全 文 ：福建林学院学报　2008, 28(3):276-280
JournalofFujianCollegeofForestry
第 28卷 第 3期
2008年 7月
收稿日期:2008-02-25　　修回日期:2008-03-26
基金项目:四川省 “十一五 ”重点公关基金资助项目(2006YZGG-10-07)。
作者简介:蒋瑶(1982-),女 ,四川罗江人 , 硕士研究生 ,从事植物分子生物学研究。通讯作者胡尚连(1966-),女 ,河北秦皇岛人, 教授 ,从
事植物生理与生物技术研究。
四川省不同地区梁山慈竹 RAPD
与 ISSR遗传多样性研究
蒋　瑶 1 , 胡尚连 1 , 陈其兵 2 , 卢学琴 1 , 李　益 1 , 曹　颖1 , 孙　霞 1
(1.西南科技大学生命科学与工程学院 ,四川 绵阳 621010;
2.四川农业大学林学园艺学院 ,四川 雅安 625014)
摘要:应用随机扩增多态性 DNA(RAPD)和简单重复序列区间(ISSR)对四川省 6个不同地区梁山慈竹进行遗传多样性分
析。 研究表明 ,筛选出的 6个RAPD引物扩增出多态性条带 57条 , 多态性高达 95%;筛选出的 6个 ISSR引物扩增出多态性
条带 34条 ,多态性为 58.64%。利用 Popgen32软件进行聚类分析 , 结果表明 ,聚类结果可区分不同地区的梁山慈竹 , 其遗传
距离分别为 0.265 7-0.958 9和 0.109 2-0.563 9, 且树状聚类图分类总体趋势一致 ,表明RAPD和 ISSR分子标记结合是一
种在 DNA水平上有效地检测梁山慈竹遗传结构的优良方法。
关键词:梁山慈竹;遗传多样性;RAPD;ISSR;四川
中图分类号:S795 文献标识码:A 文章编号:1001-389X(2008)03-0276-05
StudiesongeneticdiversityofDendrocalamusfarinosusfromthedifferent
regionsinSichuanProvincebyRAPDandISSRmarkers
JIANGYao1 , HUShang-lian1 , CHENQi-bing2 , LUXue-qin1 , LIYi1 , CAOYing1 , SUNXia1
(1.ColegeofLifeScienceandEngineering, SouthwestUniversityofScienceandTechnology, Mianyang, Sichuan621010,
China;2.ForestryandHorticulturalColege, SichuanAgricultureUniversity, Ya′an, Sichuan625014, China)
Abstract:ThegeneticdiversityandgeneticrelationshipsinDendrocalamusfarinosusfrom6 differentregionsinSichuanProvince
werestudiedusingrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)andinter-simplesequencerepeat(ISSR)amplificationmarkers.
Theresultsshowedthat6 RAPDand6 ISSRprimersgenerated57 and34 bands, ofwhichthepercentageofpolymorphicbands
(PPB)was95% forRAPDsand58.64% forISSRs.TheUPGMAanalysisofPopgen32 programshowedthefolowingresults:the
geneticdistancerangedfrom0.265 7to0.916 3forRAPDsand0.109 2to0.563 9forISSRs.Thetrendsinclassificationofdendro-
gramseemstobesame, ithasprovedthatRAPDandISSRmolecularmarkerswereagoodmethodtodetecteefectivelythegenetic
structureofD.farinosusinDNAlevel.
Keywords:Dendrocalamusfarinosus;geneticdiversity;randomamplifiedpolymorphicDNA;inter-simplesequencerepeat;
SichuanProvince
聚合酶链式反应(randomamplifiedpolymorphicDNA, RAPD)和简单序列重复间扩增多态性 (inter-
simplesequencerepeat, ISSR)2种分子标记技术在植物学研究中被广泛地用于遗传多样性研究 [ 1] 、遗传资
源分类 [ 2] 、品种纯度鉴定与杂交育种 [ 3] 、遗传图谱构建 [ 4] 、突变检测与基因比较 [ 5]等方面。 RAPD和 ISSR
技术在竹子研究领域也得到广泛应用:Laietal[ 6]利用 RAPD技术对分布于台湾岛内的 176个毛竹样品进
行研究 ,共鉴定出 9个毛竹无性系 ,并认为分布在台湾的大部分种都属于同一无性系 ,其它 8个无性系可
能是由于引种后发生体细胞变异而产生的;吴益民等 [ 7]借助 RAPD技术分析了孝顺竹(Bambusamulti-
plex)、凤尾竹(Bambusamultiplex)、绿竹(Dendrocalamopsisoldhami)和白绿竹(Bambusaoldharni)4个品种
的 DNA多态性 ,初步构成反映种特征的 RAPD指纹图谱 ,为竹种鉴定提供了科学依据;Malayetal[ 8]利用
RAPD和序列特征化扩增区技术 (sequencecharacterizedamplifiedregion, SCAR)扩增巴苦竹 (Bambusa
balcooa, Bb)和马甲竹(Bambusatulda, Bt)片段 ,其中 Bb809和 Bt609是经 RAPD和 SCAR的扩增产物杂交所
DOI :10.13324/j.cnki.j fcf.2008.03.011
得的特异性条带 。梁山慈竹(Dendrocalamusfarinosus)为牡竹属竹亚科植物 ,是四川省特有的丛生竹种之
一 ,耐寒性较强 ,可作为优质高产纸浆用材的原料 ,具有较好的水土保持作用 ,能够明显地减少地表径流和
泥沙侵蚀。有关梁山慈竹遗传多样性的研究鲜见报道 ,前人对梁山慈竹的研究主要集中在生长规律及其
在退耕还林中的作用 [ 9-10] ,但缺乏从分子生物学角度研究其遗传背景与变异 。
因此 ,以四川省 6个不同地区的梁山慈竹为研究对象 ,通过 RAPD和 ISSR分子标记 ,试图在分子水平
上揭示不同地区梁山慈竹遗传变异 ,探讨不同地区梁山慈竹之间的遗传多样性 ,为梁山慈竹种质资源的遗
传研究及纸浆用竹的遗传改良与开发利用提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
以四川省具有代表性的 6个不同地区的梁山慈竹为材料 ,对每个地区具有代表性的居群梁山慈竹中
的 10丛竹 ,除去灰尘等杂物和露珠 ,分别随机采取新鲜幼嫩的叶片 10-20 g,置于变色硅胶袋内 ,快速干
燥封存 ,带回实验室保存于 -80 ℃冰箱中备用 。
6个不同地区:1号地区为宜宾市江安县(L-YBJA,东经 105°08′,北纬 28°62′);2号地区为宜宾市竹
海县(L-YBZH,东经 104°09′,北纬 28°05′);3号地区为眉山市东坡区思蒙镇(L-MSSM,东经 103°22′,北纬
29°55′);4号地区为泸州市叙永县向林乡(L-LZXY,东经 105°46′,北纬 28°14′);5号地区为泸州市纳溪区
上马镇(L-NXSM,东经 105°12′,北纬 28°45′);6号地区为雅安市雨城区北郊乡(L-YAYC,东经 103°02′,北
纬 30°12′)。
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取与纯化　采用改良的十六烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate, SDS)法提取梁
山慈竹叶片基因组 DNA[ 11] 。取 0.2 g竹叶置液态氮中迅速研磨成粉 ,将冻粉转入 1.5 mL离心管中 ,加入
预热的 650μL的 SDS裂解缓冲液 [ 2%SDS, 0.25 mol乙二胺四乙酸 (EDTA), 0.1 molTris-HCl, 0.15 mol
NaCl]和 65μL5%β-巯基乙醇混匀 ,于 65 ℃水浴 30min,再加入 3 μLRNaseA(10 mg· mL-1),于 65
℃水浴 10min;取上清 ,加入 1 /3体积的 5molKAc(pH5.2),冰浴 30-60min, 4 ℃ 12 000r· min-1离心
10 min;取上清 ,加入等体积的酚 、氯仿 , 4 ℃ 12 000 r· min-1离心 10 min;取上清 ,加入等体积氯仿抽提
(若抽提过程后发现蛋白含量较多 ,可进行再次抽提),加入等体积异丙醇或 2倍体积无水乙醇 ,醇沉 1 h,
离心 ,弃上清。将沉淀物用 1 mL体积分数为 70%乙醇清洗 ,自然风干 ,加入 30-50 μL的 1 ×TE溶解
DNA, -20℃保存 。DNA经 1%琼脂糖凝胶电泳 ,检测其条带的质量 ,并用紫外双光束分光光度计测定
DNA浓度和纯度 ,最后将分离得到的 DNA样品稀释后于 -20℃下保存 ,备用。
1.2.2　RAPD扩增　本研究采用梁山慈竹 6个样品对 29个 RAPD引物(表 1,由北京奥科生物技术有限
责任公司合成)进行筛选 ,并对其中能扩增出可重复性条带的 6个引物进一步分析。 PCR扩增反应体系
(20 μL)最终确定为:2 μL10×PCRbufer, 1.6μLMgCl2(25 mmol), 1.6μLdNTPmix(2.5mmol), 0.6μL
引物(10μmol), 0.5μL模板(100 ng·μL-1), 0.15μLrTaq(5 U·μL-1)(大连宝生物公司), 13.55 μL
ddH2O。 PCR扩增反应于 DNAEnginePTC-200PCR仪(Bio-Rad公司)中进行 ,同时测试了 RAPD最佳退
火温度 ,经优化的 PCR扩增程序为:94℃预变性 3min, 94 ℃变性 30s, 36℃退火 1min, 72 ℃延伸 2min,
共 40个循环 , 72 ℃完全延伸 10 min。反应产物在含有 EB的 1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测 ,用 DL2 000
的 DNAladder(大连宝生物公司)为分子量标记 ,在 Bio-Rad凝胶成像系统下观察拍照 。
1.2.3　ISSR扩增　采用梁山慈竹 6个样品对 12个 ISSR引物(表 1)进行筛选 ,并对其中能扩增出可重复
性条带的 6个引物进一步分析。 PCR扩增反应体系(20 μL)最终确定为:2 μL10×PCRbufer, 1.6 μL
MgCl2(25mmol), 2μLdNTPmix(2.5mmol), 0.6μL引物(10μmol), 0.5μL模板(100ng· μL-1), 0.4μL
甲酰胺(2%), 0.15 μLrTaq(5U· μL-1), 12.75 μLddH2O。 PCR扩增反应于 DNAEnginePTC-200 PCR
仪中进行 ,同时优化了 ISSR最佳退火温度 。经优化的 PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性
30 s, 48℃退火 45 s, 72℃延伸 90 s,共 40个循环 , 72 ℃完全延伸 7 min。反应产物在含有 EB的 1.5%琼
脂糖凝胶中电泳检测 ,用 DL2 000的 DNAladder为分子量标记 ,在 Bio-Rad凝胶成像系统下观察拍照。
373　第 3期 蒋瑶等:四川省不同地区梁山慈竹 RAPD与 ISSR遗传多样性研究
表 1　RAPD与 ISSR引物 1)
Table1　PrimersofRAPDandISSRanalysisusedinthestudies
引物 序列(5′※3′) 引物 序列(5′※3′) 引物 序列(5′※ 3′)
RAPD OPH-19 CTGACCAGCC
OPAA-04＊ AGGACTGCTC OPU-14 TGGGTCCCTC OPK-09＊ CCCTACCGAC
OPB-06＊ TGCTCTGCCC OPU-18 GAGGTCCACA OPN-14＊ TCGTGCGGGT
OPB-07＊ GGTGACGCAG OPY-15 AGTCGCCCTT OPU-12 TCACCAGCCA
OPC-05 GATGACCGCC OPY-18 GTGGAGTCAG D3 GTCGCCGTCA
OPC-06 GAACGGACTC OPY-19 TGAGGGTCCC C5 GATGACCGCC
OPC-08＊ TGGACCGGTG OPZ-03 CAGCACCGCA RAPD-R8 CTGGGCACGA
OPC-18 TGAGTGGGTG RAPD-R2 AATGGCGCAG RAPD-R9 ACGCCAGAGG
OPC-20 ACTTCGCCAC RAPD-R3 GAGGATCCCT B17 AGGGAACGAG
OPH-13 GACGCCACAC RAPD-R5 TGTCTGGGTG RAPD-R7 GGCGGATAAG
RAPD-R6 ACACCCCACA
ISSRa
ISSR-1 CCAGTGGTGGTGGTG ISSR-15 GSGGTGTGTGTGTGT ISSR-9＊ CCCGTGTGTGTGTGT
ISSR-4＊ GCACACACAC ISSR-16＊ BDBCACACACACACA ISSR-10＊ GCGACACACACACACA
ISSR-5＊ CTCTCTCTCTCTCTCTRC ISSR-18＊ CSCGAGAGAGAGAGA ISSR-20 CTCTCTCTCTCTCTCTRG
ISSR-8 DBDGAGAGAGAGAGAGA ISSR-19 GCWGAGAGAGAGAGAG ISSR-21 VHVGTGTGTGTGTGTGT
　　1)aB:C/G/T;D:A/G/T;V:A/C/G;H:A/C/T;W:A/T;＊为本试验RAPD与 ISSR所筛选的引物。
1.2.4　数据分析　RAPD与 ISSR均为显性标记 ,同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有
同源性 ,属于同一位点的产物并按扩增阳性(1)和扩增阴性(0)手工记录电泳谱带 ,形成 RAPD与 ISSR型
数据矩阵用于进一步分析 。用 Popgene32软件(版本 1.32)计算 Nei′s无偏估计遗传距离和遗传一致度 ,通
过不加权算数平均法(unweightedpairgroupmethodwitharithmetic, UPGMA)构建系统发生树 , 并采用
NTSYS软件绘制树形图。
3　结果与分析
3.1　引物筛选与 PCR扩增
经过 2次筛选 ,从 29条 RAPD引物和 12条 ISSR引物中分别得到 6条扩增产物清晰且多态性强的引
物用于遗传差异分析(表 1中用星号标记的引物)。
6条 RAPD引物共得到随机扩增条带 60条 ,分子量基本分布在 250-2 000bp之间 ,其中多态性谱带
57条 ,多态性高达 95%,表明四川省不同地区的梁山慈竹遗传多样性水平比较高。
6条 ISSR引物共得到随机扩增条带 58条 ,分子量大小分布在 300-2000bp之间 ,其中多态性条带为
34条 ,多态性为 58.64%,表明四川省不同地区的梁山慈竹 DNA多态性丰富 。
因此 ,本试验采用 2种标记同时在 DNA水平上检测四川省不同地区梁山慈竹的遗传多样性 ,更能有
效地反映遗传变异 ,有助于对其种质资源情况的评价 ,进而采取相应的措施保护四川省竹种资源 。
3.2　遗传结构
表 2　梁山慈竹的遗传指数
Table2　IndicesofgeneticsinD.farinosus
分子标记 Na Ne H I
RAPD 1.950 0 1.616 9 0.361 1 0.535 7
ISSR 1.617 0 1.310 6 0.198 0 0.306 5
　　利用 Popgen32软件分析分别得到梁山慈竹 RAPD
和 ISSR的遗传结构的 4个指数:等位基因数(observed
numberofaleles, Na)、有效等位基因数 (efective
numberofaleles, Ne)、Nei′s基因多样性指数(Nei′s
genediversity, h)、Shannon信息指数(Shannon′sinfor-
mationindex, I)(表 2)。反映不同地区梁山慈竹的遗传多样性丰富 ,处于较高的水平 。
3.3　聚类与遗传关系分析
根据 Neietal[ 12]的公式 ,利用 Popgen32软件得出 6个不同地区梁山慈竹之间的遗传距离(表 3)。
四川省 6个不同地区之间梁山慈竹的 RAPD遗传距离(表 3对角线下方)在 0.265 7-0.916 3之间和
ISSR遗传距离(表 3对角线上方)在 0.109 2-0.563 9之间 。由此看出 , ISSR遗传距离的范围比 RAPD遗
374 福　建　林　学　院　学　报 第 28卷　
传距离小 ,说明 ISSR更适合在 DNA水平上检测梁山慈竹的遗传多样性 ,有助于开发梁山慈竹资源。其中
遗传距离最小的是 L-LZXY和 L-NXSM,遗传距离最大的也是 L-YBJA和 L-YAYC,表明 ISSR与 RAPD标
记所获得的遗传距离最小值与最大值是相一致的。
表 3　不同地区梁山慈竹遗传距离
Table3　GeneticdistanceofD.farinosusfromthediferentregions
样品地区 1 2 3 4 5 6
1 0.168 6 0.210 3 0.322 8 0.422 9 0.563 9
2 0.287 7 0.189 2 0.168 6 0.253 8 0.371 6
3 0.539 0 0.510 8 0.253 8 0.396 9 0.476 9
4 0.727 0 0.405 5 0.510 8 0.109 2 0.299 2
5 0.798 5 0.628 6 0.628 6 0.265 7 0.346 9
6 0.916 3 0.660 4 0.958 9 0.597 8 0.380 8
　　在 UPGMA方法构建的 RAPD系统树图中可见优先聚类的 3个类群(图 1):类群 Ⅰ由 L-LZXY和 L-
NXSM组成;类群Ⅱ由 3个系组成(L-YBJA、L-YBZH和 L-MSSM、L-YBJA和 L-YBZH先聚在一起 ,再与 L-
MSSM进行聚类);类群 Ⅲ由类群 Ⅰ 、类群Ⅱ再与 L-YAYC聚类。
在 UPGMA方法构建的 ISSR系统树图中可见优先聚类的 2个类群(图 2):类群 Ⅰ(L-LZXY、L-NXSM
和 L-YAYC)和类群Ⅱ(L-YBJA、L-YBZH和 L-MSSM)。
　　由此看出 ,同一地区的梁山慈竹亲缘关系相对较近 ,即相同纬度的梁山慈竹会优先聚在一起 ,不同地
区之间的梁山慈竹其亲缘关系相对较远 ,主要因其纬度的差异。
4　讨论
近年来 RAPD和 ISSR主要应用于许多珍稀和濒临灭绝物种的遗传研究 [ 13] ,而竹子传统的形态学分
类方法又不能揭示遗传物质本身 ,利用分子标记分析对种内变异和亲缘关系的研究具有很大优势。因此 ,
DNA分子标记被越来越多的竹类工作者用来分析竹种间的亲缘关系的研究 。结果表明 ,不同的分子标记
其遗传多样性是有差异的 ,同一分子标记不同地区之间梁山慈竹遗传多样性也是不同的 ,可能是由于纬度
不同 、引物不同或进化过程模式不同而造成的。利用 RAPD和 ISSR分子标记进行梁山慈竹亲缘关系研
究 ,指纹图谱分析和基因定位等研究具有一定的应用前景。
地理差异是影响梁山慈竹遗传变异的一个主要因素 , Hamricketal[ 14]分析了 409个物种 ,阐明了大致
的趋势 ,表明地理差异与遗传多样性是正相关的。本试验研究表明 ,不同纬度的梁山慈竹之间存在遗传多
样性的差异 ,认为这种差异与梁山慈竹所处的地理环境有关 。
很多研究发现 , RAPD与 ISSR技术都可以在 DNA水平上检测遗传多样性 ,但普遍认为 ISSR技术比
RAPD技术检测的多态性更多 [ 11] 。本研究采用 ISSR标记检测的多态性却低于 RAPD,这与普遍规律不一
致 ,可能是由于引物差异或 2种标记之间本身的差异。鉴于竹类植物种以下等级从形态学上分类难度较
大 ,利用 RAPD与 ISSR相结合的分子标记 ,可以提高分类的可靠性 。
参考文献
[ 1] 刑新婷 , 傅懋毅 ,费学谦 , 等.撑篙竹遗传变异的 RAPD分析 [ J] .林业科学研究 , 2003, 16(6):655-660.
375　第 3期 蒋瑶等:四川省不同地区梁山慈竹 RAPD与 ISSR遗传多样性研究
[ 2] 高丽娜 , 陈雅君 ,高丽娟 , 等.草地早熟禾种质资源遗传多样性的 RAPD鉴定与分类研究 [ J] .东北农业大学学报 , 2007,
38(3):325-329.
[ 3] 何予卿 , 张宇 , 孙梅 , 等.利用 ISSR分子标记研究栽培稻和野生稻亲缘关系 [ J] .农业生物技术学报 , 2001, 9(2):
123-127.
[ 4] 宣继萍 , 章镇 ,房经贵 , 等.苹果品种 ISSR指纹图谱构建 [ J] .果树学报 , 2002, 19(6):421-423.
[ 5] 任祎 , 牛西午 ,王世研 , 等.氮离子束注入谷子种子后代基因组的 RAPD分析 [ J] .核农学报 , 2006, 20(4):259-262.
[ 6] LaiCC, HsiaoJY.GeneticvariationofPhylostachyspubescences(Bambusoideaepoaceae)inTaiwanbasedonDNApoly-
morphisms[ J] .BotanicalBuletinAcademiaSinica, 1997, 38:145-152.
[ 7] 吴益民 , 黄纯农 ,王军晖.4种竹子的 RAPD指纹图谱的初步研究 [ J] .竹子研究汇刊 , 1998, 17(3):10-14.
[ 8] MalayD, SamikB, AmitaP.GenerationsandcharacterizationofSCARsbycloningandsequencingofRAPDproducts:astrat-
egyforspecies-specificmarkersdevelopmentinbamboo[ J] .AnnalsofBotany, 2005, 95(5):835-841.
[ 9] 孙鹏 , 马光良 ,王启和 , 等.四川乡土和引进丛生竹的生长表现及竹丛营养空间拓展分析 [ J] .竹子研究汇刊 , 2005,
24(4):18-23.
[ 10] 笪志祥 ,楼一平 , 董文渊 ,等.梁山慈竹在退耕还林中的水土保持效应研究 [ J] .浙江林业科技 , 2007, 27(3):22-27.
[ 11] WuCJ, ChengZQ, YinSH, etal.GeneticdiversityamongandwithinpopulationsofOryzagranulatefromYunnanof
ChinarevealedbyRAPDandISSRmarkers:implicationsforconservationoftheendangeredspecies[ J] .PlantScience,
2004, 167:35-42.
[ 12] NeiM, LiWH.Mathematicalmodelforstudyinggeneticvariationintermsofrestrictionendonucleases[ J] .ProcNatlAcad
SciUSA, 1979, 76(10):5 269-5 273.
[ 13] 彭艳秋 ,邵剑文 , 张小平 ,等.珍稀濒危植物安徽羽叶报春遗传多样性的 RAPD分析 [ J] .云南植物研究 , 2007, 29(5):
549-553.
[ 14] HamrickJL, GodtMJW.Effectsoflifehistorytraitsongeneticdiversityinplantspecies[ J] .PhilTtansRoyLondonBiol
Sci, 1996, 351:1 291-1 298.
(责任编辑:江　英)　　
376 福　建　林　学　院　学　报 第 28卷