全 文 ：上海农业学报 19 9 8 , 14 ( 3 ) : 17~ 2 0
A c t a A g r ic u l t u ar e S h a n g h a i
叶 用 离 首 高 频 率 再 生 体 系 的 建 立 ’
孙月芳 黄剑华 陆瑞菊 周润梅 王亦菲
(上海市农业科学院生物技术研究中心 ,上海 2 0 1 1 0 6 )
李海谦
(云南省蒙自红河州农业科学研究所 , 云南 6 6 1 10 0)
摘 要 以 4 份叶用葛芭栽培品种为材料 , 比较了激素组合 、 A g N O 3 及其浓度和不同外植体
切段对不定芽形成的影响 。结果表明 ,在本实验条件下 Z T I m g / L 和 IA A 1 m g / L 组合的出芽外植
体百分率最高 ,平均为 20 . 14 % ;培养基中添加 A g N O 。 可明显提高植株再生频率 ,增加每个外植体
的丛生芽数目 ,浓度以 5 m g / L 为最好 ,具芽外植体百分率平均为 4 . 90 % ;真叶的培养效果好于子
叶 ,真 叶柄的培养效果优于真 叶其它部位 , 以真 叶柄 为外植体 , 在添 加 A g N O 。 5 m g /L 和 c H
1 0 0 0 m g L/ 的培养基上获得了 98 . 0 % 以上的出芽外植体百分率 。
关健词 叶用葛芭 ;外植体 ;不定芽 ;植株再生
叶用葛芭 ( L ac t cu a : at iv a va r . ` aP i t at a L . )是一种食用价值很高的绿叶蔬菜 ,正逐步为上
海市民所喜爱 ,需求量不断上升 。但在南方栽培种植容易烂根 , 为选种 、 留种带来了技术上的困
难 ,利用外植体离体培养建立高频植株再生体系可为育种工作者解决这一难题 , 并扩大繁殖系
数 ,前人做了有益的尝试 l[, 2〕 ;利用植物体细胞无性系变异的特点 , 结合采用逆温胁迫 ,可以筛
选耐逆温变异体 3[ 一 5〕 ,而细胞突变体筛选的效率在很大程度上依赖于高频植株再生技术的建
立 ;该技术的建立也为进一步通过基因工程改良生菜种质提供良好的基础困 。 我们用本地的主
栽优 良品种为供体 , 以外植体培养高频再生为目的 ,进行了一些前人未曾报道的研究 ,本文报
道建立叶用葛芭高频植株再生体系的试验结果 。
1 材 料 与 方 法
1
.
1 供试材料 供试材料为叶用葛芭 ( L ac t uc a s at i v a v ar . c aP it at a L . ) 品种翠叶 、玻璃生菜 、
红艳和 H Z 。
1
.
2 种子消毒与萌发 将种子在 0 . 1 %的升汞溶液中浸泡 5 m in ,用无菌水冲洗 3一 4 次 ,播
种于 1 2/ M S 培养基上 ,培养无菌苗 。
1
.
3 接种及培养 以发芽后一周的子叶或发芽后二周的真叶为供试材料 , 在超净台上将子
叶 、子叶柄和真叶 、 真叶柄分别切成 0 . 3~ 0 . 5 C m 切段 ,接种于培养基上 , 每瓶接 6 个外植体切
段 , 每个处理接 15 ~ 25 瓶 。 在 25 士 1℃ 、 光强 1 8 0 0 lx 、每天光照 12 h /黑暗 12 h 的光周期条件
下培养 。
1
.
4 培养基 以 K el e r 为基本培养基 ,蔗糖 2% ,琼脂 。 . 6% , p H S . 8 。 激素为 6一 B A 与 N A A
和 Z T 与 I A A 组成 , 附加成分为 A g N O 3 和 C H (表 一) 。
1
.
5 统计 出芽外植体百分率~ (产生不定芽的外植体数 /接种的外植体数 ) x 10 % 。被污染
收稿日期 : 1 9 98一 0 3一 0 9 初稿 ; 1 9 9 8一 0 3一 2 4 修改稿 。
. 上海市农业科学院发展基金资助项目 。
上 海 农 业 学 报 1 4 卷
的外植体不参加统计 。
表 1 培养基的组成
Ta b le 1 Co m Po s i ti o nI n va rio 任5 me d iu m
培养基编号 ( N o . o f me d i u ) m
一 一6 一B A ( rng / L )N A A ( mg / L )Z T( rng / L )I A A ( mg / L )A g N O 3 ( mg / L )H C( mg / L )2 结 果 与 讨 论2 . 1 激素组合对不定芽诱导的影响
以子叶为外植体比较了三种材料在以 6 一B A 与 N A A 为组合 (表 1 , N o . 1) 和以 z T 与 I A A
为组合 (表 1 , N o . 3) 培养基上的反应 , 结果表明接种 1 周左右切 口处形成黄绿色愈伤组织 , 2
周后产生许多淡绿色 突起 , 进一步发育为绿色不定芽 。 从表 2 可以看出尽管在同一培养基上品
种之间出芽外植体的百分率有较大的差异 ,但以 Z T 和 I A A 为组合的培养基上出芽外植体的
百分率平均为 20 . 14 % , 而 6一 B A 和 N A A 组合只有 3 . 75 % 。 且 Z T 与 I A A 为组合每个外植体
再生的不定芽数比 6一 B A 与 N A A 组合多 1~ 2 个 ,平均为 3 ~ 4 个 。 品种红艳对激素类型 的敏
感程度比翠叶明显 ,即红艳在 2 个培养基上的培养反应差异比翠叶的大 。 上述现象表明 ,通过
激素类型的选择可以提高外植体的培养效果 , 我们在番茄巨7口和青菜上也观察到类似现象 ,蔬菜
类作物的组培对 Z T 和 I A A 敏感是否具有普遍性 ? 值得进一步研究 。
表 2 不同激紊组合对叶用离曹子叶外植体不定芽形成的影响
T a b l e 2 E f f e e t o f h o r m o n e e o m b i n a t i o n o n i n d u C t l o n o f a d v e n t i t i o u s b u d s
培养基编号
N o
.
o f rn e d i u rn
接种外植体数
C u l t i v a r N u m b e
r o f e x p la n t s
出芽外植体数
N u m b e r o f e x P la n t s
w i t h b u d s
百分率 (% )
R a t e o f e x P la n t s
w i t h b u d s (% )
0
nJC工ó7.0甘叮叮八了
.…dqo六O八j翠叶 ( C u i y e )红艳 ( H o n g y a n )H 2
合计 ( T o t a l )
翠叶 ( C u i y e )
红艳 ( H o n g y a n )
H 2
合计 ( T o t a l )
1 0 8
1 0 8
1 0 4
3 2 0
1 0 8
1 0 8
7 2
2 8 8
4
1
7
1 2
2 3
1 2
2 3
5 8
2 1
.
2 9
1 1
.
1 1
3 1
.
9 4
2 0
.
1 4
2
.
2 A g N o
, 及其浓度对子叶不定芽形成的影响
以翠 叶和 玻璃 生菜的子叶为外植体分别接种于表 1 所示 的 3一 6 号培养基上 , 观察
A g N O
3及其浓度对子叶不定芽形成的影响 (表 3 ) 。
在这 4 种培养基上平均 出芽百分率分别为 15 . 74 % 、 35 . 65 % 、 4 . 90 % 、 39 . 79 % , 培养基
中添加 A g N O 。 明显有利于外植体不定芽 的形成 ,植株再生频率提高 2一 3 倍 ,而且每个外植
体产生丛生芽的数 目也有所增加 。 品种翠叶在没有 A g N O 。 (表 3 , N o . 3) 的培养基上出芽外植
体百分率只有 21 . 29 % , 每个外植体的丛生芽数平均为 2一 4 个 ;附加 A g N O 。 3 ~ 7 m g / L (表
3
,
N o
.
4一 6) 后 , 出芽外植体百分率提高到 5 0 . 0 %一 5 8 . 16 % , 每个外植体的丛生芽数平均为
3 ~ 6 个 ,其中以 A g N O 3 5 m g / L (表 3 , N o . 5) 效果最好 , 出芽外植体百分率为 58 . 16 % , A g N O 3
3期 孙月芳等 : 叶 用 葛 首 高 频 率 再 生 体 系 的 建 立
7 mg /L 出芽外植体百分率下降为 5 . 1 % 0, 但下降幅度并不 明显 。 品种玻璃生菜在附加
A g N O
3后出芽外植体百分率从 1 0 . 19 %提高到 21 . 29 % ~ 31 . 63 % 。 这与张鹏等阁对 “ 菜心 ” 的
研究结果相似 , 表明 A g N O 。 对叶用葛芭植株再生频率的提高有明显的促进作用 ,包括提高植
株再生频率和丛生芽数 目 ,但其使用量似乎有一限量 ,在本试验中其表现为 s m g / L 。 A g N O 3
对许多植物的形态发生有促进作用 9[, ’ 。〕 , 其作用机理也研究得较为深入 。 一般认为 A g + 作为一
种乙烯抑制剂并非抑制乙烯的合成 , 而是通过促进多胺的合成来提高体细胞胚胎和芽的发生
频率 。
表 3 A g N o 3 及其浓度对子叶外植体不定芽形成的影响
T a b l e 3 E f f e e t o f A g N 0 3 o n i n d u e t i o n o f a d v e n t i t i o u s b u d s
培养基
N o
.
o f
m u d i u m
C u l t i v a r
接种外植体数
N u m b e r o f
e x p l a n t
s
出芽外植体数
N u m b e r o f e x P la n t s
w i t h b u d
s
百分率 (% )
R a t e o f e x p la n t s
w i t h b u d s ( % )
月生,d行It了1只é5宁门了5qJ只O口8八b0月匕只ùO曰内OCé飞10口OJQ“O1立J I山勺1
翠叶 ( C u iy e )
玻璃生菜 ( oB l i s h e n g e a i )
合计 T o t a l
翠叶 ( C u iy e )
玻璃生菜 ( B o l i s h e n g e a i )
合计 ( T o t a l )
翠叶 ( C u i y e )
玻璃生菜 ( B o l i s h e n g e a i )
合计 ( T o t a l )
翠叶 ( C u i y e )
玻璃生菜 (OB li s h e n g e a i )
合计 ( T o t a l)
1 0 8 2 3 2 1
.
2 9
1 0 8 1 1 1 0
.
1 9
2 1 6 3 4 1 5
.
7 4
5 0
.
0 0
2 1
.
2 9
3 5
.
6 5
5 8
.
1 6
3 1
.
6 3
4 4
.
9 0
5 4
2 4
7 8
5 5
.
10
2 4
.
4 9
3 9
.
7 9
另外 ,我们在试验中还发现 , 在培养基中附加 A g N O 3 的同时添加 C H 对不定芽的形 成也
有很大的促进作用 。 品种翠叶在只附加 A g N O 3 5 m g / L 的 5 号培养基上 , 子叶外植体的出芽百 ·
分率为 58 . 16 % (表 3 ) ;而在同时添加 C H 的 7号培养基上 ,子叶外植体的出芽百分率提高到
86
.
67 % (表 4 ) 。 玻璃生菜也一样 ,子叶外植体的出芽百分率从 3 1 . 63 % (表 3) 提高到 80 . 0 %
(表 4 ) 。 C H (水解酪蛋 白 )为多种氨基酸混合物 ,也许在 A g 十促进多胺合成的过程中有提供 “ 前
体 ” 的作用 ,促进了多胺的合成 ,进而提高了不定芽的发生频率 。 A g N O 。 和 C H 相配合在叶用
葛芭离体培养方面的研究还未见报道 。
2
.
3 不同外植体切段对不定芽形成的影响
以品种翠 叶和 玻璃生菜为材料 , 在 Z T 与 I A A 组合中附加 A g N O 。 5 m g / L 、 c H 1 0 0。
m g / L的 7 号培养基上比较了以子叶 、 子叶柄和真叶 、 真 叶柄为外植体对不定芽形成的影响 。 刘
凡等口`〕发现 叶用葛芭真叶外植体形成的不定芽数较子叶外植体多 ,外植体出芽频率最高为
87 %
,但他们未做真叶柄外植体试验 。而我们在试验中发现不同外植体的出芽百分率有较大差
异 ,且以真叶柄为外植体效果最好 , 出芽外植体百分率高达 98 %以上 。 从表 4 可以看出 ,真叶
的培养效果优于子叶而真叶柄又优于真叶柄以外的部位 。以全息生物学观点来分析 , 真叶柄周
围细胞群的生物全息表达潜能较强 , 易受外界条件的刺激 ,在适当的条件下易于产生全息现
象 。 倪德祥 12[ 〕以斑叶海棠无菌苗的叶片和 叶柄为外植体有力的证明了植物离体器官形态发生
中的全息现象 。
另外 , 我们还比较了发芽一周子叶和发芽二周子叶的培养效果 ,发现在培养基中 A g N O 3
浓度在 3 m g / L 时 , 7 d 龄子叶的出芽外植体百分率高于 14 d 龄的子叶 , 但随着 A g N O 。 浓度
上 海 农 业 学 报 1 4 卷
表 4 不同外植体对不定芽形成的影响
T a b l e 4 E f f e e t o f e x P la n t s o n I n d u e t i o n o f a d v e n t l t五o u s b u d s
品 种
C u l t i v a r
外 植 体 出芽外植体数
N u m b e r o f e x P la n t s
w i t h b u d s
百分率 ( % )
E x P la n t
接种外植体数
N u m b e r o f
e x P la n t s
R a t e o f e x p la n t s
w i t h b u d s (% )
翠叶 (C u iy e )
玻璃生菜 (BO li s h e n g e a i )
子叶 ( C o t y le d o n )
子叶柄 ( C o t y le d o n p e t i o l e )
真叶 ( L e a f )
真叶柄 ( L e a f p e t i o le )
子叶 ( C o t y le d o n )
子叶柄 ( C o t y le d o n p e t i o l e )
真叶 ( L e a f )
真叶柄 ( L e a f p e t i o le )
13 5
12 0
13 5
1 2 0
13 5
1 2 0
1 3 5
1 2 0
1 1 7
1 0 7
1 3 0
1 1 9
1 0 8
1 0 4
1 1 9
1 1 8
8 6
。
6 7
8 9
。
17
9 6
.
2 9
9 9
.
17
8 0
.
0 0
8 6
.
6 7
8 8
.
1 5
9 8
.
3 3
的提高 , 新 、 老子叶之 间出芽外植体百分率的差异逐渐缩小 , 当 A g N O 。 浓度提高到 5 m g / L
时 , 7 d 龄子叶与 14 d 龄子叶的出芽外植体百分率已接近 。
参 考 文 献
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T r a n s f o r m a t i o n o f
P l a n t C e l l R e p o r t s
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1 9 8 7
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6
: 4 3 9~ 4 4 2
le t t u e e ( aL
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S t im u la t i o n o f s h o o t r e g e n e r a t i o n f r o m e o t y l e d o n s o f H e l ia n t h u s a n n u u s b y
t h e e t h y le n e in h i b i t o r s s i l v e r a n d e o b a l t
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20 4一 2 0 7 ·
内了OUOJ
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M e d g y e s y M
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S t im u la t io n o f s h o o t r e g e n e r a t i o n in T r i t i e u m a e s t i v u m a n d N ic o t i a n a
P l u m ba g i n 汀b l i a V i v . t i s s u e e u l t u r e u s i n g t h e e t h y l e n e i n h ib i t o r o f A g N O 3 · P l a n t C e ll R e p , 1 9 8 7 , 6 : l ~ 4 .
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E S T A B L I S H M E N T O F H I G H
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S Y S T E M O F L E A F L E T T U C E ( L a e t u c a s a t i v a v a r 刃即 i t a t a L . )
S u n Y u e f a n g H u a n g J ia n h u a L u R u i ju Z h o u R u n m e i W
a n g Y i fe i
( A g or
一B i o t e c h R e s e a cr h eC
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S h a n g h a i A c a d e n U
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c u lt u ar l S c i e n c e s
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L i H a i q i a n
( H o n g h e D i s t r ie t In s t i t u t e o f A g r i e u l t u r a l S e i e n e e s
,
M e n g z i Y u n n a n 6 6 1 1 0 0 )
A b s t r a c t E f f e e t s o f d i f f e r e n t h o r m o n e e o m b i n a t i o n s
,
A g N O
3 e o n e e n t r a t i o n s i n m e d i a
a n d e x p l a n t s o n i n d u e t i o n o f a d v e n t i t i o u s b u d s w e r e e o m p a r e d u s i n g 4 l e a f l e t t u e e e u l t i v a r s
.
T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t m e a n i n d u e t i o n r a t e f o r t h e e o m b i n a t i o n o f Z T 1 m g / L w i t h x A A I
m g / L w a s s u p e r i o r t o t h a t f o r t h e e o m b i n a t i o n o f 6
一
B A o
.
5 m g / L w i t h N A A 0
.
1 m g / L
, t h e
r a t e s w e r e 2 0
.
1 4% a n d 3
.
7 5%
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.
T h e m e d i a s u p p l e m e n t e d w it h A g N O
3
5 m g / L
w e r e b e n e f i e i a l t o i n d u e e m o r e a d v e n t i t i o u s b u d s a n d e o u ld i n e r e a s e t h e r a t e o f in d u e e d a d
-
v e n t i t i o u s b u d s b y 4 4
.
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.
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o n g t h e 4 s o r t s o f e x p l a n t s ( e o t y l e d o n
, e o t y l e d o n p e t i o l e
,
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a n d l e a f p e t i o l e )
,
l e a f p e t i o le p o s s e s s e d t h e h i g h e s t e a p a b i l it y f o r p l巨n t r e g e n e r a t i o n , t h e
r a t e o f i n d u e e d a d v e n t i t i o u s b u d s w a s o v e r 9 8% w h
e n m e d i a w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h A g N O
3
5 m g / L a n d C H 1 0 0 0 m g / L
.
K e y w o r d s L e a f l e t t u e e ; E x P l a n t s ; A d v e n t i t i o u s b u d s ; P l a n t r e g e n e r a t i o n