全 文 ：第 6 卷 第 4 期 北华大学学报(自然科学版) Vol.6 No.4
2005 年 8 月 JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science) Aug.2005
文章编号:1009-4822(2005)04-0348-04
银杉外生菌根形态观察法探讨
邢树堂 ,李玉花 ,瓦里奥·禄敏
(东北林业大学 花卉生物工程研究所 ,黑龙江 哈尔滨　150040)
摘要:比较分析了 4 种可以应用于光学和电子显微观察的方法:透明压片法 、石蜡切片法 、半薄切片法以及超薄
切片法.结果表明 , 上述 4 种方法均可用于鉴定银杉外生菌根 , 但对于外生菌根的早期发育阶段 , 透明压片法比
其他方法简单方便;对于外生菌根完整结构的观察宜采用半薄切片法.
关键词:银杉;外生菌根;哈蒂氏网;形态观察
中图分类号:S791.9　　　　文献标识码:A　
收稿日期:2005-03-29
作者简介:邢树堂(1979-), 男 ,在读硕士 , 主要从事园林植物研究;
李玉花(1961-), 女(朝鲜族),教授 , 博士生导师 ,主要从事花卉遗传育种与发育生物学研究;
瓦里奥·禄敏(1963-),女 , 客座教授 ,博士 , 主要从事菌根学研究.
银杉(Cathaya argyrophyl la Chun et Kuang)是我国特有的 、第三纪孑遗的松柏类单型属植物 ,受国家
一级保护[ 1] .早期曾有报道认为银杉是菌根植物[ 2] ,我们从实验室内外两方面证实银杉是典型的外生菌
根植物.但由于银杉个体数量少[ 1] ,面临濒危 ,如何减少对植株的损害 ,以尽量少的根系样品 ,快速而又简
便地鉴别其菌根 ,需要 1个可靠而简单有效的样品准备方法.本研究应用透明压片 、石蜡切片 、半薄及超薄
切片等方法对这一问题进行了探讨.
1　材料和方法
1.1　实验材料
植物种子:银杉成熟种子 ,由中国科学院植物研究所提供 , 2002年采集于广西大瑶山 ,在4 ℃冰箱中
保存.
外生菌根真菌:土生空团菌(Cenococcum geophilum),由日本东京大学森林植物学研究室铃木和夫教
授提供(菌株 FBCg1),用 MMN[ 3]琼脂(14 g/L)培养基在人工气候箱(23±2 ℃)中进行暗培养 ,每 1个半
月继代培养 1次.
1.2　菌根建立的培养系
1)消毒:取4 ℃冰箱中保存的银杉成熟种子 ,先用洗涤剂搓洗15 min ,流水冲洗5 h ,再移入超净工作
台中依次用 70%酒精浸泡 30s , 30%H2O2 浸泡30 min ,用无菌水清洗 3遍 ,在无菌滤纸上凉干 ,最后接种
到0.5%葡萄糖的琼脂(14 g/L)培养基上;种子培养7 d左右后取出 ,将其胚乳的外周切开 1/3 ～ 1/5 ,再移
回到原培养基上.
2)培养:种子发芽5 d后转接到改良 MS琼脂培养基[ 4] ,包括 1/4M S(大量元素)、1/2MS(微量元素)、
MS(微量元素)、MS(Fe 盐)、6-BA 0.2 mg/L 、NAA 0.02 mg/ L上继续培养.该培养基的蔗糖和琼脂质量浓
度分别为20 g/L和8 g/L ,pH 为5.6.培养条件为光照12h/d ,光照强度2 000lx ,培养温度 23±2 ℃.
3)接种:用改良平板法将土生空团菌人工接种于银杉的培养苗 ,进行人工菌根的诱导(图 1)[ 5] .
1.3　菌根鉴定方法
1)透明压片法:选择新鲜的菌根(0.5 ～ 1.0 cm),在 70%酒精中固定1 h以上;100 g/L KOH 溶液中
90 ℃水浴90 min ,新鲜的100 g/L KOH 浸洗5 min;浸没在 H2O2 中室温漂白10 min;蒸馏水彻底冲洗;
0.1 N HCl中酸化10 min;染色90 min ,染液由等体积 80%的乳酸 、甘油 、蒸馏水和0.1 Chlorazol black E 组
成;甘油(50%～ 100%)中去色5 min;进行压片[ 7] .OLYMPUS 光学显微镜 BX51观察照相 ,所用胶卷为科
达 100.
2)石蜡切片法:将新鲜菌根的短根组织(2 ～ 3 mm长的根段)用清水洗净 ,FAA 固定液固定 ,酒精系列
脱水 ,二甲苯透明 ,浸蜡;包埋 、切片 、贴片 、展片均用莱卡 EG1140H 石蜡包埋机和切片机进行;二甲苯脱
蜡 ,系列酒精复水 ,1%番红溶液染色 , 酒精洗去多余染料 , 1%固绿溶液滴染 ,脱水透明;加拿大树胶封
片[ 8] ,完成制片.OLYMPUS 光学显微镜 BX51观察照相 ,所用胶卷为科达 100.
3)半薄切片法:把菌根切成 2 ～ 4 mm长的根段 ,用2.5%戊二醛固定液固定至少2 h , 0.1%磷酸(pH
7.2)缓冲液洗脱 3次 ,每次15 min;2%OSO4 固定液固定1.5 h ,0.1%磷酸(pH 7.2)缓冲液洗脱 3次 ,每次
15 min;50%～ 100%乙醇系列脱水 ,每次10 min;812树脂渗透 、包埋;埋入 812树脂中 ,在60 ℃烘箱中放
置36 h ,使树脂聚合;用 AOE型切片机自制玻璃刀切割;用甲苯胺蓝染色[ 9] ,最后用 Olympus光学显微镜
BX51观察照相 ,所用胶卷为科达 100.
4)超薄切片法:固定方法同半薄切片法 ,利用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色法染色[ 9] .最后用 JEM-
1200EX型电子显微镜观察照相.
2　结　　果
用透明压片法 、石蜡切片法 、半薄切片法和超薄切片法等 4种方法对银杉菌根形态进行观察 ,结果表
明 ,4种方法均可以观察到银杉和土生空团菌形成的菌根(图 2).用透明压片法制成的样品虽然具有一定
的厚度 ,但由于经过根部组织的洗净 、漂白以及染色 ,可以明显地显示菌丝细胞.这样通过显微镜的微调 ,
就可以从各个不同层次对样品进行观察.能够观察到菌根组织的外围结构———菌套(图 3),以及侧根皮层
细胞间的分枝状的菌丝———哈蒂氏网(Hartig net)(图 4),尤其是在菌根形成初期 ,能够容易地观察到开始
分枝的菌丝细胞.石蜡切片法制成的切片一般可以达到2 μm的厚度 ,可清楚地观察到单层细胞(图 5 、图
6),同时一般石蜡切片可以作为半永久性保存.用树脂包埋制作的半超薄切片厚度能达到0.5 ～ 1μm ,可
以更加清晰地观察细胞内 、外部的结构(图 7 、图 8).超薄切片由于倍率关系 ,能够观察到菌根组织内部的
细胞器官.表 1详细地比较了以上 4种方法.
　　　　　　　　　图 1　平板接种　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　图 2　菌根(×25)
Fig.1　Culture plate method for in vitro aseptic production　　　　　　　　Fig.2　Ectomycorrhizal root(×25)
　　　　　　图 3　透明压片法(×1 000)　　　　　　　　　　　　　　　　　　图 4　透明压片法(×200)
　　Fig.3　Clear ing and staining method(×1 000)　　　　　　　　　　Fig.4　Clearing and staining method(×200)
　　　　　图 5　石蜡切片法(×200)　　　　　　　　　　　　　　　　　　图 6　石蜡切片法(×1 000)
　　Fig.5　Paraffin section method(×200)　　　　　　　　　　　　　Fig.6　Paraffin section method(×1 000)
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　　　　　图 7　半薄切片法(×200)　　　　　　　　　　　　　　　　　　图 8　半薄切片法(×1 000)
　　　Fig.7　Semi-section method(×200)　　　　　　　　　　　　　　Fig.8　Semi-section method(×1 000)
　　　　　图 9　超薄切片法(×8 000)　　　　　　　　　　　　　　　　　　图 10　超薄切片法(×10K)
　　Fig.9　Ultra-thin section method(×8 000)　　　　　　　　　　　　Fig.10　Ultra-thin section method(×10K)
表 1　4种形态观察法的比较
Tab.1　Comparison of four methods of morphological observation
方法 取样量(根段)l
样品制作
时间 t
样品
观察面 清晰度 观察范围
设备
要求
野外
操作
切片保存
时间
透明
压片法 >0.5 cm 5～ 6 h
外部菌套
内部菌丝
(立体)
在菌根形成阶段清晰
度好 ,但当大量形成时
观察的效果就比较差
立体可以看到外部菌
套 ,初级阶段可以观
察到手掌状哈蒂氏网
方便
廉价 能
半永久
保存
石蜡
切片法 0.5 cm 左右 7 d
横切面
纵切面 清晰度较好
可以观察到整体以及
细胞间隙的哈蒂氏网
费用
适中 否
半永久
保存
半薄
切片法 <0.5 cm 4 d
横切面
纵切面 清晰度高
可以观察到整体以及
细胞间隙的哈蒂氏网
费用
适中 否
半永久
保存
超薄
切片法 1 mm横切面
纵切面
清晰度非常高 , 可以
看到细胞超微结构
只能看到局部
或单个细胞
花费
昂贵 否
保存
时间短
3　讨　　论
长期以来 ,对于银杉这一植物界活化石濒危原因的解释及濒危现状的改善一直是研究者关注的热点.
本研究的前期工作已经成功地通过野外的调查研究以及实验室内人工菌根的诱导得出了银杉是典型的外
生菌根植物的结论 ,这一认证为今后一系列有关银杉的菌根学 、生理学等方面的研究提供了必不可少的前
提条件.但是 ,由于目前银杉处于极度濒危的状态 ,种子缺乏 、发芽率低下 、生境险恶等各种不利因素均给
研究工作的开展造成了一定的障碍.因此 ,有效地利用所采集的样品 ,准确地选择样品的制备方法 ,对于银
杉这种极度濒危的植物来说是极其重要的.
本研究以采用实验室条件下诱导的人工菌根作为材料 ,通过利用 4种常规的形态观察方法对银杉的
样品制备 、观察进行了比较.尽管通过这 4种方法均能观察到银杉的菌根结构 ,但各种方法在银杉研究的
应用中还是各有利弊的.
首先 ,从快速判断是否是菌根植物这一目的来说 ,我们的研究结果表明 ,透明压片法为首选的方法.因
为该方法可以对样品进行立体的观察.菌根形成初期 ,一般可以容易地观察到菌丝体的侵入以及形成
Harting net的各个过程.同时由于该方法操作相对简便:固定可以在野外直接进行;透明 、清洗以及染色的
实验步骤所要求的设备条件不高[ 6] .另外 ,该方法操作所需要的时间相对较短 ,只需5 h左右就可以完成.
此外 ,透明压片法是用 70%乙醇作为固定液 ,固定的时间长短并不十分严格[ 6] ,所以该操作对于在地形复
杂的银杉分布区进行野外采样来说比较合适.
其次 ,从完整地观察菌根结构这一目的来说 ,通过以上各方法的比较 ,半薄切片法为首选的方法.因为
通过样品的二次固定 ,能够完整地保留原组织的结构形态[ 10] ,清楚地同时观察到菌根中菌丝和植物细胞
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的结构 ,提供相当有力的菌根形成的证据.
再者 ,从了解菌根结构中细胞水平上的特点来说 ,超薄切片法能够详细地反映这方面的信息 ,并且也
有可能通过特殊染色方法进行生物大分子和酶的结构 、活性的研究[ 9] .
各种方法又存在不同的弊处.如当菌根形成明显的菌套时 ,用透明压片法就很难清楚地观察到内部结
构.半薄切片以及超薄切片的制备需要一定的设备和相当长时间 ,不适合野外样品的快速鉴定.超薄切片
法对于设备的要求更高 ,而且由于放大倍率的关系 ,对于菌根完整观察也是有局限性的.石蜡切片法的效
果基本上接近或略劣于半薄切片 ,但由于操作时间长 ,应用起来并不方便.
综上所述 ,在进行银杉菌根学研究时 ,综合地结合透明压片法和半薄切片法来进行银杉的菌根的采样
和观察将时非常有效的.
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Morphological Observat ion Methods of Ectomycorrhizas
in Cathaya argyrophylla
XING Shu-tang ,LI Yu-hua ,VAARIO Lu-min
(Research Insti tute of F lower Biotechnology , Northeast Forestry Universi ty , Harbin 150040 , China)
Abstract:Four available methods fo r light o r elect ron-microscopic observation were analyzed:clearing and
staining method , paraffin section method , semi-section method and ult ra-thin section method.The results
indicated that all these methods w ere able to ident ify ectomyco rrhizal roots of C.argyrophyl la.Especially , an
early developmental stage of ectomycorrhizal roots identified by the clearing and staining method is easier than
o ther methods.Also intact st ructure of ectomycorrhizal roots were observed only by semi-sect ion method.
Key words:Cathaya argyrophylla;Ectomycorrhiza;Hartig net;Morphological observation
【责任编辑:郭伟】
351第 4 期 邢树堂 , 等:银杉外生菌根形态观察法探讨