全 文 ：菌 物 系 统 19 (4 ) : 5 76一 579 , 20 00
几如e o 秒 s et m a
猪菩菌丝细胞活性氧的产生及其种类 *
夏洪燕 郭顺星 * *
( 中国医学科学院 中国协和 医科大学药用植物研究所 北京 10 00 9 4)
摘 要 : 用液体发酵的蜜环菌菌丝 、 菌丝细胞壁及发酵液作为激发子 , 分别处理猪等菌丝 , 均
可诱导猪荃菌丝活性氧的产生 。 活性氧产生量与激发子浓度具相关性 。 超氧化物歧化酶
(S O )D
、 过氧化氢酶 (C A T ) 、 甘露醇均可在一定程度上抑制活性氧的产生 ,证明活性氧种类包
括过氧化氢 (乓 0 2 ) 、 经基 自由基 ( · O H )和超氧根阴离子 (O夕一 )o n heP ny le ne io d二um (DP D
能削弱激发子对活性氧的诱导 , 表明 oz’ 一 来源于 NA D p日 氧化酶 。
关键词 : 猪等 , 活性氧 , 激发子
中图分类号 : Q 9 3 3 文献标识码 : A 文章编号 : 100 7一 3 515 (20 00 ) 0 4一0 57 6一 5 79
活性氧是由于 q 的连续的单电子还原而产生的一系列高反应性的中间产物 , 几乎所有的需氧生物
都可以产生 。 一般认为活性氧对生物机体是有害的 , 然而在一定情况下 , 活性氧的适度增多对生物却是
有利的 (方允中等 , 19 95) 。 植物受病原菌侵染时 , 在短时间内可 大量释放活性氧即活性氧迸发 (eD ke ,
195 3 ; B血 r e t a l . , 19 9 3 ; s ehw 朗坛 & H a g e r, 199 2 ; 刘曼西 & 心 la t tu k u勿 , 19 96 ) ,迸发的活性氧在植物
防御病原菌侵染的过程中起着重要作用 , 如直接杀死植物病原菌 、 诱导植物产生防御结构以及水解酶等 。
真菌如酵母菌在法尼醇 、 二甲奈酿诱导下也可发生活性氧迸发 (Y a ln as h ioj 。 t .al , 1991 ; M ac hi da et .al ,
19 8)
, 但两种真菌相互作用时能否产生活性氧及其产生的机制尚未见报道 。
猪菩 、 蜜环菌属于特殊的真菌与真菌间的共生关系 , 猪荃受蜜环菌侵染后产生的防御结构与植物抗
病反应产生的防御结构类似 , 而活性氧在植物防御结构形成过程中起着重要的作用 , 由此推测在猪菩受
到蜜环菌侵染初期也可能伴随着活性氧迸发 。 来源于病原菌的激发子同病原真菌一样 , 也可 以诱导植物
防卫反应 , 包括活性氧的释放 。 用蜜环菌菌索制备的激发子处理猪荃菌丝细胞比用蜜环菌与猪荃共培养
具有更大的优越性 , 不但简化了操作程序 , 而且排除了蜜环菌对猪荃活性氧测定的影响 。 本文以猪荃菌
丝为材料 , 研究了蜜环菌激发子处理后猪菩活性氧的产生机制及其种类 , 该研究有助于进一步阐明猪荃
与蜜环菌的共生机理 。
1 材料和方法
L l 菌株来源
猪菩 G r沙 la u m be l la at 和蜜环菌 月八月 il la r ia 耀 le a 菌株由本所真菌室提供 。
1 .2 蜜环菌激发子的制备
将蜜环菌菌种转接到麦款半固体培养基上 , 培养基组成 : 麦熬 5% , 葡萄糖 2% , K H Zp o 礴 3% , gM s q
·
7坟0 0 . 150/ , 琼脂 .0 4% 。 培养三周待菌索布满培养基后用滤纸过滤 , 滤液为蜜环菌的发酵液 ,其余部
分用水冲去培养基 , 收集菌索 , 经布氏漏斗抽滤后称重 。 用万能粉碎机粉碎成匀浆状后 , 超声波处理 3
* 国家 自然科学基金资助项 目 (N b : 3 9 5 7 0 01 2)
* * 通讯作者
收稿日期 : 2 0 0 0刁 l佗4 , 修稿日期 : 20 0 0一3一 16
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 2000. 04. 029
4 期 夏洪燕等 :猪菩菌丝细胞活性氧的产生及其种类 5 7
次 , 每次 s m in , 40 0 r八11 in 离心 s m in , 上清液为胞内提取液 。
细胞壁制备参照 Me s se ne r & uK hi e k( 19 90) 的方法改进 : 在已打成匀浆状的蜜环菌菌索中加人少许
T B S 缓冲液 (0 . lm o l /L hT s
~
H C I
,
2
m
o l / L E D叮A , l% SDS )
,搅匀 , 超 声波处理 l而n 后 , 350 0对1l l i n
离心 s m in , 弃上清 , 残渣再用 T B S 悬浮 , 如此重复三次 , 最终得到的沉淀分别用 乙醇及蒸馏水洗涤两遍
后 , 所得沉淀即为菌丝细胞壁 。 取一部分细胞壁 120 ℃灭菌 20 m in 备用 。
1 .3 激发子诱导试验
将培养三周的猪荃菌丝用分析介质 (2 % 蔗糖 , 1 ~ ol/ L N巩 Po 4 . 2从0, 1~ ol/ L (N l l劫) Z Sq ,
lm m o l /L K N o 3
,
l
m
o l/ L C a o
Z · 2乓 o , sm o l / L Z
一
(-N 吗啡 )乙磺酸洗涤三次后 , 按 o · 2 9m/ l重新悬浮在
相同的介质中 , 25 ℃ , 1 2 0 r/ m in 振荡培养 1. h5 后 , 加人不同的激发子 。 除有特殊说明外 , 所用激发子均为
未灭菌的菌丝提取液 , 浓度为 16 . 2mg m/ L
1 .4 活性氧测定
用 luln in ol 化学发光法测定活性氧 。 仪器为 K H4 6 3A 一 自动定标器 。 参照 。 az e ne r et al ( 19 91 )配制
lum i
n o l母液 。 反应体系组成 : l . s m l 猪菩悬浮液 , 2 00 0 1激发子 , 40 0 0 1 Z om o l / L 凡 [eF (CN) 6 ]
,
26 00 1
lum in ol
。 所有试剂的 p H 均调至 .7 0 。 S O D 、 c A T 、 甘露醇测量时加人 , 而 DP I与激发子同时加人 。 除有特
殊说明 , 均在加人激发子后 80 m in 测定活性氧 。
2 实验结果和讨论
2
.
1 来源于蜜环菌的不同激发子对猪菩活性氧产生的影响
1 2 0 0 0 「 1 2 0 0 0 r
9 0 0 0
截卞交 6 0 0 0蓝
来
3 0 0 0
9 0 0 0
00n
一b
撅老交蓝米
3 0 0 0
图 1 来源于蜜环菌的不同激发子对猪等活性
氧产生的影响
a
.
C K b
. 蜜环菌发酵液 c . 未灭菌细胞壁 d . 灭菌
细胞壁 e . 未灭菌的菌丝提取液 仁 灭菌菌丝提取液
R g
.
1 E fe
c t o f id fe er
n t e li e i ot sr f ll 〕m 凡 m e l le a o n
0 2 5 5 0 7 5 1 0 0
蜜环菌激发子处理后时间 (分钟 )
- , -
.
0 m g / m l se们 se . 2 . 7 m g /口 l
- 泊尸 - 5 . 4呢 /耐 一 (卜一 10 . s gm /耐
一杀一 ` 16 . Zgm /m l se . e 3 2 . 4 gm /耐
图 2 猪荃活性氧产生与蜜环菌
激发子浓度的关系
ht e g e n e ar it o n o f ac it v e
G
.
u用 b e lal at (lA l d a t a
。 x y g e n Spe c l e s I n
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e n s pe e i e s i n G
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(lA l d
a t a a er me asn of
t】l r e e e x pe ir me snt e ac h)
从图 1可 以看出 ,来源于蜜环菌的发酵液 、 菌丝提取液及细胞壁均可诱导猪荃活性氧产生 , 以细胞
壁 、 菌丝提取液诱导效果最好 , 说明具有激发活性的物质主要存在于菌丝细胞内和菌丝细胞壁 。 不论是
菌丝细胞壁还是菌丝提取液 , 灭菌后诱导活性氧产生的能力均比未灭菌的强 , 其中经高压灭菌的菌丝提
取液诱导活性氧产生的能力较未灭菌的菌丝提取液提高约 3倍 , 比对照提高约 10 倍 。 来源于真菌的激发
子通常是一些小分子物质 , 如葡聚糖 、 -N 乙酞葡萄糖胺 、 不饱和脂肪酸及糖蛋白 。 本试验中灭菌后的蜜环
5 7 8 菌 物 系 统 19 卷
菌丝提取液诱导活性氧产生的能力较未灭菌的强 , 可能前者所含的具有诱导活性的物质遇热不稳定 , 在
高温高压灭菌过程中发生了变化 ,分解成小片断或与别的物质结合从而提高诱导活性 。
.2 2 猪等菌丝活性氧产生里与蜜环菌激发子浓度的相关性
我们曾用干燥蜜环菌的菌索提取液处理猪等菌丝 , 发现干燥菌索提取液可 以诱导猪荃菌丝活性氧迸
发 , 迸发高峰分别在 10而 n 和 9 0而 n 。 据此 , 选择加人激发子后 10m in 、 6 0而 n 、 80 m in 和 10 0 m i n 时测反应
性氧 一 lum in ol 化学发光值 。 比较不同浓度激发子在不同时间对猪荃活性氧产生的影响 , 结果表明 (图 2) :
低浓度激发子 (< .2 7m g m/ l) 对活性氧产生无影响 , 而高浓度 (>5 . 4m g/ 而 )激发子处理 10 分钟即可诱导猪
荃活性氧的产生 , 并且随着激发子浓度的增加 , 活性氧产生量也逐渐提高 。 处理 S Om in 时 , 猪等活性氧积
累量与激发子浓度的正相关性尤其明显 。
.2 3 S O D
、
C A T
、 甘露醇对蜜环提取液诱导猪等细胞活性氧产生的影响
s o D 可以通过以下反应清除 O歹一 :
2 oz’ 一 + 2H ` 丝旦乓q + q 。 以 T 、 甘露醇分别是 乓q 、 · o H 的清除剂 。 将蜜环菌激发子与猪荃细胞
共育 8 0m in 后 , 分别加人 SO D 、 C A T 和甘露醇 , 发现三者均明显降低 1~ m ol 依赖的化学发光值 (图 3)
,
抑制率分别为 48 . 7% 、 62 .4 % 、 58 .0% , 表明猪荃细胞产生的活性氧包括 O歹一 、 坟q 、 · o H。 s 0 D 、 CAT 是不
易透过细胞膜的酶 , 它们对活性氧产生的抑制说明 o 二一乓q 主要产生于细胞膜外 。
ǎ乞工乙粼卞竞盏呆
,ó八UOùbJL二2
ǎ七工Kà撅卞免兰歌
0一 O L es山~ L 一动一~ ` ~ L es ` es司E E + e AT E+ s o D E+ 甘露醇 0 x 2 . 5 2 5 5 0 20 0图 3 超氧化物歧化酶 、 过氧化氢酶和甘露醇对 DPI 浓度 p mol L/蜜环菌激发子诱导的猪等活性氧产生的影响 图 4 DP I对蜜环菌激发子诱导的猪荃菌丝lF g · 3 E f]七c t o f S O D, C A T an d m anrU t o l o n ht e 活性氧产生的抑制g e en ar it o n o f ac it v e o x y g e n s详 c i e s i n G , u胡b e lla tQ · R g . 4 胧e t o f 侧 o n 山e g e en ar it o n o f ac it v e曰 ie iot sr aer au oct lav e d ( lA l dat aer m e an s o f o x y g e 。 s p e e i e s in G . um 占e l l a at ( lA l dat aer m e an slhr e e e x详 ir m e n st e ac h) o f t l l r e e e x 详 ir m e n st e 朗h).2 4 D P I 对蜜环菌激发子诱导猪等细胞活性氧产生的影响位于质膜的 N A D P H 氧化酶是哺乳动物活性氧的主要来源 , 在该酶的作用下 , N A D PH 将电子传递给分子氧而形成 oz’ 一 。 lDP 是 N A D甲H 氧化酶的抑制剂 , 它可以与 N A D p H 氧化酶的核黄素结合 ,从而抑制电子的传递 , 阻断活性氧形成途径 。 植物中 N A D p H 氧化酶也是产生活性氧的来源之一 ,推测真菌中活性
氧产生也有 N A D p H 氧化酶的参与 。 向猪荃悬浮细胞中加人不同浓度 DP I , 发现低浓度的 DP I对活性氧
产生无影响 , 而高浓度的 DP (I > 25 协m ol / )L则可以抑制活性氧产生 ( 图 4) , 表明 N A D甲H 氧化酶可能是猪
等细胞受激发后产生 0夕一 的来源之一 , 但关于这方面研究还需直接的实验证据 ,如用 NA DP H 氧化酶的
抗体进行 W e s et m 杂交 。
4 期 夏洪燕等 :猪菩菌丝细胞活性氧的产生及其种类 57 9
【参 考 文 献 l
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