全 文 ：应用与环境生物学报　2004, 10(1):039～ 042 　 　
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 　 2004-02-25
　根癌农杆菌介导的高赖氨酸蛋白基因
转化叶用莴苣的研究
朱路英1 ,4 　刘 玲2＊　张振贤3
(1烟台师范学院生命科学学院　山东烟台　264025)
(2北京市农林科学院蔬菜研究中心　北京　100089)
(3中国农业大学园艺学院　北京 100094)
(4中国海洋大学生命学院　青岛　266003)
摘　要　构建了植物表达载体 pLBI ,该载体携带 35S 启动子 、高赖氨酸蛋白基因(LRP)、NPTII基因和 NOS 终止子.对影
响根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens L.)转化的多种因素进行探索后 ,建立了一种农杆菌介导的稳定的叶用莴苣遗
传转化系统.选择目前生产上大量推广应用的叶用莴苣品种 , 以其无菌苗子叶为外植体 , 经农杆菌 LBA4404(含质粒
pLBI)感染 ,在含 ρ(Kan)/mg L-1=100 的芽分化培养基上筛选转化芽 ,转入含相同浓度抗生素的生根培养基上进行生
根筛选 ,直至得到完整的再生植株.PCR扩增及 Southern blot的检测结果均表明 , 高赖氨酸蛋白基因已整合到叶用莴苣
基因组中.图 4 表 4 参 6
关键词　高赖氨酸蛋白基因;叶用莴苣;根癌农杆菌;遗传转化
CLC　S636.203.52
TRANSFORMATION OF LETTUCE USING
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
ZHU Luying1 , 4 , LIU Ling2＊&ZHANG Zhenxian3
(1College of Life Sciences , Yantai Normal University ,Yantai , Shandong　264025, China)
(2 Beijing Vegetable Research Center , Beijing　100089 , China)
(3College of Horticulture , Agricultrual University of China , Bei jing　100094 , China)
(4College of Marine Life Sciences , Ocean University of China , Qingdao　266003 , China)
Abstract　Plant binary expression vector pLBI containing lysine-rich protein gene , 35S promoter , NOS terminator and NPTII gene
was constructed.An efficient lettuce(Lactuca Sativa L.)transgenic system was established through explorating the factors affecting the
transformation.The cotyledons from the sterile seedlings were used as the explants and infected with A.tumefaciens LBA4404 contain-
ing pLBI.The transgenic plants of regenerants was indicated by plant growth on medium containing ρ(kanamycin)/mg L-1=100.
PCR and Southern blot analysis demonstrated further that lysine-rich protein gene had been integrated into transformants.Fig 4 , Tab
4 , Ref 6
Keywords　lysine-rich protein gene;Agrobacterium tumefactions;lettuce;transformation
CLC　S636.203.52
　　植物蛋白是包括人类在内的动物界所消耗蛋白质的主要
来源.然而植物蛋白因缺乏某些人体必须氨基酸如赖氨酸 、蛋
氨酸而营养不够平衡.而一种氨基酸的缺乏将影响着生物体对
其它氨基酸的吸收 ,从而降低了食物的营养价值.因此 , 改良植
物营养品质以增加食物中限制性氨基酸的含量 , 具有重要意
义.叶用莴苣(Lactuca sativa L.)是一种全球重要蔬菜作物 , 因
其具有低热量 、营养丰富 、所含的莴苣素有医疗保健等特点 , 日
益受到人们的关注.自从 1983 年 , Zambryski通过根癌农杆菌介
导法首次获得转基因烟草以来 ,植物基因工程技术进展十分迅
速 ,转基因成功的植物已达上百种.本文将来自四棱豆的高赖
氨酸蛋白基因构建到植物表达载体 pBI121 上 , 通过根癌农
收稿日期:2002-09-13　　修回日期:2003-12-01
＊通讯作者　Correponding author(Tel:010-51503037)
杆菌(Agrobacterium tumefaciens L.)介导法转化叶用莴苣子叶外
植体 , 使高赖氨酸蛋白基因整合到叶用莴苣体内 , 从而为利用
基因工程技术培育叶用莴苣新品种开辟了新的途径.
1　材料与方法
1.1　质粒 、载体与植物材料
带有高赖氨酸蛋白基因的质粒 pLRP由北京市农林科学
院细胞工程室提供;植物表达载体 pBI121 由本室保存;叶用莴
苣品种奥林匹亚 、大速生种子购自中国农科院蔬菜花卉研究
所.本试验在北京蔬菜研究中心生化楼完成.
将高赖氨酸蛋白基因构建并克隆到植物双元表达载体
pBI121 上 ,得到重组质粒 pLBI , 构建过程如图 1所示.其上编码
的NPTII基因可使受体植物获得卡那霉素(Kan)抗性.
1.2　三亲交配及菌种培养
将含重组质粒 pLBI 的菌株与含协助质粒 pBK2013 的菌株
HB101及农杆菌菌株 LBA4404进行三亲杂交 , 选择双抗菌落〔ρ
(Kan)/mg L-1=100 和 ρ(Str)/mg L-1=100〕, 将经双酶切及
PCR扩增鉴定为阳性的菌落接种于 ρ(Kan)/mg L-1=100 和ρ
(Str)/mg L-1=100 的 YEB 液体培养基上 , 于 28 ℃、200 r/ min
振荡培养至 Dλ值分别为 0.4 、0.6 、0.8、1.0 , 1:10稀释后感染外
植体.
1.3　外植体的获得
将叶用莴苣种子消毒后 ,无菌水冲洗 3 ～ 5 次 ,置于 1/2MS
培养基上暗培养 2 d 后 ,光下培养.切取不同苗龄(2 d 、3 d、4 d、
5 d)的子叶及 1 日龄的真叶做外植体 , 进行离体培养;同时以
不同苗龄(2 d、3 d、4 d、5 d)的子叶及 1 日龄的真叶做外植体 ,
进行遗传转化操作.
1.4　外植体的感染与培养
将预培养 1 d 的外植体浸入 MS 培养液稀释过的菌液 15
min ,取出 ,置于芽分化培养基上 , 28 ℃分别暗培养1 d 、2 d、3 d、
4 d后 , 转入芽分化选择培养基〔MS+0.1 ρ(6-BA)/mg L-1+
0.05 ρ(NAA)/mg L-1+100 ρ(Kan)/mg L-1+500 ρ(Carb)/ mg
L-1〕上 ,光下培养.同时设未共培养的和推迟(3 d 和 5 d)选择
的外植体为对照.待转化芽长至 1 ～ 2 cm 时切下 , 转至生根选
择培养基〔1/ 2MS+0.02 ρ(NAA)/ mg L-1+100 ρ(Kan)/mg L-1
+500 ρ(Carb)/mg L-1〕筛选抗性植株.培养条件为光照 16 h/
d ,光强 1 500 lx , 22 ℃(夜间)和 26 ℃(白天).同时设未转化植
株为阴性对照.
图 1　pLBI 重组质粒的构建
Fig.1　Scheme for const ruction of pLBI
1.5　PCR检测
取抗性植株的幼嫩叶片 , CTAB 法提取总 DNA[ 1] , 以此为
模板 , 用高赖氨酸蛋白基因的特异引物(5′-AGCGGCACGAG-
GCAAATC-3′;5′-GGCAAAGCAAGCACCACCAAC-3′)进行扩增.扩
增条件为 94 ℃预变性 10 min , 30 个循环(94 ℃变性 15 s , 55 ℃
复性 30 s , 72 ℃延伸 1 min)结束后 , 72 ℃延伸 10 min.
1.6　Southern blot分析
取经 PCR鉴定为阳性的植株幼嫩叶片 , 提取总 DNA , 进行
Southern杂交.杂交过程分别按文献[ 2] 和 DIG 标记试剂盒进
行.
2　结果与分析
2.1　外植体的选择及对转化效果的影响
建立一套高效的外植体再生体系是进行遗传转化的前提.
本试验采用了不同苗龄的子叶和真叶做外植体进行离体培养 ,
发现随着子叶苗龄的增加 ,芽的分化速率迅速降低(表 1), 2～
3 日龄无菌苗子叶外植体出芽率最高.可能是小苗龄子叶的生
理代谢活跃 ,更易受到外界因子如外源激素的影响 ,更容易脱
分化 、再分化而生成芽.而真叶外植体的分化率明显低于子叶 ,
只有 75.5%.
表 1　苗龄对叶用莴苣子叶外植体再分化的影响
Table 1　Effects of seedling age on redifferentitation of
lettuce cotyledon explants
苗龄
Seedling age
(t/ d)
外植体数
Quantity of
explants
出芽外植体数
Quantity of
budding explants
出芽率
Budding
rate(r/ %)
2 41 37 90.24
3 40 35 87.50
4 42 30 71.43
5 40 28 70.00
外植体的转化率与其再生率基本上呈线性关系(表 2),故
以下的试验中选择 2～ 3日龄的子叶为外植体进行遗传转化操
作.
表 2　苗龄对产生抗性芽的影响
Table 2　Effects of seedling age on resistant shoot generation
of lettuce cotyledon explants
苗龄
Seedling
age
(t/ d)
外植体数
Quantity of
explants
出芽数
Quantity of
shoots
抗性芽数
Quantity of
resistant
shoots
抗性芽频率
Rate of
resistant shoot
generation(r/ %)
2 30 10 3 10.00
3 32 9 3 9.38
4 30 5 1 3.33
5 29 3 0 0
2.2　菌液浓度对转化效果的影响
试验(表 3)表明 ,农杆菌培养至 D600 nm为 0.6 左右时 ,产生
的抗性芽较多;浓度过高会导致外植体褐化死亡;浓度过低则
不能让足够的农杆菌附着于外植体切口处 , 而使转化频率降
低.
2.3　共培养时间对转化效果的影响
外植体与农杆菌共培养是获得转化体的重要环节.本试验
结果(表 4)表明 ,共培养时间为 2～ 3 d , 产生的抗性芽较多;随
共培养时间的延长 ,抗性芽数降低 , 原因可能是农杆菌的过度
生长 ,导致外植体受毒害而死亡.
40 　　　　　　　　应用 与 环境 生物 学报　　Chin J Appl Environ Biol　　　　　　　 　　　　　　　　　　10卷
表 3　不同菌液浓度对产生抗性芽的影响
Table 3　Effects of germ concentration on resistant shoot
generation of lettuce cotyledon explants
　菌液浓度
Germ
concentration
(D600 nm)
外植体数
Quantity of
explants
出芽数
Quantity of
shoots
抗性芽数
Quantity of
resistant
shoots
抗性芽频率
Rate of
resistant shoot
generation(r/ %)
0.4 62 19 4 6.45
0.6 61 15 7 11.57
0.8 60 9 4 6.67
1.0 60 3 1 1.67
2.4　抗性植株的获得
本试验发现 ,外植体转化 1 wk后 , 开始在近轴端伤口处产
生淡黄色愈伤组织 , 以后渐分化出绿色小芽点 , 萌发出芽(图
2A);而未转化的外植体多数在产生较多的白色愈伤组织后 ,
渐渐死去;少数则产生白化芽后死去.
将抗性芽转于生根培养基上进行生根筛选 ,发现少数抗性
芽可在含ρ(Kan)/mg L-1=100 的生根培养基上正常生根 , 且
植株健壮 ,颜色浓绿 , 生长很快(图 2B 、2C);而多数芽体则不能
正常生根 ,渐白化 、枯死.分析原因可能是外植体初分化时产生
大量愈伤组织 ,体积的膨胀使得部分愈伤组织不能直接接触培
养基 , 因而它的分化不受卡那霉素的抑制 , 使得大量假阳性芽
产生.
而进行推迟选择的外植体效果不佳 , 产生的抗性芽极少 ,
几乎全为假阳性.
图 2　抗性植株的获得
Fig.2　Resistant plant
A.转化叶用莴苣产生的抗性芽 Transgenic plants from resistant shoots;B.抗性芽的根系发育 Roots of transgenic plants;C.转基因植株 Transgenic plant
表 4　共培养时间对产生抗性芽的影响
Table 4　Effects of co-culture time on resistant shoot
generation of lettuce cotyledon explants
共培养时间
Days of
co-culture
(t/ d)
外植体数
Quantity of
explants
出芽数
Quantity of
shoots
抗性芽数
Quantity of
resistant
shoots
抗性芽频率
Rate of
resistant shoot
generation(r/ %)
1 64 5 3 4.69
2 60 10 7 11.67
3 62 11 7 11.29
3 62 11 7 11.4 2 2 3 2923
5 60 1 1 1.67
图 3　部分转基因植株的 PCR检测结果
Fig.3　PCR amplifi cation result s of
some transformed plants
1:1 kb DNALadder;2 、3 、4 、5:转基因植株样品 Transgenic plants;6.未转
化植株样品 Non-transgenic plant;7.阳性对照(质粒 pLBIDNA)Positive
cont rol(plasmid pLBIDNA)
2.5　抗性植株的 PCR检测
以能在生根选择培养基上生根的植株为样品 ,提取总 DNA
进行 PCR检测 , 结果如图(图 3).样品中有预期的 345 bp 的特
异条带出现 ,而阴性对照中没有.这初步说明高赖氨酸蛋白基
因已整合到叶用莴苣组织中.
2.6　抗性植株的Southern blot分析
Southern blot检测结果表明(图 4), 3个样品均呈阳性反应 ,
且高赖氨酸蛋白基因在不同转基因植株中的整合位点不同 ,整
合的拷贝数也有差异.直接从分子水平证实了该外源基因已转
入到叶用莴苣基因组中.
3　讨 论
关于叶用莴苣遗传转化的研究 , 国内外报道不多.本试验
在建立快速高频叶用莴苣再生体系基础之上 ,对影响转化频率
的因素进行了探讨.我们发现同其它转基因植物类似 , 基因型
依赖性是影响叶用莴苣转化频率的重要因素.本试验中使用了
两个品种:奥林匹亚和大速生 , 尽管二者的再生率差别不大 ,但
获得的转基因植株仅限于奥林匹亚品种 ,这说明转化效率在不
同基因型间存在差异 ,与 Curtis[ 3]的研究结果一致.在外植体的
选用上 ,有人认为真叶的转化效果较好 , 但我们发现本试验所
用的两个品种的真叶再生率明显低于子叶 ,且转化效果也不理
想.针对本试验所选用的品种 , 以 2～ 3 d 苗龄的子叶为外植体
转化效果较好.用农杆菌介导法进行遗传转化时 , 农杆菌菌液
41　 1 期 朱路英等:根癌农杆菌介导的高赖氨酸蛋白基因转化叶用莴苣的研究 　　
浓度和浸染时间也直接影响转化频率.菌液浓度过高或浸染时
间过长 ,常会导致外植体受毒害而褐化死亡;而菌液浓度过低
或浸染时间过短 , 则不能让足够的农杆菌附着于外植体切口
处 ,致使转化频率降低.本试验经一系列探索后发现当菌液浓
度 D600为 0.6时 , 浸染时间以 15 min 为宜.另外 ,外植体浸染前
进行适当时间的预培养(1 d)和共培养(2 ～ 3 d)也利于转化频
率的提高.
图 4　转基因植株 Southern blot 分析
Fig.4　Southern blot analysis of transgenic plants
　　有报道说 ,推迟选择可提高转化频率 , 但本试验未得到类
似的结果.虽然推迟选择使再生芽数大大增加 ,但其中抗性芽
极少 ,并且大量假阳性芽的筛选使工作量加大.原因可能是所
　　　　　
采用的叶用莴苣品种分化较快 , 导致非转化细胞进入分化阶
段 , 而大量非转化芽的再生影响了转化芽的再生.
在叶用莴苣的遗传转化报道[ 3 ～ 6]中 , 所转基因多为报告基
因 , 转化具有生产应用价值的目的基因的报道很少.本研究将
富含赖氨酸蛋白的基因通过农杆菌介导转入叶用莴苣 , 旨在优
化适合我国栽培的叶用莴苣遗传转化体系 ,为培育优良的叶用
莴苣品种开辟新的途径.
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