全 文 ：侧耳 RSAP-PCR体系的建立和优化
潘祖桐1 , 宋　慧1 , 刘　麒1 , 李胜南1 , 李媛媛1 , 刘晓龙2
1.吉林农业大学生命科学学院 ,长春 130118;2.吉林农业大学 食药用菌教育部工程研究中
心 ,长春 130118
摘　要:采用单因素试验和正交设计相结合进行了侧耳(Pleurotus ostreatus)RSAP-PCR反应体系的建立和优
化 ,并对优化后体系的稳定性进行了验证。讨论了Mg2+浓度 、dNTPs 浓度 、引物浓度 、Taq 聚合酶用量和模板
DNA含量对侧耳 RSAP-PCR反应的影响 ,最终得出总体积为 25 μL的反应体系:30 ng 模板 DNA , 2.0 μL 10 倍
PCR buffer ,Mg2+ 2.5 mmol/L , dNTPs 0.25 mmol/ L ,引物 0.32 μmol/ L, Taq DNA 聚合酶 2 U , ddH2O 13.2 μL。
关键词:侧耳;RSAP;体系优化
中图分类号:S646.14　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2013)02-0171-06
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/ detail/ 22.1100.S.20121015.0938.005.html
引文格式:潘祖桐 ,宋慧 ,刘麒 ,等.侧耳 RSAP-PCR 体系的建立和优化[ J] .吉林农业大学学报 , 2012 , 35(2):
171-176.
Establishment and Optimization of RSAP-PCR Reaction Conditions in
Pleurotus ostreatus
PAN Zu-tong1 , SONG Hui1 , LIU Qi1 , LI Sheng-nan1 , LI Yuan-yuan1 , LIU Xiao-long2
1.College of Life Science , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;2.Engineering Re-
search Center of the ChineseMinistry of Education for Edible and Medicinal Fungi , Jilin Agricultural Uni-
versity , Changchun 130118 , China
Abstract:In this study , single factor and orthogonal experiments were used to establish and optimize the
RSAP-PCR reaction system of Pleurotus ostreatus.Then , experiment tests were done to check the sta-
bility of the RSAP-PCR reaction system using a different pair of primers.Finally , a 25μL optimized re-
action system was obtained:30 ng DNA , 2.0 μL 10 ×PCR buffer , Mg2+ 2.5 mmol/L , dNTPs
0.25 mmol/L , Primers 0.32μmol/L , Taq DNA polymerase 2 U , ddH2O 13.2 μL.
Key words:Pleurotus ostreatus;RSAP;system optimization
　　侧耳又名平菇 ,是食用菌大家族中重要的一
员 ,与蘑菇和香菇共同被作为世界三大宗食用菌。
侧耳也是我国食用菌产业的重要组成部分 ,其有
重要的食用和药用价值 ,栽培特点为量大 、面积广
等。侧耳品种繁多 ,在其属内种间的鉴定存在严
重的同名异物和同物异名现象[ 1] 。另外 ,地域的
差异和纷乱的人工栽培等因素容易造成其分类混
乱 、难以区别等问题 ,为科研和生产带来诸多不
便。因此 ,探求一种行之有效的侧耳分类鉴定方
法势在必行。
RSAP分子标记 ,即限制性位点扩增多态性 ,
是由杜晓华等[ 2]创建的。该标记是一种检测基因
组上广泛分布的限制性酶切位点多态性的新型
DNA标记系统 ,其引物是根据基因组内普遍存在
的限制性酶切位点来设计的 ,随机选取设计好的
2条引物组成 1对 ,通过简单的梯度 PCR反应来

通讯作者
基金项目:吉林省农委项目(10096)
作者简介:潘祖桐 ,男 ,硕士 ,研究方向:菌物生物化学。
收稿日期:2012-04-16　　网络出版时间:2012-10-15 09:38
吉林农业大学学报　2013 ,35(2):171 ～ 176 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
产生多态性 。它是对 RFLP 和 AFLP 的一种简化 ,
因其具有多态性高 、稳定性好 、不需预先知道基因
序列 、检测快速 、产物特异性强 、技术要求低 、成本
低等优点 ,已被用于辣椒 、红花 木 、紫菜及印度
南瓜种子等的研究[ 3-6]中 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌种来源　以吉林农业大学菌物所提供
的侧耳菌以及吉林农业大学生命科学学院生物化
学与分子生物学实验室所搜集的侧耳菌经 PDA
培养基培养的菌丝体作为基因组 DNA提取的材
料 ,见表 1。
1.1.2　主要药品及仪器 　Taq 酶 、dNTPs 、DNA
Marker DL500 、DL2000 、Mg2+等均购于 Takara大连
宝生物公司 ,引物由上海生工合成 ,琼脂糖由西班
牙生产 ,SDS 、EB 、氯仿 、异戊醇 、无水乙醇 、CTAB 、
硝酸银 、冰乙酸 、甲醛 、氢氧化钠等均购于北京鼎
国生物技术有限公司。法国进口 Bioprint-1000/
26M 凝胶成像仪 ,SIGMA公司 3K18台式冷冻离心
机 ,杭州郎基科学仪器有限公司MG25+基因扩增
仪 ,北京市六一仪器厂 DYY-7C 型电泳仪 ,北京
普析通用仪器有限公司 TU-1810紫外/可见光分
光光度计等。
表 1　供试侧耳菌株
Table 1.Tested materials of Pleurotus
编号
No. 菌株Strain 品种名Species 来源Origin
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
C13
C14
C15
C16
C17
C18
C19
C20
C21
C22
C23
C24
C25
C26
C27
C28
原生 1号
姬菇
凤尾菇
澳白
白灵菇
榆黄菇
PE6320
黑平 8号
政平 1号
650
HB-3
白阿魏-2
榆蘑 1号
肺形侧耳
糙皮侧耳
黄原
平菇
神 7
原生 2号
615
35
榆 K-8
榆 K-13
榆黄 G
Y300
冠平 1号
7876
平 7350
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus cornucopiae(Paul.:Pers.)Roll.
Pleurotus sajurcaju
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ferulae(Lanzi)X.L.Mao
Pleurotus citrinopi leatus Sing
Pleurotus eryngii
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus eryngii
Pleurotus nebrodensis.
Pleurotus citrinopi leatus Sing
Pleurotus pulmonarius(Fr.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus citrinopi leatus Sing
Pleurotus citrinopi leatus Sing
Pleurotus citrinopi leatus Sing
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
Pleurotus ostreatus(Jacq.)Qué l
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学生命科学学院
吉林农业大学菌物所
吉林农业大学生命科学学院
吉林省食用菌高薪科技园
吉林农业大学园艺学院
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吉林农业大学园艺学院
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1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA 提取及检测 　采用改良的
SDS-CTAB法[ 7-8]对 28个侧耳菌菌丝体进行基因
组 DNA 的提取 ,并用紫外分光光度计测定其含
量 ,2%琼脂糖凝胶电泳 ,用 EB染色并检测其亮
度 , -20 ℃保存备用。
172　　吉林农业大学学报　2013年 4月
Journal of Jilin Agricultural University 2013 , April
1.2.2　RSAP引物及扩增程序选择　RSAP 引物
和扩增程序选择由张明科等[ 9]对原始引物改进后
的新引物和扩增程序。选取其中的 2条引物 Rs1a
和 Rs4作为 1对引物对进行建立和优化试验 , Rs7
和Rs9作为 1对引物对进行验证试验 ,所需引物
如下:Rs1a:5′-TGCCAGCCACGAATTCATG-3′;Rs4:
5′-GGCCAGCCGCTTTAAAATC-3′;Rs7:5′-TGCCAG
CCACTCTAGAATG-3′;Rs9:5′-GTTGCCAGCCACGA
TCATT-3′。
基本扩增程序:94 ℃ 5 min 预变性;94 ℃
1 min ,35 ℃ 1 min , 72 ℃ 1 min , 5个循环;94 ℃
1 min ,50 ℃1 min , 72 ℃1 min , 35 个循环;72 ℃
10 min;4 ℃保存 。
1.2.3　RSAP 体系的建立和优化　①单因素试
验。随机从28个菌株中选取 1株所提取的基因
组DNA作为模板 ,本研究选取 C2号姬菇菌株 ,选
取 Rs1a和 Rs4为引物对 ,对PCR体系中的 Taq酶
用量 、引物浓度 、dNTPs 、Mg2+浓度 、模板 DNA含量
分别进行单因素试验 , 具体因素和水平见表 2。
试验重复 2 次。 ②正交试验。在单因素试验的
基础上 ,得出各因素合适值 ,并进行 L16(45)正交
试验设计(表 3),同样试验重复 2次。 ③验证试
验。在单因素试验和正交试验的基础上 , 选取
Rs7和 Rs9为引物对 ,对C1 ～ C28菌株(表 1)所提
取的 DNA进行 PCR验证试验 ,验证由单因素和正
交试验所得体系的稳定性 ,并用 6%变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳 ,银染进行检测 ,试验重复 2次。
表 2　单因素试验因素水平表
Table 2.Factors and levels of single factor test
水平
Level
因素 Factors
Taq酶用量/U c(引物)/(μmol·L-1) c(Mg2+)/(mmol·L-1) c(dNTPs)/(mmol·L-1) 模板 DNA/ ng
1 1.0 0.24 1.0 0.10 20
2 1.5 0.32 1.5 0.15 25
3 2.0 0.40 2.0 0.20 30
4 2.5 0.48 2.5 0.25 35
5 3.0 0.56 3.0 0.30 40
6 3.5 0.64 3.5 0.35 45
表 3　正交试验因素水平表 L16(45)
Table 3.Factors and levels of orthogonal test
水平
Level
因素 Factors
Taq酶用量/U c(引物)/(μmol·L-1) c(dNTPs)/(mmol·L -1) c(Mg2+)/(mmol·L-1) 模板 DNA/ ng
1 1.0 0.24 0.10 1.5 30
2 1.0 0.32 0.15 2.0 35
3 1.0 0.40 0.20 2.5 40
4 1.0 0.48 0.25 3.0 45
5 1.5 0.24 0.15 2.5 45
6 1.5 0.32 0.10 3.0 40
7 1.5 0.40 0.25 1.5 35
8 1.5 0.48 0.20 2.0 30
9 2.0 0.24 0.20 3.0 35
10 2.0 0.32 0.25 2.5 30
11 2.0 0.40 0.10 2.0 45
12 2.0 0.48 0.15 1.5 40
13 2.5 0.24 0.25 2.0 40
14 2.5 0.32 0.20 1.5 45
15 2.5 0.40 0.15 3.0 30
16 2.5 0.48 0.10 2.5 35
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA提取结果
由图 1 ～ 3(M:DL2000)可见 ,编号 1 ～ 28泳道
分别为侧耳菌菌株 C1 ～ C28(表 1)所对应的基因
组DNA 图谱 ,可见基因组 DNA 条带完整 、明亮 ,
且经检测吸光度 OD260/OD280值都约为 1.8 ,可用
作PCR模板。
173潘祖桐等:侧耳 RSAP-PCR体系的建立和优化
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
图 1　侧耳菌 C1～ C13基因组 DNA
Fig.1.DNA extracted from C1 to C13 of Pleurotus
ostreatus
图 2　侧耳菌 C14～ C21基因组 DNA
Fig.2.DNA extracted from C14 to C21 of Pleurotus
ostreatus
图 3　侧耳菌 C22～ C28基因组 DNA
Fig.3.DNA extracted from C22 to C28 of Pleurotus
ostreatus
2.2　单因素试验结果
2.2.1　Taq聚合酶用量对侧耳 RSAP-PCR体系
的影响　由图 4可见 , Taq 酶用量为 1.0 ～ 3.5 U
时均有条带 ,2.0 U时扩增出的条带最清晰 ,在此
范围内 Taq酶与 DNA模板结合效率最高 ,扩增效
果最好 , Taq 用量过多会彼此竞争模板而影响扩
增结果 ,用量>3.0 U时条带亮度降低 ,用量少条
带减弱 ,用量为 0 U时无条带 ,考虑到节约资源的
因素 ,选择 Taq 聚合酶用量为 2.0 U时较为适合 。
M.DL2000;1～ 7.Taq 酶用量分别为 1.0 , 1.5 , 2.0 , 2.5, 3.0 ,
3.5, 0 U
图 4　Taq 酶用量对菌株 C2号 RSAP-PCR扩增的
影响
Fig.4.Effect of Taq polymerase on RSAP-PCR re-
action
2.2.2　引物浓度对侧耳 RSAP -PCR体系的影
响　由图 5可见 ,当引物浓度为 0.64 μmol/L 时 ,
扩增的条带最清晰 ,6 ～ 1泳道随引物浓度降低 ,
条带减弱 ,选择 4泳道引物浓度 0.48 μmol/L 作为
适宜引物浓度做进一步研究。
M.DL2000;1 ～ 7.引物浓度分别为 0.24, 0.32 , 0.40 , 0.48 ,
0.56 , 0.64 , 0μmol/ L
图 5　引物浓度对菌株 C2号 RSAP-PCR扩增的影响
Fig.5.Effect of primers on RSAP-PCR reaction
2.2.3　dNTPs浓度对侧耳 RSAP-PCR体系的影
响　由图 6 可见 ,当 dNTPs浓度为 0.30 mmol/L
时 ,扩增出的条带最清晰且稳定 ,超过或低于此值
时 ,扩增的条带都有不同程度的减弱 ,因此 dNTPs
174　　吉林农业大学学报　2013年 4月
Journal of Jilin Agricultural University 2013 , April
最适浓度为0.30 mmol/L。
2.2.4　Mg2+浓度对侧耳 RSAP -PCR体系的影
响　由图 7可见 ,当Mg2+浓度为1.5 mmol/L 时效
果最好 ,浓度过高时出现非特异性条带 ,浓度过低
扩增条 带变模 糊 , 因 此 Mg2+适 宜浓 度为
1.5 mmol/L。
M.DL2000;1 ～ 7.dNTPs用量分别为 0.10 , 0.15 , 0.20 , 0.25 ,
0.30 , 0.35 , 0 mmol/ L
6　dNTPs浓度对菌株 C2号 RSAP-PCR扩增的影响
Fig.6.Effect of dNTPs on RSAP-PCR reaction
M.DL2000;1～ 7.Mg2+浓度分别为 1.0 , 1.5 , 2.0, 2.5 , 3.0 ,
3.5, 0 mmol/ L
图 7　Mg2+浓度对菌株 C2号 RSAP-PCR 扩增的
影响
Fig.7.Effect of Mg2+ on RSAP-PCR reaction
2.2.5　模板 DNA含量对侧耳 RSAP -PCR体系
的影响　由图 8 可知 ,随着模板 DNA 含量的增
加 ,扩增的条带越来越清晰 , DNA含量为 20 ng 和
25 ng 时效果较差 ,DNA含量为 30 ,35 ,40 ,45 ng 时
可以较好地扩增出清晰稳定的条带 ,此范围含量
均可作为模板用量。
2.3　正交试验直观分析
根据正交表(表2)的16个处理对应图9中的
1 ～ 16个泳道 ,对结果从特异性条带亮度和多少及
背景清晰度的角度进行直观评分 ,1 ～ 16泳道得分
分别为1 ,10 ,14 ,15 ,6 , 5 ,9 ,2 , 12 ,16 ,7 , 8 ,13 ,3 , 11 ,
4 ,计算得出 Taq 酶用量 ,引物浓度 , dNTPs ,Mg2+
浓度和模板DNA含量对 PCR体系影响的极差为
5.25 ,3.375 , 9 , 5.5 , 2.5 ,即对 PCR反应影响由大
到小为 dNTPs>Mg2+浓度>Taq酶用量>引物浓
度>模板 DNA含量。确定方案10作为侧耳RSAP-
PCR反应体系 , 扩增出的条带稳定且清晰。即
RSAP-PCR 反应体系最终确定为 30 ng 模板
DNA , 2.0 μL 10倍 PCR buffer , Mg2+2.5 mmol/L ,
dNTPs 0.25mmol/L ,引物0.32 μmol/L , Taq DNA聚
合酶2 U ,ddH2O 13.2μL。
M.DL2000;1～ 7.模板 DNA含量分别为 20 , 25 , 30 , 35, 40 ,45 ,
0 ng
图 8　模板 DNA含量对菌株 C2号 RSAP-PCR 扩
增的影响
Fig.8.Effect of DNA on RSAP-PCR reaction
M.DL2000 Marker;1～ 16.正交表 1～ 16 Orthogonal table 1—16
图 9　菌株 C2号 RSAP-PCR正交试验扩增图
Fig.9.Orthogonal test of RSAP-PCR
2.4　验证试验结果
验证试验采用 Rs7和 Rs9为引物对 ,按正交
试验优化完毕的最佳扩增体系对 28个侧耳菌种
进行 PCR验证(图 10 ,图中从左至右 30个泳道分
别为 C28 ～ C1 RSAP 的扩增结果;DL500 Marker;
175潘祖桐等:侧耳 RSAP-PCR体系的建立和优化
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DL2000Marker)。不同菌种间扩增的条带差异较
大 ,条带丰富且特异性强 ,有利于揭示侧耳属属内
种间不同菌株间的扩增条带多态性和特异性 ,可
用于侧耳属菌种 RSAP 标记分析鉴定的研究 。
图 10　侧耳 RSAP-PCR体系验证试验结果
Fig.10.Test results of Pleurotus ostreatus RSAP-PCR system
3　讨　论
刘泽发等[ 6] 认为 RSAP 分子标记是对 AFLP
的极大简化;RSAP检测的限制性位点散布于整个
基因组区域上 ,是对主要扩增单拷贝基因区的
SRAP 和TRAP 这 2种分子标记的有效补充;同时
RSAP具有多态性高 、稳定性好 、可鉴定共显性遗
传等优点 ,是种新兴的分子标记。
在DNA分子标记建立和优化的试验中 ,单因
素试验和正交试验常常作为首选 ,单因素试验能
精细地对各个因素给予设计 ,这是正交试验所不
能的 ,而正交试验却可以对各个因素之间的交互
作用进行很好的研究 ,这又是单因素试验所不能
的 ,因此本研究同时利用两者对侧耳菌菌种
RSAP-PCR的体系进行优化 ,避免了只利用其中
一种试验的局限性。
由上述试验可知 , Taq DNA 聚合酶 、引物 、
dNTPs、Mg2+和模板 DNA 含量对侧耳 RSAP -PCR
体系反应的影响依次为 dNTPs 浓度>Mg2+
浓度>Taq酶用量>引物浓度>模板 DNA含量 ,
这5个因素的交互作用对 PCR体系的影响很大 ,
引物浓度过大会引起非特异性的扩增 ,模板 DNA
和引物两者只有达到互相匹配的量才能最有效地
结合 , 进而延伸时 Taq 酶才能最有效地结合 ,
Mg2+是 Taq 酶的催化剂 ,其浓度大小对 Taq酶活
性的发挥起着重要的作用 ,上述完备后 PCR体系
还会受 dNTPs的影响 , dNTPs的量决定了扩增产
物的数量与质量 。本研究通过极差分析 ,dNTPs ,
Mg2+和 Taq 酶用量对侧耳RSAP-PCR体系影响
较大 ,引物浓度和模板 DNA 含量的影响较小 ,最
终确定了侧耳RSAP-PCR最佳反应体系为25μL:
30 ng 模板 DNA , 2.0 μL 10 倍 PCR buffer , Mg2+
2.5 mmol/L , dNTPs 0.25 mmol/L , 引 物
0.32μmol/L , Taq DNA 聚 合 酶 2 U , ddH2O
13.2μL。RSAP 作为一种新兴的分子标记方法 ,
简便快捷 ,无需知晓材料的遗传背景即可进行亲
缘关系鉴定和遗传多样性的研究 ,是对分子标记
系统的补充和完善。
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(责任编辑:王希)
176　　吉林农业大学学报　2013年 4月
Journal of Jilin Agricultural University 2013 , April