全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 May 2010, 29(3): 379-388

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：河南省教育厅自然科学基金（No. 2007180024）
*Corresponding author. E-mail: qliyou@henau.edu.cn
收稿日期: 2009-10-19, 接受日期: 2009-12-24

中国栽培糙皮侧耳品种体细胞不亲和性实验与 RAPD 分析结
果的比较
戚元成 张小强 高玉千 申进文 邱立友*
河南农业大学生命科学学院 郑州 450002



摘 要：对收集的糙皮侧耳 Pleurotus ostreatus 19 个栽培菌株在贫营养的半 PDA 培养基中配对进行拮抗线实验，考察其相互
间体细胞不亲和性。结果表明，此 19 个菌株间出现拮抗线的比率是 100%，形成的拮抗线类型可分为菌丝集结型（A 型）、
隔离带型（B 型）和暗线型（D 型）三类，出现的比例分别是 24.9%、23.7%和 51.4%。显微观察暗线型拮抗线区域有菌丝
自融形成的溶菌沟，另 2 种拮抗线中没有菌丝自溶。以拮抗线类型分别作为变量进行 NTSYS-PC 聚类分析，从相似性系数
0.48 处截断可将其分为 3 大类，第一类包括 802 和黑平王等 9 个菌株；第二类包括苏引 6 号和江都 71 等 6 个菌株；第三类
包括夏王 40 和早秋高丰等 4 个菌株。应用 13 条随机引物扩增此 19 株糙皮侧耳菌株总 DNA，共扩增出 917 条不同分子量的
DNA 条带。RAPD 聚类分析表明,这些菌株的遗传相似性高达 85%以上。从相似性系数 0.86 处截断，也可将这些菌株分为 3
大类，第一类包括了 802 和黑平王等 17 个菌株；第二类仅包括推广一号和夏王 40 两个菌株；第三类只有 831 一个菌株。两
种方法的聚类分析结果没有相关性。因此，拮抗反应可以作为评价糙皮侧耳栽培菌株之间遗传多样性的方法之一，但与基因
组 DNA 指纹多样性分析结果并不完全吻合，更不能代替分子指纹分析。
关键词：遗传多样性，拮抗线实验，NTSYS-PC 分析

Comparison between somatic incompatibility and RAPD analysis of
cultivated Pleurotus ostreatus in China
QI Yuan-Cheng ZHANG Xiao-Qiang GAO Yu-Qian SHEN Jin-Wen QIU Li-You*
College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Nineteen China cultivated strains of Pleurotus ostreatus were antagonistically paired on poor nutrient half-PDA plates.
The rate of barrage formation was 100% among these strains. The barrages could be identified into three types: raised aggregate of
hyphae (Type A), clear zone (Type B), and dark line (Type D). The formation rate of the three barrage types was 24.9%, 23.7% and
51.4%, respectively. The bacteriolytic channel formed from hyphal self-digestion was found in the area of dark line barrage by
microscopic observation, while no hyphal self-digestion was found in the other two barrage types. NTSYS-PC clustering analysis
DOI:10.13346/j.mycosystema.2010.03.020
380 Mycosystema
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using barrage type as a variable indicated that the 19 strains of Pleurotus ostreatus were divided into three groups cut in similar
coefficient at 0.48. First group included 9 strains, e.g. 802 and Hei Pin Wang; second group 6 ones, e.g. Su Yin 6 and Jiang Du 71;
third group 4 ones, e.g. Xia Wang 40 and Zao Qiu Gao Feng. 917 RAPD markers were yielded by using 13 random primers to
amplify the total DNA of the 19 strains. RAPD analysis showed that these strains had high identity over 85%. These strains were also
divided into three groups cut in similar coefficient at 0.86. First group included 17 strains, e.g. 802 and Hei Pin Wang; second group
included 2 ones, Tuiguang 1 and Xia Wang 40; third group included only one, 831. There was no correlation between the results of
the two clustering analysis. The results indicated that barrage test was a useful method for analyzing population structure and genetic
diversity of intraspecies fungi, but it could not replace the other DNA finger methods for genotype or relatedness identification.
Key words: genetic diversity, barrage test, NTSYS-PC clustering analysis


在无性阶段，丝状真菌通过个体间融合形成新
的异核体菌丝来实现基因重组，通过体细胞不亲和
性系统来实现非己识别，一方面在维持种内的基因
重组，维持个体在遗传、生理和生态等方面的特性
上起作用（Lind et al. 2007）；另一方面，它赋予真
菌一种保护机制，避免其受到强势基因、侵染性因
子（如真菌病毒、致死质粒等）的侵袭（Debets et al.
1994；Cortesi et al. 2001）。体细胞不亲和性（somatic
incompatibility，SI）是一种在同种的遗传型不同的
组织接触时防止融合和重组的机制（Worrall 1997），
可以在菌丝融合的前、中或后起作用（Leslie 1993；
Glass et al. 2000；Micali & Smith 2003；Lind et al.
2007 ）， 在 子 囊 菌 中 又 叫 异 核 体 不 亲 和 性
（heterokaryon incompatibility，HI）或营养不亲和
性（vegetative incompatibility，VI）。
体细胞不亲和性与 SI 位点的遗传差异有关。
SI 位点的差异越大，不亲和性反应的强度如色素和
气生菌丝的数量就随之增加（Caten 1972）。子囊菌
的异核体不亲和性位点（het）由不连锁的二等位基
因或多等位基因组成，有的种如粗糙脉孢菌
Neurospora crassa 有 11 个 het 位点（Glass et al.
2000；Micali & Smith 2006），有的种如构巢曲霉
Aspergillus nidulans 有 8 个 het 位点（Dales & Croft
1983；Anwar et al. 1993）。这些 het 位点组成等位
系统或非等位系统控制 VI。在等位系统控制下，只
有个体间所有的不亲和位点均相同，才能形成稳定
的异核体菌丝；否则，只要存在一个位点的不相同
就会引发不亲和反应，类似于细胞程序性死亡
（PCD）的过程：融合菌丝及其邻近细胞发生细胞
质颗粒化，隔膜孔被堵塞，细胞质产生液泡，随着
液泡的破裂，蛋白酶和一些降解的酶类被释放到细
胞内，引起细胞的解体，该过程可以在菌丝融合后
30min 内完成（Leslie & Zeller 1996；Jacobson et al.
1998；Konopleva et al. 1999；Bursch 2001）。在非
等位系统控制下，两个不同的不亲和位点的特定基
因产物之间发生相互作用，引发不亲和反应（Bursch
2001）。相对于子囊菌，担子菌 SI 的遗传学研究还
相当薄弱，尚没有 SI 基因被克隆或鉴定。已有的研
究表明，控制 SI 的基因数量可能比子囊菌要少。松
根异担子 Heterobasidion annosum 估计有 3－4 个 SI
基因（Hansen et al. 1993）；糙皮侧耳 Pleurotus
ostreatus 和梭柄金钱菌 Collybia fusipes 有 3 个或以
上的 SI 基因（Marcais & Delatour 2000）；松干基褐
腐病菌Phellinus weirii仅有一个SI基因（Rizzo et al.
1995）；奥氏蜜环菌 Armillaria ostoyae 有 2 个紧密
连锁的 SI 基因（Marcais & Delatour 2000）；
Amylostereum areolatum 至少有 2 个多等位 het 位
点（van der Nest et al. 2008）。
确定丝状真菌体细胞不亲和的方法有拮抗线
实验、异核体不亲和性检验和部分二倍体分析
（Micali & Smith 2003）。在以上 3 种方法中，拮抗
线实验最为简便。对大量野外分离菌株的研究表
明，不形成拮抗线、体细胞亲和的菌株具有相同的
基因型，体细胞不亲和的菌株其基因型不同，认为
体细胞亲和的野生菌株具有相同的基因型（Worrall
1997；Stenlid & Vasiliauskas 1998；Giovannetti et al.
2003）。所以，拮抗线实验又广泛用于丝状真菌种
内菌株的鉴定、分类（Rayner & Todd 1979；Rayner
Vol.29 No.3 381
菌物学报
1991；陈春涛和姚占芳 1996；Johannesson & Stenlid
2004；唐传红等 2005；王磊等 2006）或是否同种
异名（陈强等 2007）。然而，也有许多实验结果与
以 上 结 果 不 一 致 。 在 栗 褐 暗 孔 菌 Phaeolus
schweinitzii和粉肉层孔菌Fomes cajanderi中发现形
态明显不同的菌株是体细胞亲和的（Adams & Roth
1967；Barrett & Uscuplic 1971）。体细胞亲和的二株
蜜环菌 Armillaria 菌株的一个交配型位点是不同的
（Korhonen 1978；Kile 1983）。在点柄粘盖牛肝菌
Suillus granulatus（Jacobson et al. 1993）和糙皮侧
耳中，菌株 A 与 B、C 亲和，但 B 与 C 之间则不亲
和。真姬菇 Hypsizygus marmoreus 栽培菌株 1、8
和 12 之间，以及 3、4 和 5 之间同样有相似的结果，
且体细胞亲和的菌株的酯酶同工酶、多酚氧化酶同
工酶、过氧化物酶同工酶和全蛋白电泳谱带有明显
差异（刘蕾等 2008）。点柄粘盖牛肝菌（Jacobson et
al. 1993 ）、板栗疫病 Cryphonectria parasitica
（Wronski et al. 1997）和血红韧革菌 Stereum
sanguinolentum（Stenlid & Vasiliauskas 1998）体细
胞亲和的菌株其 RAPD 标记亦明显不同。而
Phomopsis subordinaria 体细胞不亲和性菌株则具
有相同的 DNA 标记（Meijer et al. 1994）。
本研究对收集的 19 个糙皮侧耳栽培菌株进行
了拮抗线实验和 RAPD 分析，应用 NTSYS-PC 聚类
分析软件将该两种方法得到的结果分别构建了聚
类树状图，并对两个聚类树状图进行了相关性分
析。结果表明，我国栽培糙皮侧耳品种间的拮抗线
实验结果和 RAPD 分析不一致。
1 材料与方法
1.1 菌种
实验用糙皮侧耳菌株和侧耳属其他种菌株列
于表 1。
1.2 培养基和接种物制备
PDA 培养基，将马铃薯削皮称取 200g，切成
小块于 1,000mL 自来水中煮沸再煮 30min，用四层
纱布过滤，用自来水补足 1,000mL，加入 20g 葡萄
糖，15g 琼脂粉混匀，pH 值自然，于 121℃高压灭
菌 30min。半 PDA 培养基，PDA 培养基中马铃薯
用量减半。马铃薯葡萄糖液体培养基，PDA 培养基
表 1 实验用糙皮侧耳菌株和其他食用菌菌株
Table 1 Strains of Pleurotus ostreatus and other fungal strains
编号
No.
菌株
Strain
来源
Origin

糙皮侧耳
Pleurotus ostreatus
1 802
2 831
3
黑平王
Hei Ping Wang
4 苏引 6 号 Su Yin 6
5 江都 71 Jiang Du 71
6 西德 99 Xi De 99
7 1300
8 推广一号 Tui Guang 1
9 夏王 40 Xia Wang 40
10 9400
11
江都 5178
Jiang Du 5178
12
早秋高丰
Zao Qiu Gao Feng
13 高抗 48 Gao Kang 48
14 天达 300 Tian Da 300
15 秋抗 68 Qiu Kang 68
16 农友 1 号 Nong You 1
17 抗病 2 号 Kang Bing 2
18 PC－89
19 江都 109 Jiang Du 109
20
白灵菇
P. nebrodensis
河南省农业科学院食用菌中心
Research Center of Edible
Fungi, Henan Academy of
Agricultural Science

21 凤尾菇
P. pulmonarius
本实验室保藏 Qiu’s Lab
22 鲍鱼菇 P. cystidiosus 本实验室保藏 Qiu’s Lab
23 榆黄蘑
P. citrinopileatus
河南省农业科学院食用菌中心
Research Center of Edible
Fungi, Henan Academy of
Agricultural Science
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中不加琼脂。将各待试菌种接种于 PDA 平板，于
25℃培养 7d，待菌丝长满平皿后，用打孔器在平板
上打取直径为 1cm 的菌块作接种用。
1.3 拮抗线实验
培养基为贫氮的半 PDA 培养基。使用直径
90mm 的平皿，每皿倒约 25mL 培养基。将菌块
接种在半 PDA 平板的 4 个象限，对角的两个象限
接同一个菌种各一块，每个平板中两个菌种配对。
接种点之间间距约 4cm，于 25℃培养 14d，观察
拮抗线形成情况。将糙皮侧耳种内 19 个菌株间形
成的拮抗线类型分别作为变量，各待试菌种作为
样本，有拮抗线记为“1”，无拮抗线记为“0”建
立矩阵，用 NTSYS-PC 聚类分析软件制作聚类树
状图。
1.4 拮抗线显微观察
选取不同类型的拮抗线平板，将拮抗区域用手
术刀取下约 1cm2 小块，尽可能切去背面的琼脂块，
将获得的薄片（有菌丝的一面朝上）放在加热过的
载玻片上固定，于显微镜下 40 倍或 100 倍观察并
拍照。
1.5 菌丝体总 DNA 的提取
在 500mL 三角瓶中，每瓶装 200mL 马铃薯葡
萄糖液体培养基，接入 5 块菌种块，于 25℃振荡
200r/min 培养 14d，用无菌滤纸抽滤收取纯菌丝体，
于-70℃超低温冰箱中保存待用。用改进 CTAB 法提
取总 DNA（张红等 2006）。用 TE 缓冲液调整各个
菌株的总 DNA 含量在 3,000ng/µL，用于 PCR 扩增
模板。
1.6 RAPD 分析
选用来自上海生工生物工程有限公司的 13 个
10 碱基 PCR 随机引物列于表 2。
PCR 扩增反应体系为：10×PCR buffer 2µL，
dNTPs（各 2.5mmol/L）1.6µL，MgCl2（25mmol/L）
1.2µL，随机引物（20µmol/L）0.8µL，基因组
DNA 0.4µL，Taq 酶（5U/µL）0.1µL，ddH2O 补
充至 20µL。
PCR 反应程序：94 ℃ 预变性 5min；94 ℃
1min，36 1min℃ ，72 2min℃ ，循环 35 次；72 ℃
10min。PCR 产物在 0.75%的琼脂糖中电泳检测，
用GeneSnap凝胶成像系统拍照，电泳图用UVIBand
条带分析软件进行条带扫描识别记录。将各条引物
扩增所得条带按不同分子量分别作为变量，各待试
菌种作为样本，有条带记为“1”，无条带记为“0”
建立矩阵，用 NTSYS-PC 聚类分析软件制作聚类树
状图。
表 2 选用的 10 碱基 PCR 随机引物
Table 2 10 bases random primers for PCR
引物编号
Primer No.
引物序列（5′-3′）
Primer sequence (5′-3′)
S10 CTGCTGGGAC
S22 TGCCGAGCTG
S23 AGTCAGCCAC
S28 GTGACGTAGG
S36 AGCCAGCGAA
S39 CAAACGTCGG
S43 GTCGCCGTCA
S62 GTGAGGCGTC
S75 GACGGATCAG
S78 TGAGTGGGTG
S79 GTTGCCAGCC
S124 GGTGATCAGG
S126 GGGAATTCGG

2 结果与分析
2.1 糙皮侧耳种内和侧耳属种间菌株拮抗线类型
将我国侧耳属常见的 19 株糙皮侧耳（糙皮侧
耳）栽培菌株和 4 株侧耳属的其他种菌株白灵菇、
凤尾菇、鲍鱼菇和榆黄蘑共 23 个菌株分别配对，
共有 175 个配对，在营养贫瘠的半 PDA 培养基中
培养 14d 左右，可观察到不同菌株间都出现有拮抗
线，拮抗线的出现率为 100%。
根据拮抗线区域菌丝的密度、气生菌丝的多
寡、有无色素沉着等特征，可将拮抗线分为菌丝集
结型（Hyphal aggregate）（A 型）、隔离带型（Clear
zone）（B 型）和暗线型（Dark line）（D 型）（图 1）。
A 型拮抗线是在两菌种接触区出现一条菌丝密集的
线分割彼此，双方菌丝在此纠结，菌丝密度明显大
于周围区域，并且气生菌丝增多，但是没有色素沉
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着。B 型拮抗线是在两菌种接触区菌丝较稀少，并
且气生菌丝少或无。而 D 型拮抗线则是在两菌中相
接的地方起初发生菌丝聚集并逐渐出现一条带颜
色的分割线，颜色从淡黄到深褐，培养基里可以见
到色素沉着形成的分界线，从平板背面看尤其明
显。生长形态不同的菌株配对菌丝形态沿着这条线
截然不同，并可能露出仅有色素而无菌丝的一条分
界线；气生菌丝较多的配对可能会掩盖住拮抗线，
但从平板背面仍然可以清晰见到。

图 1 糙皮侧耳菌株中各种类型的拮抗线 A、B：菌丝集结型
拮抗线的正反面，出现在农友 1 号 和 831 之间；C、D：隔离带型拮抗
线的正反面，出现在 PC89 和黑平王之间；E、F：暗线型拮抗线的正反
面，出现在推广一号和苏引 6 号之间；G、H：没有拮抗线，出现在相
同菌株的配对.
Fig. 1 Barrage types among Pleurotus ostreatus strains. A, B: Obverse
and inverse of barrage of raised aggregate of hyphae formed between
Nong You 1 and 831; C, D: Obverse and inverse of barrage of clear
zone formed between PC89 and Hei Ping Wang; E, F: Obverse and
inverse of barrage of dark line formed between Tui Guang 1 and Su
Yin 6; G, H: No barrage formed between the same strain.
2.2 糙皮侧耳种内和侧耳属种间菌株拮抗线的显微
观察
挖取拮抗线正中区域的琼脂块制成水浸片观察
拮抗线中菌丝的形态，A 型、B 型拮抗线中均未观
察到有菌丝自溶现象，D 型拮抗线中的菌丝在接触
融合后发生自溶，产生出无菌丝的溶菌沟带并且释
放出色素。比较糙皮侧耳菌株间的 D 型拮抗线与几
个非糙皮侧耳菌株与糙皮侧耳以及它们互相配对产
生的分隔，可以确认属于同一种类型，均为 D 型。
2.3 糙皮侧耳种内和侧耳属种间23个菌株间的拮抗
线类型分布
19 株糙皮侧耳栽培菌株和 4 株侧耳属的其他
种菌株白灵菇、凤尾菇、鲍鱼菇和榆黄蘑共 23 个
菌株，分别配对进行拮抗线实验，菌株间不同拮抗
线类型的分布见表 3。糙皮侧耳种内的 19 个菌株
间的拮抗线类型以 D 型较多，如糙皮侧耳苏引六号
则与其他受试菌不论是种内还是种间的拮抗类型
均是 D 型，A 型和 B 型较少。侧耳种间菌株白灵
菇和其他受试菌之间的分隔类似于 A 型和 D 型。
凤尾菇、鲍鱼菇和榆黄蘑与糙皮侧耳的配对以及它
们自己互相配对产生类似于 D 型拮抗线的分隔。
将糙皮侧耳种内的 19 个菌株间出现的拮抗线
分布加以统计，A 型、B 型和 D 型出现的几率分别
是 24.9%、23.7%和 51.4%。
将糙皮侧耳种内 19个菌株间形成的拮抗线类型
分别作为变量，各待试菌种作为样本，有拮抗线记
为“1”，无拮抗线记为“0”建立矩阵，用 NTSYS-PC
聚类分析软件制作聚类树状图（图 2）。从相似性系
数 0.48 处截断，可将糙皮侧耳种内 19 个菌株分为 3
个类群，第 I 类群包括菌株 1 号糙皮侧耳 802、2 号
糙皮侧耳 831、3 号糙皮侧耳黑平王、7 号糙皮侧耳
1300、8 号糙皮侧耳推广 1 号、10 号糙皮侧耳 9400、
13 号糙皮侧耳高抗 18 和 14 号糙皮侧耳天达 300，
该 8 株菌株相似性系数为 0.67；第 II 类群包括 4 号
糙皮侧耳苏引六号、5 号糙皮侧耳江都 7、6 号西德
99、11 号江都 5178、15 号糙皮侧耳秋抗 68 和 16 号
糙皮侧耳农友 1 号，该 6 株菌株相似性系数为 0.62；
第 III 类群包括 9 号糙皮侧耳夏王 40、12 号糙皮侧
耳早秋高丰、17 号糙皮侧耳抗病 2 号和 19 号糙皮侧
耳江都 109，该 4 株菌株的相似性系数为 0.48。
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表3 糙皮侧耳菌株和其他食用菌菌株相互间拮抗实验结果
Table 3 Barrage test results of strain pairs among strains of Pleurotus
ostreatus and other edible fungi
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
1 0
2 B 0
3 B B 0
4 D D D 0
5 D D D D 0
6 D D A D D 0
7 B B B D A D 0
8 B B B D D D B 0
9 D A A D D D D A 0
10 B B B D D D B B A 0
11 D D D D A A D D D D 0
12 A A A D D D A B D A D 0
13 B B B D D D B B A B D A 0
14 B B B D D D B B D B D A B 0
15 D A A D D D A D D D B D D D 0
16 D D A D D A D D D D A D D D D 0
17 D A D D D A A A A D D D A A A D 0
18 B B B D D D B B A B D A B B D D A 0
19 A A A D A D A A A A D B A B D D D A 0
20 D A A D D A A A A D D D A D D A A A A 0
21 D D D D A D D D D D D D D D D D D D D D 0
22 D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D 0
23 D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D 0
注：A：菌丝集结型；B：代表隔离带型；D：代表暗线型；0：代表无
拮抗现象.
Note: A: Raised aggregate of hyphae; B: Clear zone; D: Dark line; 0: No
barrage formed.

2.4 糙皮侧耳种内菌株的 RAPD 聚类分析
分别使用随机引物 S10、S22、S23、S28、S36、
S39、S43、S62、S75、S78、S79、S124、S126
共 13 条引物进行 PCR 扩增，扩增获得的条带的
平均大小在 1.39kbp 左右，共获得多态性条带 917
条。该 13 条引物扩增糙皮侧耳种内 19 个菌株和
4 个其他侧耳属菌株具有较高的特异性，如引物
S124 共可扩增出 15 条带，在糙皮侧耳种内菌株
中有 3 条带共同出现在 15 个菌株中，而在 4 株其
他侧耳属菌株均未出现任何 1 条带（图 3）。应用
引物 S43 共可扩增出 17 条带，在糙皮侧耳种内菌
株中有 1 条带共同出现在 14 个菌株中，而在 4 株
其他侧耳属菌株仅有 1 个菌株 21号凤尾菇中出现
（图 4）。
糙皮侧耳种内 19 个菌株由 13 条引物扩增产物
进行聚类分析得聚类图（图 5）。各菌种之间的相似
性系数大于 0.85。从相似性系数 0.85 处截断，可将
19 个糙皮侧耳菌株分为 2 大类群，其中一个类群只
有 1 个菌株 2 号糙皮侧耳 831。从相似性系数 0.86
处截断，可将另一类群分为 2 个亚类。在不同的相
似水平上遗传型一致的有五对菌株 6 和 7、8 和 9、
11 和 12、13 和 14 以及 15 和 16。

图 2 糙皮侧耳种内菌株间按形成的拮抗线类型聚类图
Fig. 2 Dendrogram based on barrage type of strains of Pleurotus
ostreatus.

图 3 使用随机引物S124扩增各菌株获得的DNA多态性图谱
M：DL2000 DNA Marker；CK：双蒸水对照；1-23：菌株编号.
Fig. 3 The RAPD pattern amplified by primer S124. M: DL2000 DNA
Marker; CK: DD water control; 1-23: Strain Numbers.
Vol.29 No.3 385
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图 4 使用随机引物 S43 扩增各实验菌种获得的 DNA 多态性
图谱 M：DL2000 DNA Marker；CK：双蒸水对照；1-23：菌株编号.
Fig. 4 The RAPD pattern amplified by primer S124. M: DL2000 DNA
Marker; CK: ddH2O control; 1-23: Strain Numbers.

图 5 糙皮侧耳种内菌株间 RAPD 分析聚类图
Fig. 5 Dendrogram based on RAPD of strains of Pleurotus ostreatus.
2.5 两种分析方法的比较
比较 19 个糙皮侧耳菌株间拮抗线分析聚类图
和 RAPD 分析聚类图，该两种方法得到的结果没有
相关性（r = 0.115），如拮抗线实验聚类相似性较高
的两对菌株高抗 48 和 PC-89 及西德 99 和农友 1 号
在 RAPD 分析的聚类时分别不在同一类中；反之，
RAPD 分析的聚类相似性较高的两对菌株西德 99
和 1300 及江都 5178 和早秋高丰在拮抗线实验聚类
分析时也分别不在同一类中。
3 讨论
对我国 19 株糙皮侧耳栽培品种配对拮抗实验
结果表明，拮抗线具有多态性，有菌丝集结型（A
型）、隔离带型（B 型）和暗线型（D 型）3 种类型，
在每种类型中又有菌丝密度、带的宽度和色素颜色
深浅等差别，因此，我国糙皮侧耳栽培品种的拮抗
线性状可能属于数量性状。
前人对我国栽培糙皮侧耳品种间的拮抗线类
型仅有有无和强弱的报道，没有报道发现有 A 型、
B 型和 D 型等类型，可能与所用的培养基是富营养
培养基有关。拮抗线在贫瘠低氮培养基中易于出现
（Micali & Smith 2003）。在俄罗斯收集的野生糙皮
侧耳菌株中亦发现有 3 种拮抗线类型，分别是 W 型
即弱反应型（weak reaction），菌丝拮抗反应
（antagonistic response）弱，在接触区菌丝有交错
但没有融合和色素，与本研究的 A 型相似；N 型即
常规型（normal），菌丝拮抗反应中等，拮抗线宽 3
－4mm，有色素产生，色素颜色浅黄色到淡红色；
S 型即强反应型（strong reaction），拮抗线清晰，宽
4－5mm，有色素产生，色素深褐色（Shtaer et al.
2005）。其后 2 种类型与本研究的 D 型相似。在其
他担子菌中拮抗线类型也具有多样性（Lind et al.
2007；Marcais & Delatour 2000；Guler 2008；van der
Nest et al. 2008）。
A 型与裂褶菌 2 个单核菌丝中具有相同的交配
型 A 等位基因和 B 等位基因配对时出现的现象；B
型与裂褶菌 2 个单核菌丝中具有相同的交配型 B 等
位基因而 A 等位基因不同配对时出现的现象，菌丝
互相排斥，在接近中心部位停止生长，形成一条栅
栏带将两个菌落分开。因此，A 型、B 型拮抗线的
形成很容易使人联想到可能有交配型基因参与体
细胞不亲和性反应。然而，大量研究表明，与子囊
菌不同，在担子菌松根异担子（Hansen et al. 1993）、
淡黄木层孔菌 Phellinus gilvus（Rizzo et al. 1995）、
Amylostereum areolatum（van der Nest et al. 2008）
和梭柄金钱菌（Marcais & Delatour 2000）中还没有
发现交配型基因参与体细胞不亲和性反应。
以糙皮侧耳种内 19 个菌株间形成的拮抗线类
型分别作为变量进行聚类分析，从相似性系数 0.48
处截断，可将其分为 3 个类群（图 2），表明我国栽
培糙皮侧耳菌株间体细胞不亲和性位点的遗传差
异较大。由于体细胞不亲和性基因的相对保守性，
所以，我国栽培糙皮侧耳菌株的起源具有多样性。
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尽管俄罗斯野生糙皮侧耳菌株的体细胞不亲和性
表型与其取样地位置和自然状况下利用的基质无
关（Shtaer et al. 2005），那么，我国栽培糙皮侧耳
菌株的这种体细胞不亲和性的多态性是否也与其
起源地和营养利用特性无关有待进一步研究。
应用 13 条随机引物扩增后，对 19 株我国栽培
糙皮侧耳不同品种进行 RAPD 聚类分析，该 19 株
菌株的遗传相似性高达 0.85 以上（图 5），表明该
19 株栽培糙皮侧耳属于同一个种的可能性极高。由
于糙皮侧耳在我国有较长的栽培历史，品种繁多，
同物异名、同名异物现象十分普遍，而分子标记技
术是解决品种同物异名、同名异物现象的有效手段
（Nikoloudakis et al. 2003）。从图 5 还可以看出，我
国糙皮侧耳栽培菌株的多态性程度较高，尽管在不
同的相似水平上有五对菌株 6 和 7、8 和 9、11 和
12、13 和 14 以及 15 和 16 具有较高的遗传相似性，
但每对菌株相互间都存在有拮抗现象，表明它们的
体细胞不亲和性位点是不相同的。
比较应用拮抗线实验和 RAPD 分析得到的 2 个
聚类分析结果，可以清楚发现，此 2 个聚类结果具
有相当的不一致性（图 2，图 5），没有相关性，尤
其是在 RAPD 分析相似水平较高的两对菌株 6 和 7
及 11 和 12，它们互相之间拮抗线类型包含了我们
所发现的三类拮抗线，而它们再和其他菌配对仍然
包含了所有的三类拮抗线，而且没有一对其中的两
个菌种与其他菌所形成的拮抗类型完全相同（表 3）。
这种不一致性在很大程度上是因为前者是以少数
体细胞不亲和性位点（3 个或以上）进行聚类的，
而后者是应用 13 条随机引物对菌株基因组中的上
百个核酸位点进行扫描考察进行聚类的，其中可能
包括也可能不包括体细胞不亲和性位点。另外，体
细胞不亲和性位点和基因组中其他基因位点可能
分别依据各自的遗传规律发生变异。因此，仅仅利
用拮抗线实验，认为体细胞亲和的菌株具有相同或
相似的基因型可能是危险的。有些研究之所以得出
拮抗线实验和RAPD分析的聚类分析结果是一致的
（Guillaumin et al. 1996；Giovannetti et al. 2003；王
磊等 2006），可能与这些研究所考察的菌株群体较
小或所选用的分子 marker 较少有关。但也不可否认
遗传背景对体细胞不亲和性的影响，遗传背景的差
异越大，其拮抗反应越剧烈（Worrall 1997；Lind et
al. 2007）。所以，拮抗线实验仍不失为作为真菌种
内群体结构和多样性分析的一个有用的方法，但要
进行基因型和亲缘关系的鉴定，还需要其他 DNA
指纹方法。
综上所述，通过拮抗线实验和 RAPD 分析从表
型和分子水平上初步证明了我国栽培糙皮侧耳品
种的体细胞不亲和性位点的多态性及广泛和复杂
的遗传背景，在实际应用中可以根据聚类分析的结
果指导亲本选配，选择亲缘关系较远的材料，增加
后代的遗传变异，选育出综合性状更好、更适合我
国栽培条件的优良糙皮侧耳品种。
[REFERENCES]
Adams DH, Roth LF, 1967. Demarcation lines in paired cultures of
Fomes cajanderi as a basis for detecting genetically distinct
mycelia. Canadian Journal of Botany, 45: 1583-1589
Anwar M, Croft J, Dales R, 1993. Analysis of heterokary on
incompatibility between heterokaryon-compatibility (h-c) groups
R and Gl provides evidence that at least 8 het loci control somatic
incompatibility in Aspergillus nidulans. Journal of General
Microbiology, 139: 1599-1603
Barrett DK, Uscuplic M, 1971. The field distribution of interacting
strains of Polyporus schweinitzii and their origin. The New
Phytologist, 70: 581-598
Bursch W, 2001. The autophagosomal-lysosomal compartment in
programmed cell death. Cell Death and Differentiation, 8:
569-581
Caten C, 1972. Vegetative incompatibility and cytoplasmic infection in
fungi. Journal of General Microbiology, 72: 221-229
Chen CT, Yao ZF, 1996. Barrage test of 33 cultivated strains of
Lentinus edodes and application to strain identification. Edible
Fungi of China, 15(6): 3-4 (in Chinese)
Chen Q, Li CX, Li HP, Zhang JX, 2007. Advances in research on
vegetative incompatibility in fungi. Acta Edulis Fungi, 14(1):
73-77 (in Chinese)
Cortesi P, McCulloch CH, Song H, Lin H, Milgroom MG, 2001.
Genetic control of horizontal virus transmission in the chestnut
blight fungus, Cryphonectria parasitica. Genetics, 159: 107-118
Dales R, Croft J, 1983. A chromosome assay method for the detection
of heterokaryon incompatibility (het) genes operating between
Vol.29 No.3 387
菌物学报
members of different heterokaryon compatibility (h-c) groups in
Aspergillus nidulans. Journal of General Microbiology, 129:
3643-3649
Debets F, Yang X, Griffiths AJF, 1994. Vegetative incompatibility in
Neurospora−its effect on horizontal transfer of mitochondrial
plasmids and senescence in natural populations. Current Genetics,
26: 113-119
Giovannetti M, Sbrana C, Strani P, Agnolucci M, Rinaudo V, Avio L,
2003. Genetic diversity of isolates of Glomus mosseae from
different geographic areas detected by vegetative compatibility
testing and biochemical and molecular analysis. Applied and
Environmental Microbiology, 69: 616-624
Glass NL, Jacobson DJ, Shiu KT, 2000. The genetics of hyphal fusion
and vegetative incompatibility in filamentous ascomycetes.
Annual Review of Genetics, 34: 165-186
Guillaumin JJ, Anderson JB, Legrand P, Ghahari S, Berthelay S, 1996.
A comparison of different methods for the identification of genets
of Armillaria spp. The New Phytologist, 133: 333-343
Guler P, 2008. Somatic incompatibility in Agaricus bitorquis (Quél.).
African Journal of Biotechnology, 7: 276-281
Hansen EM, Stenlid J, Johansson M, 1993. Somatic incompatibility and
nuclear reassortment in Heterobasidion annosum. Mycological
Research, 97: 1223-1228
Jacobson DJ, Beurkens K, Klomparens KL, 1998. Microscopic and
ultrastructural examination of vegetative incompatibility in partial
diploids heterozygous at het loci in Neurospora crassa. Fungal
Genetics and Biology, 23: 45-56
Jacobson KM, Miller Jr OK, Turner BJ, 1993. Randomly amplified
polymorphic DNA markers are superior to somatic incompatibility
tests for discriminating genotypes in natural populations of the
ectomycorrhizal fungus Suillus granulatus. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 90:
9159-9163
Johannesson H, Stenlid JN, 2004. Nuclear reassortment between
vegetative mycelia in natural populations of the basidiomycete
Heterobasidion annosum. Fungal Genetics and Biology, 41:
563-570
Kile GA, 1983. Identification of genotypes and the clonal development
of Armillaria luteobubalina Watling & Kile in eucalypt forests.
Australian Journal of Botany, 31: 657-671
Konopleva M, Zhao S, Xie Z, Segall H, Younes A, Claxton DF, Estrov
Z, Kornblau SM, Andreff M, 1999. Apoptosis. Molecules and
mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology,
457: 217-236
Korhonen K, 1978. Interfertility and clonal size in the Armillariella
mellea complex. Karstenia, 18: 31-42
Leslie JF, 1993. Fungal vegetative compatibility. Annual Review of
Phytopathology, 31: 127-150
Leslie JF, Zeller KA, 1996. Heterokaryon incompatibility in fungi−more
than just another way to die. Journal of Genetics, 75: 415-424
Lind M, Stenlid J, Olson K, 2007. Genetics and QTL mapping of
somatic incompatibility and intraspecific interactions in the
basidiomycete Heterobasidion annosum s.l. Fungal Genetics and
Biology, 44: 1242-1251
Liu L, Ning L, Guo LZ, Li CC, Dong W, 2008. Barrage test and part
isozyme analysis of 12 strains of Hypsizigus marmoreus. Edible
Fungi, 1: 12-14 (in Chinese)
Marcais BC, Delatour CO, 2000. Genetics of somatic incompatibility in
Collybia fusipes. Mycological Research, 104: 304-310
Meijer G, Megnegneau B, Linders EGA, 1994. Variability for isozyme,
vegetative compatibility and RAPD markers in natural populations
of Phomopsis subordinaria. Mycological Research, 98: 267-276
Micali CO, Smith ML, 2003. On the independence of barrage
formation and heterokaryon incompatibility in Neurospora crassa.
Fungal Genetics and Biology, 38: 209-219
Micali CO, Smith ML, 2006. A nonself recognition gene complex in
Neurospora crassa. Genetics, 173: 1991-2004
Nikoloudakis N, Banilas G, Gazis F, Hatzopoulos P, 2003.
Discrimination and genetic diversity among cultivated olive of
Greece using RAPD markers. Journal of the American Society for
Horticultural Science, 128(5): 741-746
Rayner ADM, 1991. The challenge of the individualistic mycelium.
Mycologia, 83: 48-71
Rayner A, Todd N, 1979. Population and community structure and
dynamics of fungi in decaying wood. In: Woolhouse H (ed.)
Advances in botanical research. Academic Press, London. 333-420
Rizzo DM, Rentmeester RM, Burdsall HH, 1995. Sexuality and
somatic incompatibility in Phellinus gilvus. Mycologia, 87:
805-820
Shtaer OV, Belokon YS, Belokon MM, Shnyreva AV, 2005.
388 Mycosystema
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
Comparative analysis of Pleurotus ostreatus natural isolates.
Microbiology, 74(2): 194-200
Stenlid J, Vasiliauskas R, 1998. Genetic diversity within and among
vegetative compatibility groups of Stereum sanguinolentum
determined by arbitrary primed PCR. Molecular Ecology, 7:
1265-1274
Tang CH, Zhang JS, Chen MJ, Li TH, Cao H, 2005. Study on
classification of strains of Ganoderma by anatagonistic effect and
RAPD. Microbiology, 32(5): 72-75 (in Chinese)
van der Nest MA, Slippers B, Stenlid J, Wilken PM, Vasaitis R,
Wingfield MJ, Wingfield BD, 2008. Characterization of the
systems governing sexual and self-recognition in the white rot
homobasidiomycete Amylostereum areolatum. Current Genetics,
53: 323-336
Wang L, Cai DH, Su HY, Zhang L, Xu ST, 2006. Study on
phylogenetic relationship of cultivated strains of Coprinus
comatus. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 34(16):
3903-3904 (in Chinese)
Worrall JJ, 1997. Somatic incompatibility in basidiomycetes.
Mycologia, 89: 24-36
Wronski R, Kudera U, Wilhelm E, 1997. Characterization of
Cryphonectria parasitica strains by random amplified
polymorphic DNA (RAPD) technique and conventional methods.
European Journal of Forest Pathology, 27: 95-103
Zhang H, Qin LH, Tan Q, Pan YJ, 2006. Extract genomic DNA from
Lentinula edodes using CTAB method. Journal of Shanghai
University (Natural Science), 12(5): 547-550 (in Chinese)
[附中文参考文献]
陈春涛，姚占芳，1996. 33 个香菇栽培菌株的拮抗性测定及鉴定中的应
用. 中国食用菌，15(6): 3-4
陈强，李翠新，李辉平，张金霞，2007. 真菌营养不亲和研究进展. 食
用菌学报，14(1): 73-77
刘蕾，宁丽，郭立忠，李翠翠，董伟，2008. 12 个真姬菇菌株拮抗试验
及部分同工酶分析. 食用菌，1: 12-14
唐传红，张劲松，陈明杰，李泰辉，曹晖，2005. 利用拮抗试验和 RAPD
对灵芝属菌株进行分类研究. 微生物学通报，32(5): 72-75
王磊，蔡德华，宿红艳，张丽，徐圣涛，2006. 拮抗实验和 RADP 对鸡
腿菇栽培菌株亲缘关系的研究. 安徽农业科学，34(16): 3903-3904
张红，秦莲花，谭琦，潘迎捷，2006. 用改进的 CTAB 法提取香菇基因
组 DNA. 上海大学学报（自然科学版），12(5): 547-550