全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(9)：1310—1316
辣椒高赖氨酸蛋白基因 Cflr全长 cDNA的克隆及其
组织表达特征
孙晓波，房 瑞，余桂红，刘全兵，马鸿翔
(江苏省农业科学院农业生物技术研究所，南京 210014)
摘 要：为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因，以辣椒栽培种 ‘江蔬 7号’的成熟花粉为材
料，根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物，通过 RT—PCR技术扩增到一条长 390 bp
的cDNA片段 ，继而应用 RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长 cDNA，命名为 Cflr(Gen—
Bank登录号：EU367999)。 r基因cDNA全长 920 bp，5 端有 84 bp的非翻译区，3 端具有完整的 polyA
尾，包含一个编码 223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列
的同源性为50％ ～60％，氨基酸序列的同源性为40％ ～50％。该基因所编码 的蛋白质中赖氨酸含量为
21．2％，苏氨酸含量为 10．3％，是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量 RT—PCR结果表明，Cflr
基因在辣椒未成熟花药 、成熟花粉 、花瓣、茎、叶片和根中均有表达，在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最
高，在叶片中表达量明显减少，而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。
关键词：辣椒；高赖氨酸蛋白基因；RACE；组织表达特征
中图分类号：S 641．3 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)09—1310-07
Cloning and Expression Characterization of a Lysine-rich Protein cDNA
(Cfir)from Pepper
SUN Xiao—bo，FANG Rui，YU Gui-hong，LIU Quan—bing，and MA Hong—xiang
(Institute ofBiotecbnology，Jiangsu Academy ofAgricultural Sciences， ng 210014，China)
Abstract：To obtain a new lysine—rich protein gene from species of solanaceae，a 390 bp fragment was
amplified from pepper cuhivar‘Jiangshu 7’using its matural pollen cDNA as the template and the conserva—
tive sequences of potato and tomato lysine-rich protein genes as the primers by RT—PCR．A full—length cDNA
with completed open reading flame of 223 amino acids was cloned using the strategy of RACE (rapid amplif—
cation of cDNA ends)．This cDNA was designated as Cflr(GenBank accession number：EU367999)，which
contained 920 bp with an untranslated region of 84 bp at 5 end and a polyA tail at the 3 end．BLAST search
against NCBI showed that the Cflr gene shared 50％ —60％ identity with the lysine-rich protein genes from pc·-
tato and tomato in nucleotide and 40％ 一50％ in amino acid． The lysine content of CFLR protein was
2 1．2％ ，which was higher than the repofled natural lysine—rich proteins，and the threonine content was
10．3％．Analysis of semi-quantitative RT—PCR indicated that Cflr gene was transcribed in matural polen and
petal largely，less in leaf，and hardly in immature anther，stem and root．
Key words：pepper；lysine—rich protein gene；RACE；tissue expression characterization
赖氨酸为人体必需氨基酸。禾谷类作物籽粒中赖氨酸含量普遍偏低，不足 0．44％ (王绍中 等，
2001)，仅满足人体所需的45％。
收稿日期：2008—05—05；修回日期 ：2008—07—14
基金项目：江苏省自然科学基金项 目 (BK2006158)
通讯作者 Author for correspondence(E-mail：mahx@jass．ac．cn)
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9期 孙晓波等：辣椒高赖氨酸蛋白基因 r全长 eDNA的克隆及其组织表达特征
向作物中引入高赖氨酸的异源基因在水稻、玉米和小麦的品质改良中已有成功的报道。高越峰等
(2001)用基因枪法将源于四棱豆的高赖氨酸蛋白基因 ( )转入水稻，大部分植株的叶片赖氨酸含
量有不同程度提高，最高增幅为 16．04％。孟超敏等 (2004)将源于四棱豆的高赖氨酸蛋白基因
( 6frp)和赖氨酸合成关键酶基因 (dapA)的植物表达载体 pBPC102，用基因枪导人小麦受体品种，
结果显示4个株系的种子赖氨酸含量提高了 10％左右。郎志宏等 (2004)用基因枪转化法将马铃薯
高赖氨酸蛋白基因 (SBgLR)导入玉米，得到6个蛋白质和赖氨酸含量均提高30％以上的株系，其中
一 个株系赖氨酸含量提高了43．5％。
已报道的天然存在的高赖氨酸蛋白基因主要是马铃薯和番茄的花粉特异性表达的高赖氨酸蛋白基
因sb401(Liu et a1．，1997)、SBgLR (Lang et a1．，2004)、st901(Zhao et a1．，2006)和 6(赵倩
等，2004)，以及在四棱豆种子中表达的高赖氨酸蛋白基因 (高越峰 等，2001)。进一步克隆天然
存在的高赖氨酸蛋白基因，丰富高赖氨酸蛋白基因资源的多样性，并将其应用于作物品质改良，对于
改善禾谷类作物籽粒营养品质具有重要意义。
本研究中通过马铃薯和番茄的花粉特异性表达的高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物，通过聚
合酶链式反应 (PCR)技术与RACE技术相结合从辣椒中克隆到了一个高赖氨酸蛋白基因，并对其组
织表达特征进行了研究。
1 材料与方法
1．1 材料
辣椒 (Capsicumfrutescens L．)栽培品种 ‘江蔬7号’，取自江苏省农业科学院蔬菜试验场。限制
性内切酶和 。DNA聚合酶均购自Takara公司，mRNA分离试剂盒购自美国Invitrogen公司，RNA逆
转录试剂盒与pGEM．T载体均购自Progema公司，SMART RACE cDNA扩增试剂盒购自CLONTECH
公司，其它试剂为进口或国产分析纯。
1．2 PCR引物
所用引物根据 Liu等 (1997)从马铃薯花粉中克隆的高赖氨酸基因sb401的 eDNA序列和赵倩等
(2004)从番茄花粉中克隆的高赖氨酸基因￡s6的 cDNA序列进行序列比较找出的保守区域设计而成。
引物 1序列为：5 一GGGAATCAAAGCACGCAGTFGCAACG．3 ；引物 2序列为：5 ．ACAGATFC3TFCT．
TCTCCACAACAGC一3 。
1．3 RT-PCR
取辣椒成熟花粉，采用TRIZOL Regent一步法抽提试剂盒 (Invitrogen，USA)提取总RNA。
取 RNA 2 L，Oligo(dT)。5引物 1 L，加水至10．5 IxL，70 qC变性5 rain，冰浴2 rain，然后在该
溶液中依次加入 10×反转录缓冲液 2 L，MgC12(25 rlllOl·L )4 IxL，dNTP (10 mmol·L )
2 p．L，核糖核酸酶抑制剂0．5 IxL，AMV反转录酶 1 L，42℃延伸 1．5 h，70℃放置 15 min终止反
应。
取 2 L逆转录产物为模板，加入 10×PCR缓冲液 2．5 trL，上下游引物 (10~xmol·L )各 1
L，dNTP(2．5 nlnlol·L )1 L，PfuDNA聚合酶 (10 U· L )0．25 L，加水至25 L。反应
参数为：95 c预变性3 rain后，95 qC 1 rain，55℃ 1 rain，72℃ 1 rain，共35个循环；然后72℃延
伸 10 rain。
1．4 RACE eDNA文库的构建
按照Clontech公司 SMART RACE eDNA Amplific．ation Kit的操作程序构建辣椒花粉的 RACE
cDNA文库。
取辣椒花粉的总 RNA 2 ，5 一CDS引物和SMART I A oligo各1 L(5-ready RACE eDNA文库)
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或3 ．CDS引物 A 1 tzL(3 一ready RACE cDNA文库)，
后在该溶液中依次加入5×第一链缓冲液2 L，DTI
1 L，Power Script反转录酶 1 L。42 oC延伸 1．5 h，
置 7 rain终止反应。
加水至5 ILL。70℃变性 2 min，冰浴2 rain，然
(20 mmol·L )1 I,zL，dNTP (10 mmol·L )
然后加入 20 txL Tricine—EDTA缓冲液，72℃放
将构建好的3 ．ready和5 一ready RACE cDNA文库分装成小份，保存于 一20℃冰箱，备用于后续
试验。
1．5 Cflr基因5 端和3 端序列的克隆
根据RT。PCR扩增产物的测序结果，在其序列内部设计基因特异引物5GSP—R1：5 -CTCTGTCTCT-
GGCTTATI"AGCATC．3 和 5 GSP．R2：5 一CTACACCAGCAACAGCTGCAGTTG一3 。以 5’一ready RACE cDNA
文库为模板，利用 SMART RACE eDNA Amplification Kit提供的5 引物和基因特异性引物扩增该基因
的 eDNA 5 端。
根据 RT—PCR扩增产物的测序结果在其序列内部设计基因特异引物 3GSP—L：5 -CACCGTFC—
CAAAGAACAAGAGATC．3 ，以3 ．ready RACE cDNA文库为模板，利用 SMARTⅢRACE cDNA Amplif—
cation Kit提供的3 引物和3GSP．L引物扩增该基因的3 端。
PCR产物克隆、测序后，根据扩增片段与已有 EST的重叠区将 cDNA 5 和3 端拼接起来。PCR反
应体系参见SMART RACE eDNA Amplifcation Kit说明书。
1．6 Cflr基因氨基酸序列同源性及聚类分析
采用 DNAMAN软件对马铃薯、番茄和辣椒的高赖氨酸蛋白基因的核酸及编码的蛋白序列进行序
列同源性分析及进化分析。
1．7 Cflr基因在不同组织器官表达特性的研究
总 RNA的提取及eDNA第一链合成的条件同上。依据所获得的 r全长 cDNA序列设计正向引
物 Lys—F：5 ．ATGGC ITrGTGGGCAATcAAAGcAC。3 和反向弓l物 Lys．R：5 ．TIAATCTGTITFCAA—ATCT—
GTYGT．3 ：
以Actin基因为内参，采用半定量 RT—PCR方法研究其在不同组织器官的表达模式。RT—PCR模板
来源于不同器官总RNA反转录合成的cDNA第一链，并根据持家基因Actin在不同器官中的PCR扩增
量调整 RT．PCR的起始模板用量。
PCR扩增条件为：94℃ 3 rain；94℃ 1 rain，56 45 S，72℃ 1 min，17～35个循环；72℃延
伸 10 rain：PCR产物进行 1．0％的琼脂糖凝胶电泳，根据扩增的 DNA条带的亮度来判断目的基因在
不同组织器官的表达水平。
2 结果与分析
2．1 辣椒 Gqr基 因序列分析结果
将 RT．PCR产物、5 ．RACE和 3’一RACE的 PCR产物克隆测序并进行拼接，将拼接后的序列在
NCBI上进行BLAST比对分析，结果如图 1所示。
该 eDNA序列包含一个完整的669 bp的开放读码框架 (open reading flame，ORF)，5 端有84 bp
的非翻译区 (untranslate region，UTR)，富含 A和 T，A和 T的总含量达70．24％；编码区编码一条
223个氨基酸残基的多肽，分子量 24 kD，等电点4．8l，其中含4O个赖氨酸和24个苏氨酸，分别占
整个编码氨基酸的17．9％和10．8％；3 端具有完整的PolyA尾。该基因已在 GenBank注册，登记序列
号为EU367999，命名为 r。
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1
70
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235
289
343
397
451
505
559
613
667
721
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图1 Cftr基因核酸序列及推断的氨基酸序列
推导氨基酸序列标示于相应核苷酸之下；非编码区用下划线标出；
表示终止密码子
Fig．1 Nueleotide sequence and the deduced amino acid sequence of the pepper Cflr gene
The deduced amino acid sequence is showed underneath the corresponding
nucleotide sequence；The un-coding region is underlined；
Stop code was indicated with ．
2．2 氨基酸序列的同源性比较与聚类分析结果
通过 NCBI同源搜索发现，CFLR与目前已经报道的马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白具有同源性 采
用 DNAMAN软件包及Mega(版本3．1)软件对该基因推导的氨基酸序列进行了同源性比较与聚类分
析．
经同源性比对发现 CFLR与来 自马铃薯花粉 的高赖氨酸蛋 白 ST一901(GenBank登录号为：
AAS17876)、GARP(GenBank登录号为：CAA65228)和 SBgLR (GenBank登录号为：AAR29265)
氨基酸序列同源性分别为 46．25％、43．32％和 51．42％；与来自番茄花粉中克隆的高赖氨酸 TSB
(GenBank登录号为：AAM53961)的氨基酸序列同源性为42．9％ (图2)。
由此可见，从辣椒花粉中克隆的高赖氨酸基因 r与从马铃薯和番茄中克隆的高赖氮酸基因的同
源性不是很高。同时，CFLR的氨基酸序列中也不含有马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白中的不完全重复序
列 V．V．E．K．K．N／E．E 、
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13 14 园 艺 学 报 35 卷
C F L R
S B gL R
G A R P
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C F L R
S B gL R
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T S B
C F L R
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K 工 E T V K D A
K P E T A K D A
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． ． A T D S K T D
． ． Q R Q T Q K Q I K V Q A W E Y G R K S V
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T T D S K T D
图 2 Cflr 基 因推 导 的氨 基酸序 列与 同源 氨基 酸序 列 的 比对 结 果
F ig． 2 A lignm entofthe deduced am ino acid sequen ce ofCflr w ith
hom ologous am ino acid sequence from potato and tom ato
112
201
190
205
198
213
223
211
239
217
23 5
聚类分析 结 果 (图 3 ) 显 示 ， 马 铃 薯 (S ola n um tuberosum ) 高 赖 氨 酸 蛋 白 S T - 901 与 马 铃 薯
(S ola num bertha ultii) 高赖氨酸蛋 白 G A R P 最 先聚类合并 ， 在进 化上 亲缘最 近 ， 接着与马 铃 薯 (S ola —
rtum tuberosum ) 的 S B gL R 蛋 白和 番茄 的 T S B 蛋 白聚 合 ， 而 与 C F L R 蛋 白最 后 聚合 ， 与它 们 的 亲缘
关 系较远 。
— —
— — 马铃薯 S ola num berthaultitG A R P
马铃薯 S olanum tube~osum S T - 901
马铃薯 S olanum lH berosum S B gL R
番茄 S olanum lycopersicu m T S B
辣椒 C apsicum frutescens C F L R
图 3 辣椒 C F L R 蛋 白序 列 与马铃薯和 番茄 中同源序 列 的聚类分 析
F ig． 3 C lustering ofthe deduced am ino acid sequence ofC F L R w ith
hom ologous aln ino acid sequence from pota to and tom ato
∞砣 n∞ 卫 ；2 豫 ∞ 甜％ 挖 舛％ 睨 ％ 博 " 弘砣
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9 期 孙晓波等 ： 辣椒 高赖氨酸蛋 白基 因 C．／／r 全长 cD NA 的克隆及其组 织表达 特征
2． 3 Cflr 基 因在不 同组 织 器官的表达特性分析
对 印 r 的组 织 、 器官的表达特性分析发 现 ， 印 r 基 因在辣椒 未成熟 花 药 、 成 熟花 粉 、 花瓣 、 茎 、
叶片和根 中均有表达 ， 在成熟花粉和花瓣 中的表达 丰度最高 ， 在叶片中表达量 明显 减少 ， 而在未成熟
花药 、 茎和根 中的表达量都极低 (图 4 )。
A
B
图 4 辣椒高赖氨酸 蛋 白基 因 (y》 在植株 不 同部位 的表达丰度 分析
A ． 持家基 因 A ctin 在不 同器官 中的 R T — P C R 扩增量 ；
B ． c，『r基 因在不 同器 官 中的 R T - P C R 扩增 量 ；
1 ． 未成熟花药 ； 2 ． 成熟花粉 ： 3 ． 花瓣 ；
4 ． 茎 ； 5 ． 叶片 ； 6 ． 根 。
F ig． 4 R T - P C R analysis oftranscriptlevels ofCflr gene in pepper im m ature anther
m atu re pollen I petal， stem 。 leafand root
A ． T he quantity ofR T - P C R products ofA ctin gene from different organs ；
B ． T he quantity ofR T - P C R products of卵 r gene from different organs ；
1 ． hn m ature an ther； 2 ． M atu ralpollen ； 3 ． P etal；
4 ． S tem ； 5 ． L eaf；6 ． R oot．
3 讨论
利用辣椒 卵 r 基 因预测的氨基 酸序列在 G en B ank中进行 同源搜索 ， 共得到 4 条同源序列 ， 分别为
马铃薯花粉特异性表达 的高赖氨酸蛋 白 S T ． 901 、 S B gL R 和 G A R P ， 以及 番茄花粉特异性 表达 的高赖氨
酸蛋 白 T S B 。 印 r 基 因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋 白基 因 cD N A 序列 的 同源 性 为 50％ ～ 60％ ， 氨基 酸
序列 的 同源性 为 4 0％ ～ 50％ 。 马铃薯的高赖氨 酸蛋 白基 因 (st- 901 ， ．s如 脯 ， sb4 01 ) 和 番茄 的高赖氨
酸蛋 白基 因 (tsb) 仅在马铃 薯和 番茄 的成熟 花 粉粒 中表达 ， 均属于 花 粉发育末期基 因 ， 可 能与花粉
成熟或花粉管的生 长有关 。 其蛋 白中均 含有 不 完全 重 复序列 V — V ． E - K — K — N／E — E ， 其核心 序列 K - K — N／
E ． E ， 类似于小 鼠微管结合蛋 白 M A P I B 的微管结合位点 (Noble et a1． ， 1989 )， 推测可 能参与细胞骨
架组 织 。 而 C F L R 蛋 白虽 然与马铃 薯和番茄 的高赖氨酸蛋 白具 有 一 定的同源性 ， 但其氨基 酸 的相似性
主要集 中在蛋 白的 N 端和 C 端 ， 氨基酸序列 中没 有 V — V — E - K — K — N／E ． E 的不 完全 重 复序列 ， 同时该 基
因不 仅在成熟 花粉 中有表达 ， 在辣椒 的花瓣与叶片 中也 均有较高的表达量 。 根据 以上 蛋 白结构与组 织
器官表达 特异性 的研 究 ， 作者推断 (何 基 因与马铃薯和 番茄 的高赖氨酸蛋 白基 因虽然在序列 上具 有 一
定 的相似性 ， 但可能具有不 同的功能 ， 是 一 个未知功能的新基 因 。
够 r 基 因在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高 ， 在叶片中表达量 明显 减少 ， 而在未成熟花药 、 茎
和根 中的表达量极少 ， 这说明 鲫 r 基 因的表达存在着组织器官特异性 ， 该蛋 白在辣椒 的成熟花粉 、 花
瓣 和叶片组 织 中行使 一 定 的功能 ， 因此 (砂 基 因的克隆与进 一 步 的功能研究 ， 可为研究植物器官发育
的分子机制提供有用 的信息 。
C F L R 蛋 白中赖氨酸 的含量 高达 21 ． 2％ ， 高于 目前 已 报道 的来源 于 茄科植 物马铃薯和 番茄高赖氨
酸蛋 白 G A R P 、 S T - 901 、 S B gL R 和 T S B (赖氨酸含量 分别为 18． 6％ 、 17 ． 8％ 、 18． 9％ 和 18． 0％ )， 及
四棱豆 中的高赖氨酸蛋 白 L Y S (赖氨酸含量为 10． 8％ )， 是 目前已 知的赖氨酸含量最高的天 然存在的
蛋 白 ； C F L R 为非花粉特异性表达 蛋 白 (G A R P 、 S T - 901 、 S B gL R 和 T S B 均为花 粉特异性 表达蛋 白)，
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1316 园 艺 学 报 35卷
用于植物转基因后不会产生容易引起人过敏反应的蛋白，这些特性使 成为通过基因工程手段改良
作物营养品质的一个重要候选基因。
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《植物遗传资源学报》征订启事
《植物遗传资源学报》是中国农业科学院作物科学研究所和中国农学会主办的学术期刊，为中国科技核心期刊、
全国优秀农业期刊，中国科技论文统计源期刊、中国科学引文数据库来源期刊 (核心期刊)、中国核心期刊 (遴选)
数据库收录期刊、中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊，又被 《中国生物学文摘》和中国生物学文献数据库 、
中文科技期刊数据库收录。据中国期刊引证研究报告统计，2007年度 《植物遗传资源学报》影响因子达0．914。
报道大田作物、园艺作物、林用植物、草类植物及经济植物种质资源考察 、收集、保存、评价、利用、创新，信息
学、管理学等；起源、演化、分类等系统学；基因发掘、鉴定、克隆、基因文库建立、遗传多样性等方面的研究成果。
季刊，大 l6开本，128页。定价 2O元，全年 80元。各地邮局发行，邮发代号：82—643。国内刊号 CN11—
4996／S，国际统一刊号 1SSN1672—1810。本刊编辑部常年办理订阅手续，如需邮挂每期另加3元。
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