全 文 ：真 菌 学 报 1 2( 2): 18 5一 6 1 2, 1 9 9 3
A e t a M夕 e o l姐 i e a S i n i e a
金顶侧耳酸提水溶性多糖的研究
— P C一3 的分离 、 纯化与结构确定张丽萍 李森 黄丽萍
(东北师大生物系 ,长春 1 3 0 0 24 )
摘要 金顶侧耳 ( p l o u r o t x , c i , r 。` 口夕i l o a ` , s ) 子实体的 3% 三氯乙酸提取液经甲醇分级 ,十六
烷基三甲基澳化按等进一步提纯得到水溶性多搪 P C 一 3 。 经 s “ p h “ ` “ s “ C L 一 4B 柱层析 ,醋酸
纤维素薄膜电泳 、 聚丙烯酞胺凝胶电泳鉴定 , P C 一 3 为 .均一级份 。 .G .c 与 .P .c 分析表明 , G “ 1、
M : n 为该多糖的组份 ,其单糖摩尔比为 2 . 5 : 1 . 0。
P C 一 3 的分子量约为 6 7。。。 , 比旋光度 t a] 犷~ + 2 8“ 。 经核磁共振谱等分析 , P C 一 3 不含户
型糖普键 。 部份酸水解 、高碘酸氧化 、 s m i ht 降解 、 完全甲基化 、 .G .C 及 G . .c 一 M · .s 的分析
表明 , P C 一 3 是由 “ ( l、 6 ) 糖昔键相连的半乳糖构成分子的主链 ,部分残基 c : 上带有分支 ,
每 5 个 G a l 残基带有 1个侧链 ,侧链为 a ( 1一 2 ) M a n 一 a ( 1一 2 ) M a n o
关键词 金顶侧耳 ; 多糖
金顶侧耳 p z。 “ r 口 , , : ` i t ; i n o p i z。 a , 二 : 属担子菌纲 、伞菌目 、 侧耳科 、 侧耳属。 其子实
体不仅味道鲜美 ,而且具有滋补强壮 、治疗肺气肿等药用功效 。 随着云芝多糖 、 树舌多搪
等在临床上的广泛应用 ,真菌多糖的研究日益受到人们的重视 。我们对金顶侧耳多糖进行
了较全面的研究 , 本文主要报导金顶侧耳酸提水溶性多糖 P C一 3 的分离纯化及结 构 确
定。 国内 、 外尚未见到这方面的报导 。
材 料 和 方 法
(一 ) 主要测试方法与仪器
1
. 多糖组成与含量分析 : 采用 G . C . (s P 一 , 01 型气相色谱仪 、 氢焰离子化检测器 、 3 m m x Zm 不锈
钢柱 、 3% s E一 3 0 固定液 、 c h r o m o s o r b w 、 8 0一 1 0 0 目担体 )与 p · c · (展层剂为正丁醇 : 乙酸 : 水 ~ 4 :
1: 5 ,上层 )法测糖的组成 ; 酚硫酸法测糖的含量 (梁忠岩 ,张翼伸 , 1 9 8 3 )
2
. 多糖纯度鉴定 : 采用 s e p五a r o s e C L 一 4 B 柱层析 ( 9 0 x 1 . s c m , 1% N a c l 洗脱 , 2· 2 m l八 Zm i n ) ;
醋酸纤维素薄膜电泳 (膜 0 . , x 1 2 m m , 电压 2 20 v , 时间 20 m in ) ; 聚丙烯酸胺凝胶电泳 (电压 6 0 v , 时
间 2 小时 ,西夫试剂染色 ) ;紫外分光光度法 ( 2 6 0n m 、 2 8 o n m ) ;冻融分析 ( 一 10 ℃结冰 ,室温融化 , l o 0 0 0 r /
nI i n 离心 )等方法 (陈西广 , 张翼伸 , 19 9 0 )
3
. 分子量测定 : 采用 s e p五a r o s e c L 一 4 B柱层析 (条件同上 ) ,用标准葡聚糖 l o o 0 K d 、 5 0 0 K d 、 1 5 3 K d 、
8 4 K d 为对照 ,酚硫酸法测多糖分布 ,以 L g M w 对洗脱体积 v “ 作标准曲线 。
4
. 多糖构型分析 : 采用红外光谱 ( s p e o e r d IR 红外光谱仪 K Br 压片 ) 与核磁共振谱 ( B r u k e r
1 99 1
一
10
一 0 6 收稿。
国家自然科学基金资助项目。
本文承蒙张翼伸教授审阅 ,并提出宝贵意见 ,特此致谢 。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1993. 02. 013
2 期 张丽萍等 : 金顶侧耳酸提水溶性多糖的研究 1 5 9
A c一8 0 仪 )分析( 周义发 ,张翼伸 , 1 9 9 1 )
,
. 多糖与 C o n A 的定量沉淀反应 : 按 p r e o b r a z h e n s k a y M E , R o s e n f e l d E L , ( 1 9 7 5 ) 方法进行 。
6
. 多糖的结构确定 : 高碘酸氧化 , s o i t五 降解 , 完全甲基化 , 部分酸水解分别按 N ir m ol e n du R
( 一9 7 8 ) , H a k o m o r i 5 1 (一9 6 4 ) , H a k a二 B ( 1 9 6 7 )等方法进行 ,甲基化 、 乙酞化产物经 H p , 9 5 5 A G . c一
M
.
s
. 仪分析鉴定 (由东北师大分析测试中心协助测试 )
(二 ) 多摘的分级与纯化
金顶侧耳子实体 I K g 十 8 L 3% 三氯乙酸
巧℃ , 2 4 小时过簿
俨聆邺夏磊怒
水不馨, {缨二`
{
沉淀水溶 、严析 、 “ 心 _ l上蔓霆号纂笋浓
}残渣漂洗至中性 ; 。。℃水提今 3刁、时 火 3
残渣弃 i
簿液浓缩 、 加 3倍乙醇
上清弃 沉淀 ( P C一 4 )
醇乙倍屯ù加上清
!
l
.IV
}上清加 3倍乙
{
醇瓤
{一几
沉淀弃 上清弃 {
沉淀 (调成 2% 溶液 )加等体积 0 . 1 , M C e t a v l o n P H S
的硼酸盐缓冲液
上清弃 沉淀
( P C
一
1 )
沉淀
( P C
一 2 )
上清弃 i
二 H Z O之 · ` s” “ ` 法脱 ’ 白
P C一 3
结 果 与 讨 论
金顶侧耳子实体的 3多三氯醋酸提取液 ,用 20 多N a 0 H 调至中性后 ,离心去掉水不溶
牟县助召
。6,op
V e f m ;
“
图 1 P C 一 3 在琼脂糖 图 2
下 9 1 1· C h r o m a t o g r a m o f
C L一 4 B
C L
一
4 B
P C
一
3 c
c o l u m n
上层析
a S e p il a r o s e F i g
.
2
P C 一 3 的分子量测定 (琼脂塘 C L一略B 柱层析 )
D e t e r m i n a t i o n o f P C 一 3 m o l e c u l a r w e i g h t
(
e h r o m a t o g r a m o n S e P h a r o s e C L
一
4 B e o lu m n )
1 2卷
仁 J通,J.0仪.0
ǎ,日à酬Vuoog于似蝇
4 0 0 0 3 6 00 3 2 00 2 800 24 0 0 加 00 10 0 0 12 00 8 00 e m -1
0 0
.
2 0
.
4 0
.
6 0 8 1
.
0 1
.
2 1
.
4
加入样品中的 C o n A量 ( m g)
图 4 P一 3 同 C o n A 的定量沉淀曲线
F 19
.
4 C u r v e o f q u a n t i t a t i v e p r e e i P i t a t i o n
o f P C
一
3 w i t h C o n e a n a v a li n A ( C
o n A )
男啪幻70印54加
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谱ó光tr妙孵。的.R时LP3 3.g图iF
P C
一
3 的 ’ H一核磁共振谱
19
.
,
I
H一 N M R s p e c t r u m o f
图
F i P C
一
3
图 6 P C 一 3 的 ` 3 C一核磁共振谱
F 19
.
6
1 3
C
一
N M R s p e e t r u m o f P C
一
3
物 。 其水溶性糖经甲醇分步沉淀 。 取收率大 ,醇浓度达 75 多 的级份经十六烷基三甲基澳
化钱进一步提纯 , eS v ag 法三次脱蛋白 , H ZO Z 脱色得到乳 白色粉末 ,定名为 P c 一 3 。 该
多糖经 S e p h a r o s e C L 一 4 B 柱层析为单一对称峰 (图 1 ) 。 在 2 6 o n m 及 2 8 0 n m 进行紫外
吸收检测 ,表明多糖中不含游离或结合的核酸 、 蛋白类物质 。 经醋酸纤维素薄膜电泳 , 聚
丙烯酚胺凝胶 电泳进一步检测 , 均为一条带 ;冻融后高速离心无沉淀 , 表明 P C 一 3 为级份
均一的多糖。
P c 一 3 为半乳甘露聚糖 , .G C . 分析表明 , G al : M an ~ 2 . , : 1 . 0 (摩尔比 )。 经凝胶
过滤法测定 ,并与同一条件下已知分子量的葡聚糖的标准曲线相比较 ,其 Mw 约为 6 7 K d
(图 z ) p C 一 3 在冷水中即 ,可溶解。 比旋光值 [a ]碧。 一 + 2 8 “ ( C Zm g /m l , H Zo ) 。 红外
光谱分析 8 0 一 8 10 o m 一 , 具甘露糖的特征吸收峰 ,而 8 9 0 0 m 一 ` 处无吸收峰 , 说明该多糖
不具 月型糖昔键 (图 3 ) 。
P e 一 3 同 e o n A 在 0 . 0 2 M p B s 中 , 2 5℃保温 2 4 小时后 3 0 0 o r /m i n 离心 3 o m i n ,
沉淀经 o . I M D 一甘露糖溶解 ,经考马斯亮兰 G 2 50 定量测定沉淀中的 C on A 含量 ,图 4
张丽萍等 :金顶侧耳酸提水溶性多糖的研究
是 C P一 3 与 C o nA 的定量沉淀曲线 。 因为 C o nA 只与大分子多糖处非还原末端的 a -
G l c或 a 一M a n残基相互作用而形成复合物 , 这就提示我们 PC 一 3 中一定有相 当数量的
M a n 处于分子的非还原末端且为 a 构型 。
P C 一 3 的 ’ H 核磁共振谱 (图 5 )中 , C : 质子区的信号峰在 5 . OP pm 以上 ,指明 PC 一 3
为 a 一糖普键 ,与水野卓 ,林克幸 ( 1 9 8 1 )的文献对照 ,可确定 5 . o 4 p p m 为 a 一 G a l 峰 , 5 . 16
P m 为 a 一M an 峰 ,对于 4 . 5 0P m 以下的信号区 , 目前尚不能解析 。 P c 一 3 的 ’℃一核磁
共振谱 (图 6 ) ,其 C : 信号区中 ,可以确定 9 8 . 6 p p m 为 G a l 峰 , 一0 3 . , p p m 为 M a n 峰 ,
7 6
.
2 p pm 为 G a l 的 C Z 信号峰。
P c 一 3 经 0 . o l N H Zs o ; 于 10 ℃ 水解 4 小时 ,蒸馏水透析 。 袋内级份干燥后经测定
糖组成仅检出 G a l 。因为 1、 6 糖昔键对弱酸水解相对稳定 ,提示 G a l 残基间可能以 l *
石昔键相连 ,并构成分子的主链 。 透析袋外部分仅检出 M a n ,提示 M二 可能因位于分子
的边缘 , 因而在弱酸条件下即可切断与分子的连结。
P C 一 3 经高碘酸氧化 , 1 0 h8 r 反应完全 。 平均每摩尔己糖消耗 10 不 1 . 56 m ol , 产生
甲酸 0 . 69 m ol 。 高碘酸消耗量稍大于甲酸生成量的 2 倍 , 说明己糖可能多以 1、 6 糖普键
相连或处于非还原末端 ,而其它键型相连的己糖所占比例较小 。
lo 不 氧化的一部分产物经 N aB H ; 还原后进行完全酸水解 , G . c . 分析仅检出甘油 ;
另一部分产物经 s m it h 降解 ,透析袋内袋外均未检出任何糖。 这进一步说明 ,己糖间只
能以 ( 1、 6 ) 、 ( 1 0 2 )糖普键存在 ,或处于分子的非还原末端 ; 无论主链或支链均不存在抗
10 不氧化的糖营键。
P c 一 3 经 H a k。 m o ir 法进行三次甲基化 ,红外光谱检查反应进行完全 。 将甲基化糖
进行完全酸水解 , N a B H。 还原 , 乙酞化 ,经 G . C . G . C se M . s . 分析得到各种甲基化单糖衍
生物 (表 1 ) 从表 l 数据可见 , 2 , 3 , 4 一 G a l与 3 , 4一 G a l 占甲基化糖的 6 9多 , a ( 1一 6 ) G a l
构成了分子的主体。 根据高碘酸氧化原则 , 只有连三经基 ( 1、 6 )昔键或处于非还原末端
的每摩尔己糖能产生 1 m o l 甲酸 ,并消耗 Zm o l 10 不; 1 , 2 糖昔键只消耗 l m o l 10不但
不产生 甲酸。 据此原则推算 , P C 一 3 中每摩尔己糖应消耗 1 . 68 m o l 10 不 , 产生 0 . 68 m o l
甲酸 , 此结果与高碘酸氧化 P C 一 3 的实验数据相接近。
T a b l e
表 1
G
,
C
,
P C
一
3 各甲荃化 、 乙硫化单箱衍生物的 .C C
a n d G
.
C 一 M
.
S
.
o f a l d i t o l a c e t a t e s d e r i v e d
与 M . S . 分析
f r o m m e t h y l a t e d P C 一 3
甲基化单糖
M e t h y l a t e d s u g a r
摩尔比 主要碎片离子的 m / e
M o l a r r a t i o M a i n o a s s f r a g m e n t m /
e
连结方式
M o d e o f l i n k a g e
,` ùU石户O山令nU,`上,ù.….二``,` .三2 , 3 , 4 , 6一 M a n2 , 3 , 4 一 G a l3 , 4 一 G a l
3
,
4
,
6一 M a n
斗3 , 4 5 , 7 1 , 8 7 , 1 0 1 , 1 17 , 12 9 , 1 4 5 , 1 6 9 , 2 0 5
4 3 , 8 7 , 9 9 , 10 1 , 1 1 7 , 12 9 , 16 1 , 1 8 9
4 3 , 8 7 , 9 9 , 1 8 9 , 2 3 3 ,
43 , 4 5 , 8 7 , 9 9 , 1 0 1 , 1 17 , 1 2 9 , 1 6 1 , 18 9
综合上述各项实验结果 ,可 以认定 , P C 一 3 的分子结构为 a( 1 、 6) G a l 构成分子 的
主链 ,部分 G al Z位带有分支 ,约每 5 个 G al 残基带 1个侧链 ,侧链由 2个 M an 残基
组成 ,均为 ( 1、 )z 昔键连结。
真 菌 学 报 , 12 卷
参 考 文 献
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3 2 2
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一Où
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飞JII.3d
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L E A T U S— IS O L A T IO N , P U R I F IC A T IO N A N DS T R U C T U R A L D E T E R M IN A T IO N O F P C 一 3
Z H A N G L i
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o g e n e o u s b犷 e h r帅 a之o g r a P h y o n Se P h a r o s e CL 一 4B e o l u m n a n d b y e e l l u l o s e
a e e t a t e f i lm e l e e t r o p h o r e s i s
, e t e
.
P C名 e o n t a i n s G a l a n d M却 i n a m o la r r at i o of 2 . 5 : 1 . 0 . I t s
m o l e e u l a r w e i g h t 15 a b o u t 67 0 00
.
T h e s t r u c tu r e of P C一 w a s d e t e r m i n e d by Pe r i o d a t e o x i d a t i o n ,
Sm i毛h d e g r a t i o n , m e th y l a t i o n , G . C , a n d G . C一M
.
5
. ,
1
.
R a n d ’ H
一
N M R
, ’ ,C 一N M R e t e
.
T h e
m a i n e h a i n o f p C
一
3 m o l e e u l a r 15 e o m Po s e d o f a ( l` 6 ) l i n k e d G a l , s id e e h a i n i s a ( 1、 2 ) M a n ,
K E Y W O R D S p l
o u r o t “ 5 c i t r i” o 户i l e a t “ , ; p o l y s a e e h a r id e