H A , H B , H H W h e a t b r a n H A , H B ,
H H
一, , . 稻草 H A , H B R ie e : t r a w H A , H B
6
. 稻草木聚艳 R i e e s t r a w x 了l a n
.7 标准摘 , 自上至下为 D 一木塘 , D 一葡萄精和麦芽摘
M a r k e r : D
一笼 y lo s e , D 一 g l u e o s e a n d m a l t o s e ,
d o w n 钾 a r d
舀 . 标准塘 , 自上至下为 L 一阿拉伯箱和纤维二搪
M
a r k e r : L一 a r a b坛 o . e a n d c . l o b i o o e , d . , w n w a r d
X 一 111
P a P e r
水解不同半纤维素产物的纸层析图
e h r o口 a t o g r a m o f x 一 111 h y d r o l了z e d
甲吕 f 10 U .
l一 8 。 同图
h e m ie e l u l o ` e s
5 S a m e a s f i R
.
,
他底物时多一些 。 因此 , X 一 I水解各种半
纤维素的产物中 , 以寡聚木搪为主 (图 5 ) 。
X 一 1 水解各种半纤维素的产物则主
要为木二糖及木二糖以上的各种聚合度的
寡聚木糖 , 并有少量阿拉伯糖及很微全的
木糖。 该酶水解不同底物时 , 产物类型差
曾宇成等 : 海粤曲霉地衣多塘酶和木聚塘酶的底物特异性
保温时间 I o c u b at ion t m ie 伪 )
图 S X 一u l 水解稻草 H B的纸层析图
F g i
.
8 Pa Pe r c h r o m at o g r am o f x一111 h y d r ol y z . d
r ic e s t r a wH Bf o r ra v io u s t m i。
标准艳同图 1 M ra ke r , s a m e a o f ig . l
别不大 (图 6) 。 x 一 1 1 水解不同底物时 , 产
物也主要为木二糖及木二糖以上的寡 糖 ,
且以木二糖的量为最多。 与 X 一 U 明显不
同的是 , x 一川 的产物中阿拉伯糖的量要
远少于木糖。 该酶水解不同底物时 , 产物
类型也差别不大 (图 7) 。 然而 , 用苯胺一二
苯胺显色证明 , x 一 n 、 x 一m 的水解 产物
中 , 除了寡聚木糖外 , 也有很少量聚合度不
大的寡来葡萄糖存在 , 特别是水解麦效 H H
时 ,寡聚葡萄糖斑点更为明显。
为了解 x 一 m 在水解底物的不同时间
过程中其产物的变化 , 取稻草 H B ( .0 5肠 ,
w /V ) 0
.
3 lnI
, 加 p H 5 . 0 、 0 . l m o l / L 乙酸
缓冲液 o . l m l , x 一 111 o . l m g (含蛋白 5产g ) ,
于 40 ℃ 水解 0一 48 小时 , 用纸层析法分析
水解产物 , 苯胺一邻苯二甲酸试剂显色。 结
果表明 , 没有水解的底物本身只有一个停
留在原点的成份 ,若水解 0 . 5 或 1 小时 , 产
物主要为木二糖及木二糖 以 上 的寡 聚木
糖 , 并有敬 t 木糖 ,检测不到阿拉伯糖。 随
广 一 着水解时间的延长 , 大分子寡聚木糖的量
迅速减少 , 木二糖和木糖的量迅速增加 , 同
时还产生少 t 阿拉伯搪 (图 8) 。
根据以上结果 ,可 以认为 , 虽然 X 一 I 对
地衣多糖的水解活性最强 , 但该酶也能以
内切方式水解木聚糖底物中的 务 1 , 4 一木
糖昔键 , 因而也有一定的内切木聚糖酶活
力。 x 一 1 、 x 一 m 对木聚糖底物作用最强 ,
且均以内切方式水解底物中的 户木 糖昔
键 , 故均应为内切型杏木聚糖酶 。 然而 ,
从水解产物的类型来看 , 这三种酶的水解
机制又不相同 。 x 一 I 的水解产物类型 表
明 , 该酶主要以随机方式水解底物分子内
部的 户 1 , 4一木糖省键 , 不能水解分子末
端的 价 1 , 4一木糖昔键 , 也不能水解 a 一 1 ,
3 一阿拉伯糖昔键 , 但有微弱的 水解分子内
部及末端 户葡萄糖昔键的能力。 X 一 1 的
水解产物类型表明该酶也主要以随机方式
水解底物分子内部的户 l , 4 一木糖昔键 , 并
有一定的从底物非还原端第二个木糖昔键
水解底物的能力。 该酶还能水解 底物中
。 一 1 , 3 一阿拉伯糖昔键分枝 , 且这种水解分
枝的活力远高于其水解底物分子末端户 l ,
十木糖昔键的活力。 x 一 1 的产物类型虽
然与 x 一 1 有些相似 , 但其产物中木二糖
的比例显著高于木二糖以上的寡聚木糖 ,
且在水解的前期即如此。 产物中木糖也比
阿拉伯糖出现早 , 数量也多得多。 这说明
该酶虽然也以内切方式水 解 底 物内部 的
户 1 , 4 一木糖昔键 , 但对非还原末端第二个
价木糖昔键有明显优先的水解作用 。而且 ,
该酶对底物分子末端的 户 l , 4 一木糖昔键
也有一定的水解作用 ,对 a 一 1 , 3一阿拉伯糖
普键分枝的水解活力则要低得多。据报道 ,
现在已提纯的木聚糖酶中 , 大部份都没有
水解 a 一 1 , 3一阿拉伯塘昔键分枝的活力 , 因
而产物中没有 L 一阿拉伯糖 15[ 、 只有奇异
长咏壳菌 `, , , 嗜热真菌 T a l a r o m 夕c 。 : 吞y s s o c几
3, 6 微 生 物 学 报 27 卷
1.,` .J矛O加zr`L护.L
, .`JōO丹Q子r刃lL.L
za 。 , iot J。 , Y H
一 5 0〔, ` , 等少数来源的木聚糖
酶具有分解 。 一 1 , 3一阿拉伯糖键分枝的能
力 , 因而产物中有 卜阿拉伯糖 。显然 , X 一 1
属于不能分解这一分枝的酶 , X 一 1 、 X 一 n l
则属于能分解的那一类酶 。
, .J1.JI`n甘,三,`JZ` .二月,盈二护.L白胜Lr.L
参 考 文 献
.J.l盈`,`甲. L.ró
,J .l .J月,ō、沙`1.,压r. L尸.L
. .J工J.自jJ,r.护.L
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A d a m s
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A
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K
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,
2 7 : 10 7一 1 15 , 19 8 2 .
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6 12 : 14 3一 15 2 , 19 8 2 .
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4 5 : 1 12 1一 1 12 7 , 19 8 1 .
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: 介 r . B i o l . C肠 , . , 4 5 :
2 42 5一2 4 3 2 , l , 8 1 .
S U B S T R A T E S P E C I F I C I T I E S O F L IC H E N A S E A N D
X Y L A N A S E S F R O M A S P E R G I L L U S P H O E N I C I S
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A s Pe r g i l l u : Ph o e月 i c t’s . L ie he n a s e ; X y l a n r
s e ; S u bs t r a t e s P e c if i c i t y