全 文 ：菌 物 学 报 26（1）：115~121, 2007
Mycosystema
白黄侧耳 Pleurotus cornucopiae微卫星间区（ISSR）分析1
张金霞 黄晨阳 管桂萍 李辉平 张瑞颖 胡清秀
（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所, 北京 100081）
摘 要：本试验对我国 1982年至 2004年 22年间栽培的白黄侧耳 Pleurotus cornucopiae 30个菌株进行了锚
定 ISSR分析，试验表明，引物 P4和 P5都能对白黄侧耳 P. cornucopiae进行多态性扩增，P4将供试菌株扩
增出 45个条带，大小在 200～20 000 bp，P5将供试菌株扩增出 39个条带，大小在 500～15 000 bp，扩增
出的条带 100%具多态性。聚类分析在遗传相似性 61%的水平下将 30个供试菌株划分为 15个类群，即 15
个具一定遗传差异的菌株；具有相同 ISSR 图谱、遗传相似性程度 100％的可能为同一菌株，属于同物异
名。试验表明我国的食用蕈菌野生环境面临人工栽培种质的污染，采自河北、山东、云南自然环境下的白
黄侧耳 P. cornucopiae与此前大量栽培的一些商业品种具完全相同的 ISSR 指纹图谱，聚类分析相似性系
数 100%。
关键词：锚定 ISSR，商业菌株，菌株鉴定，遗传分析
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2007）01-0115-0121
Inter simple sequence repeat analysis for Pleurotus cornucopiae
ZHANG Jin-Xia HUANG Chen-Yang GUAN Gui-Ping LI Hui-Ping
ZHANG Rui-Ying HU Qing-Xiu
(Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstract: The anchored ISSR analysis of Pleurotus cornucopiae was carried out for identification of the thirty
cultures cultivated from 1982 to 2004 in China. The polymorphic DNA fragments could be produced by both of
the primer P4 and P5 for the tested cultures of P. cornucopiae. Forty-five bands arose from primer P4, 200~20000
bp in length and thirty-nine bands arose from primer P5, 500~15000 bp in length. All of the bands brought
polymorphic among the tested strains. The thirty cultures of P. cornucopiae were divided into 15 groups, i.e. 15
stains under similarity of 61% by cluster analysis. The cultures with the same ISSR profiles and 100% similarity
of cluster analysis probably belong to the same strain. The results show that the environment of the wild
mushrooms is faced with the contamination of germplasms from the commercial varieties. The ISSR profiles of
wild P. cornucopiae in Hebei, Shandong and Yunnan are equal to those of commercial varieties cultivated before,
and the similarity analyzed by UPGAMA is 100%.
Keywords: Anchored ISSR, commercial strains, strain identification, genetic analysis.

白黄侧耳 Pleurotus cornucopiae（Paulet:Pers.）Rolland俗称姬菇、小平菇（mini oyster），
也有人误称其为秀珍菇、珍珠菇，是世界性分布的食用蕈菌，我国河北、黑龙江、吉林、

基金项目：科技部三峡移民科技开发专项 2004EP090020
收原稿日期：2006-04-11，收修改稿日期：2006-06-19
DOI:10.13346/j.mycosystema.2007.01.018
116 菌 物 学 报 26卷

山东、江苏、四川、安徽、江西、河南、广西、新疆、云南等地均有分布（卯晓岚，1998），
是平菇(oyster)的主要栽培种，我国主要栽培食用蕈菌之一，也是全球性栽培的食用蕈菌。
由于其栽培简便，生物转化率高，成为发展中国家重要蛋白质来源，全球产量持续增长。
为了获得优良的农艺性状和商品性状，育种者应用多种方法进行优良品种的选育。但
是，由于子实体分化程度远远低于绿色植物，应用形态的多样性进行特异性、一致性和稳
定性（DUS）的鉴定十分困难。美国、意大利、荷兰等国家对食用蕈菌商业菌株实行了专
利和品种权保护，然而在专利保护的实际应用上，由于形态常受环境条件的影响，也同样
遇到了特有的困难。应用分子标记技术研究食用蕈菌的遗传多样性，并应用于品种权保护，
已经成为近年的研究热点之一。分子标记具有稳定、迅捷、成本低等诸多优势，但是，不
同的标记技术适宜的种类不同。目前在食用蕈菌中应用较多的有随机扩增多态性 DNA
（random amplified polymorphic DNA, RAPD）、限制性片段长度多态性（restriction fragment
length polymorphism, RFLP）和扩增片段长度多态性（ amplified fragment length
polymorphisms, AFLP），而应用微卫星间区（inter simple sequence repeat，ISSR）技术进行
食用蕈菌的品种鉴定尚未见报道。
微卫星 DNA（microsatellite）是短的、串联的简单重复序列（simple sequence repeat，
SSR），广泛存在于真核生物的基因组，SSR 在种内居群间、个体间存在高度多态性。以
SSR 为基础，发展的 ISSR 指纹技术不需要事先知道 SSR 序列，以 SSR 为引物进行 PCR
扩增，电泳分析扩增产物的多态性。改进的锚定 ISSR-PCR，在序列引物的 3’或 5’端添加
1~7个兼并碱基，将引物锚定在微卫星序列的 5’或 3’端，有效防止扩增过程中引物的滑动，
使 ISSR的稳定性和可重复性显著提高（Grist et al.，1993；Zietkiewicz et al.，1994；Fisher
et al.，1996）。ISSR在柑橘（Fang & Roose, 1994），兰莓（Levi & Towland, 1997）等经济
作物的品种鉴定和种质资源分析方面已取得良好的结果。
本研究对我国 1982年以来栽培的白黄侧耳 P. cornucopiae菌株进行了锚定 ISSR分析，
目的在于探讨 ISSR 技术在食用蕈菌栽培菌株遗传分析中应用的可能性和可靠性，为该种
内菌株间遗传多样性分析、种质资源评价、育种和商业菌株的鉴定、为育种者的品种权保
护提供快速鉴定技术。
1 材料和方法
1.1 供试菌株及其来源
30个供试菌株中，27个为不同年代的商业栽培菌株，主要来自国内食用菌科研单位，
2个作者分别采自山东和云南（序号 23、29），1个引自香港中文大学作为标准菌株（序号
1），所有菌株均保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）（表 1）。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取：采用 CTAB法。
1.2.2 引物：5’端锚定引物 P4和 P5。
1.2.3 扩增反应体系：PCR反应体系的总体积为 25µL，其中 10×PCR缓冲液 2.5µL，dNTPs
（10mmol/L）为 2µL，引物（5µmol/L）为 2µL，TaqDNA聚合酶为 0.75U，模板为 50ng。
阴性对照中用 ddH2O代替模板。
1.2.4 扩增反应条件：扩增反应在 iCycler型 PCR仪上进行，预变性 92℃，5 min；变性 92℃，
1 min；复性 49℃，1 min；延伸 72℃，5 min；30个循环，补平 72℃，7 min。
1期 张金霞等：白黄侧耳 Pleurotus cornucopiae微卫星间区（ISSR）分析 117

表 1 供试菌株及其来源
Table 1 Tested strains and their origin for P. cornucopiae
序号 No. 原号 Original No ACCC No 来源 Origin
1 Pl-30 51233 香港中文大学，1991
2 姬菇 51350 北京市售商品组织分离物, 2001
3 西德 33 50429 河北省食用菌研究所，1991
4 Pg2 51372 四川省农业科学院，2003
5 Pg1 51371 四川省农业科学院，2003
6 大姬菇 50397 辽宁省本溪农科所，1988
7 白秀珍菇 51267 华中农业大学，2001
8 日本姬菇 50340 辽宁省外贸公司，1987
9 上海姬菇 50940 上海市农业科学院食用菌研究所，1999
10 26 51263 华中农业大学，2001
11 33 51268 华中农业大学，2001
12 鸡汁菌 51018 华中农业大学，2001
13 冈崎姬菇 50499 河北省微生物研究所，1990
14 CCEF 89 50596 河北省食用菌研究所，1992
15 珍珠菇 50941 上海市农业科学院食用菌研究所，1999
16 玉蕈 50160 河北省农业科学院，1982
17 Pl-37A 50162 北京市海淀区外贸公司，1982
18 29 51264 华中农业大学，2001
19 30 51265 华中农业大学，2001
20 31 51266 华中农业大学，2001
21 P31 51369 四川省农业科学院，2003
22 P33 51370 四川省农业科学院，2003
23 野生 1 50994 山东省潍坊沂山野生子实体组织分离物，1999
24 冀农 11 50495 河北省农业科学院，石家庄郊区野生子实体组织分离
物，1991
25 黑姬菇 51423 江苏省农业科学院，2004
26 9008 50524 日本，1988
27 8603 50341 辽宁省外贸公司，引自日本，1987
28 姬菇 10 50316 辽宁省本溪市蔬菜办公室，1987
29 野生 2 51455 云南昆明郊区野生子实体组织分离物，2003
30 876 50339 辽宁省外贸公司，引自日本，1987
1.2.5 电泳及数据处理：扩增产物用 1.4%琼脂糖凝胶电泳分离，以 ?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ
作标记，0.5µg/ml EB染色后，用水冲洗后置凝胶成像仪上观察。应用 Gel-Pro Analyzer软
件，以凝胶DNA片段的有无分别记为 1或 0。用统计软件计算菌株间遗传相似性系数，用
UPGAMA法进行聚类分析，构建树状图，进行遗传相似性分析。
118 菌 物 学 报 26卷

2 结果与分析
2.1 电泳图谱
试验表明，5’端锚定引物 P4和 P5都能将供试菌株扩增出清晰的多态性 DNA片断，且
分布均匀，片断多态性 100％。P4将供试菌株扩增出 45个片断，大小在 200~20 000 bp，
每个菌株扩增片断在 6～11个，平均 7个；P5将供试菌株扩增出 39个片断，大小在 500~15
000bp，每个菌株扩增片断在 6～13个，平均 10个。这两个引物的扩增结果都表明，供试
菌株间可能存在一定的重复，表现为二引物的 ISSR 扩增图谱中菌株间的异同呈一致性，
如菌株 18~26之间和菌株 27~29之间（图 3）。

图 1 引物 P4对白黄侧耳 P. cornucopiae部分供试菌株扩增的 ISSR图谱
1~15：菌株序号 1~7，11~15，17，26，29；CK：阴性对照；M：分子标记，?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ
Fig. 1 The ISSR profiles of partial strains of P. cornucopiae by primer P4
1~15: strain No. 1~7，11~15，17，26，29; CK: check；M: marker, ?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ


图 2 引物 P5对白黄侧耳 P. cornucopiae部分供试菌株扩增的 ISSR图谱
1~15：菌株序号 1~7，11~15，17，26，29；CK：阴性对照；M：分子标记，?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ
Fig. 2 The ISSR profiles of partial strains of P. cornucopiae by primer P5
1~15: strain No. 1~7，11~15，17，26，29; CK: check；M: marker, ?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ

2.2 聚类分析
聚类分析在遗传相似性 17％的水平下将 30 个供试菌株划分为 2 大类群，在遗传相似
性 25％的水平下将 30个供试菌株划分为 5大类群，在遗传相似性 40％的水平下将 30个供
试菌株划分为 12大类群，在遗传相似性 61％的水平下将 30个供试菌株划分为 15大类群，
（表 2、图 4），即 15个具一定遗传差异的菌株。遗传相似性程度 100％的可能为同一菌株，
如菌株 18~26之间和菌株 27~29之间。

1期 张金霞等：白黄侧耳 Pleurotus cornucopiae微卫星间区（ISSR）分析 119


图 3 引物 P5对白黄侧耳 P. cornucopiae部分供试菌株扩增出相同的 ISSR图谱
18~26相同，27~29相同；CK：阴性对照；M：分子标记，?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ
Fig. 3 The same ISSR profiles of partial strains of P. cornucopiae by primer P5,
indicating the samilar of No.18~26, the samilar of No.27~29; CK: check；M: marker, ?DNA/HindⅢ+EcoRⅠ
表 2 根据聚类分析白黄侧耳 P. cornucopiae供试菌株的分组
Table 2 Groups divided by UPGAMA for tested cultures of P. cornucopiae
类别 group 包括菌株 including strains
I 1（Pl-30）
II 2（北京市售商品子实体组织分离物）
III 3（西德 33）
IV 4（P2）
V 5（P1）
VI 6(大姬菇)，8-10（日本姬菇、上海姬菇、26）
VII 7（白秀珍菇）
VIII 11（33）
IX 12（鸡汁菌）
X 13（冈崎姬菇）
XI 14（CCEF 89）
XII 15（珍珠菇）
XIII 16（玉蕈），17（Pl-37A）
XIV 18-26（29、30、31、P31、P33、野生 1、冀农 11、黑姬菇、日本 9008）
XV 27-30（8603、姬菇 10、野生 2、876）
3 讨论
本试验表明，虽然 ISSR技术与 RAPD 技术相同，都使用单引物对整个基因组进行随
机扩增，但 ISSR的引物（20nt）较 RAPD（10nt）长，扩增过程中的退火温度高，结果的
严谨度大大提高，稳定性和可重复性更好。与 RAPD、AFLP、RFLP 等比较，锚定 ISSR
技术操作更为便利。
我国栽培的白黄侧耳商业菌株来源广泛，特性多样，栽培中不论色泽、质地，还是子实体
形成温度，都有着显著的性状差异。本试验结果与栽培性状表现的多样性相符，ISSR 分析表
现出了丰富的遗传多样性。但是，也表明我国栽培菌株存在着严重的同物异名现象，ISSR 图
谱完全相同的培养物栽培中没有肉眼可见的性状差别，很可能是相同菌株，属于同物异名。
本研究材料多为栽培的商业菌株，其中 1991年和 1999年分别在河北石家庄郊区、山东
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潍坊山区采集的野生菌株与 1988年开始规模栽培的菌株 26（9008）ISSR图谱完全相同，聚
类分析遗传相似性 100％；2003年云南山区采集的菌株 29（野生 2）与辽宁省外贸公司 1987
年引进推广菌株 30（876）ISSR图谱完全相同，聚类分析遗传相似性 100％，这种结果与自
然界生物发生规律不符，因此，我们推测，这些所谓的野生菌株不是真正意义上的“土著”生
物，很可能是商业菌株的自然转移定植的结果，且这种转移发生在基因自然变异发生之前，
完全是通过双核体传播的，如仿野生栽培，虽然它们发生于不同地理环境，但是仍属于同一
营养亲和群（vegetative compatibility group，VCG），即同一菌株。这种情况也警示我们，在
我国食用菌产业快速发展的同时，自然种质环境正面临人工选育种质的侵蚀或污染，自然界
食用蕈菌野生种质面临着人工选育品种的生存竞争。对此，我们应给予足够的重视。

图 4 白黄侧耳 P. cornucopiae供试菌株 UPGAMA聚类分析 1-30菌株序号
Fig. 4 The cluster analysis used UPGAMA for tested strains in P. cornucopiae1-30 stands for strain no.
以 ISSR 为 DNA 指纹作为植物品种的特性之一已经被 UPOV接受，在小麦、大麦等
作物上应用。中国制定了应用 ISSR指纹方法进行大豆品种特异性鉴定的国家标准（GB/T
19563-2004 大豆种子品种鉴定实验方法 简单重复序列间区法）。分子标记技术成为近年食
用蕈菌品种权保护技术研究的重要方向。Moore et al.（2001）用 20个引物将栽培的双孢蘑
菇 Agaricus bisporus（Lange）Singer 的 14个商业品种和 2个野生菌株进行 RAPD分析，
聚类分析结果可将任何一个菌株分开。Kazuhisa et al.（2002）应用 AFLP技术将日本栽培
的 15个香菇品种进行了有效的区别性鉴定，Saito et al.（2002）应用 RFLP-PCR-RAPD技
术对香菇 Lentinula edodes（Berk.）Pegler栽培品种 rDNA的 IGS区域进行分析，可将 16
个商业品种完全区别开来。张金霞等（2004）以 IGS-RFLP 为分子标记分析了我国白灵侧
1期 张金霞等：白黄侧耳 Pleurotus cornucopiae微卫星间区（ISSR）分析 121

耳 Pleurotus nebrodensis（Inzenga）Quél栽培种质，黄晨阳等（2005）应用RFLP技术将我
国栽刺芹侧耳 Pleurotus eryngii（DC.:Fr.）Quél鉴定为 9个品种。
微卫星（SSR）的存在是 ISSR 技术应用的前提，目前已有多种真核生物的微卫星
（SSR）序列研究注册，为 ISSR技术的应用奠定了理论基础。和其它真核生物一样，白
黄侧耳 P. cornucopiae也存在着丰富的微卫星（SSR）序列（GenBank: AJ430509, AJ430506），
本试验获得的丰富的条带充分证明了这一点。锚定 ISSR技术扩增出白黄侧耳P. cornucopiae
的 DNA片断有着丰富的多态性，便于在商业品种快速鉴定中应用。
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