全 文 ：山 地 米 共 生 物 母报 17 ( 2 ): 92一 5 9, 1 9 9 8
J o u r n a l o f M
o u n t a in A g r i e u l t u r e a n d B i o l o g y
鸡油菌及其伴生细菌的组织分离
辛智海
(贵州大学植保系 贵阳 5 5 0 0 2 5)
摘 要 1 9% 一 19 7 年 用子 实体组织分 离法成 功地分 离获得 了鸡 油 菌菌丝 体的 纯培养 。 文中详
细介绍 了鸡 油菌及其伴 生细菌的组织分 离法 , 并对鸡 油菌菌丝体的培养特征进行 了观察和描述 。
关键词 鸡 油菌 组织分 离 伴生细 菌
中图分类号 56 4 6 . 4 Q 9 3一3 35
I s o l a t i o n o f C恤n t h er a l l u s e i ba r i u s a n d b a e t e r i a a s s o e i a t e d w i t h fr u i t b o d y t i s s u e b y e u l ·
t u er o f fr u i t b o d y t i s s u e
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J o u r n a l o f M o u n t a i n A g r i e u l t u r e a n d B i o l o g y
, N o : 2
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9 2 一 9 5 ,
1 9 9 8
,
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4 1
爪 n lZ 认 a i (及加 r t m e n t of lP a n t p r o ect t ￡o n , 阮 i幼 o u nU ￡, sr i yt , G u明 n g , 55 002 5 , lC i n a )
A加 t r a e t F r o m 199 6 ot 199 7 , p u r e e u lt u r e s t r a ins of 山 ” t h e ar l l u s c枷 r iu s w e r e iso la t e d 加m it ` 5 f r u it
b ed y t is
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In t h is p a p e r t h e m e t ho d
s fo r iso la t io n o f 山 n t h e ar l l u s c艺ba r iu s m y e e l ia a n d b a e t er ia a soc i
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, a n d t h e e u l t u r e e ha
r a e t e r s o f m y e e li a w e r e o b s e r v e d
a n d d es e r i b e d
.
K e y w
o r
ds 众 n ht e ar l l u s c i ab r 艺u s b a e t e r ia iso la t io n
鸡油菌 (反nt he ar ZZu : 。 i ab ir u : F r . )又名杏菌 、黄丝菌 ,是著名的世界性食 用菌 。 该菌不仅
香气浓郁 、颜色悦 目 、鲜美可 口 , 而且具有很高的营养价值和药用价值 〔’ 〕 。
我国鸡油菌及其相关种属的野生资源非常丰富 , 但对其利用仍依赖于野外采集 2[] 。 目前
国内外关于该菌的人工驯化研究 尚处于起步 阶段 , 纯培养分离是人工驯化 的基础工作 。 长期
以来国内外关于鸡油菌的纯培养分离 、 甚至半人工栽培的研究虽有报导 〔3 , 4 〕 , 但 随后的研究表
明其方法 的可靠性 和重 复性较 差 , 造 成这 一难题 的主要原 因是 分离 过程 中严重 的细 菌污
染 〔5 〕。 1 9 8 5 年 st ar at s m a 等〔“ ]成功地分离获得了鸡油菌的纯培养 ,并用 D N A 杂交试验 ( D od -
b lo t h y b r id iz a t io n )确证 了分离物的可靠性 , 1 9 9 0 年 E r i 。 D a n e l l & N i l s F r i e s 等 [7 , “ , 9 ]进一步证
实和发展了 S t r a a t s m a 等的分离方法 。 1 9 9 3 年 E r i。 D a n e ll 等 [7 〕证实了子实体组织 中伴生细菌
的存在 。 鉴于国内在这方面工作的欠 缺 , 1 9 9 6 年和 19 9 7 年笔者从 贵州省贵 阳市花溪 区 的马
尾松林 中采集 了大量的鸡油菌子实体 ,参考 E ir 。 D an el 等的方法 ,进行了菌丝体和伴生细菌的
组织分离 , 成功地获得 了鸡油菌及其伴生细菌 的纯培养 。
收稿 日期 : 1 9 9 8一 0 2 )一 2 3
DOI : 10. 15958 /j . cnki . sdnyswxb. 1998. 02. 007
第 2 期 辛智海 :鸡 油菌及其伴 生细菌的组织分离
1 材料和方法
1
.
1 鸡油菌子实体的采集
鸡油菌 ( Cat n he ra ZZu : 。 iba riu : F r . ) 。 每年 6 月底到 10 月初 的雨 后采于 花溪桐 木岭 、 杨
中 、青岩等地的马尾松林地上 。 选取表面无虫眼 、无破损 、无褐斑的子实体 , 从根部带少许土逐
一挑取 ,用无菌吸水纸将菌柄基部及带土部分包住 , 用无菌棉花粘去子实体表 面杂物和尘 土 ,
再用无菌吸水纸将其轻轻包住 ,放人容器 内以免挤压造成损伤 。
1
.
2 培养基
1
.
2
.
1 M S 培养基 成分和贮备液配制参考文献 【8 ] 。 蔗糖终浓度 2 % , 琼脂 1 . 2 % (用 95 %
洒精浸泡过夜后 , 用蒸 馏水浸洗 ) 。 各 组分分 别灭菌 ( 68 64 6 . 5 m P a , 2 0 m in) 后混 匀 , 加入
0
.
02 % 的活性碳粉 , 用 1 N H C L 调 p H 至 4 . 2 一 4 . 5 ,冷却至 60 ℃ 以 下加人抗生 素 (氨节青霉
素钠盐 50 m g几 ,链霉素 50 m g几 ) 。 然后分装平板或斜面 。 维生素和抗生素过滤灭菌 。
1
.
2
.
2 FM 培养基 成分参考文献 【9 ] , 贮备液配制方法 同上 。 其 中酒 石酸按 、葡 萄糖 、 琼脂
分别单独灭菌 。 抗生素用量与 M S 相同 。
1
.
2
.
3 分 离综合培养基【3] 。
1
.
2
.
4 P D A 培养基 〔10] 抗生素用量 同上 。
1
.
2
.
5 酸性麦 芽汁培养基〔1 0] 抗生素用量同上 。
1
.
2
.
6 C E A (鸡油 菌子 实体浸 出液 )培养基〔7 〕。
1
.
2
.
7 K B ( K i n g
’ s B )培养基 [ 7 ] 。
1
.
3 鸡油菌的组织分离
采集后 2 4 h 内选取较幼嫩的 、 菌盖尚未完全发育 、菌柄结实的子实体作 为分离材料 。 除
去菌柄基部泥土 ,用无菌吸水纸将菌柄基部包住 , 于超净工作 台上用无菌解剖刀和镊子剥去表
皮层 (由于子实体组织含水高且吸水性强 ,不易进行表面消毒 ) , 取菌柄至菌盖之间的菌肉组织
块切成 3 m m x 3 m m x s m m 大小 ,接于平板或斜面上 ,每皿 ( 9 0 m m )接 3 块 , 每管 1 块 。 在组
织块周围和表面洒上少许活性碳粉 (不能影响观察 ) 。 用 P ar af il n 、 将培养皿 封 口 以 免水 分蒸
发 ,放人 20 ℃ 培养箱 ,于黑暗下培养 。 第 1个 月内每 10 d 观察 1 次 , 若有菌丝长 出者多为霉
菌污染 ,将未被污染的组织块及时转人新制的平板或斜面继续培养 。 30 d 后每 s d 观察 1 次 ,
几乎所有组织块周 围有不 同程度 的细菌生长 ,其 中细菌感染较弱 的组织块表面或周 围若有黄
色或 白色菌丝体发生 ,显微观察有锁状联合者转 人 F M 斜面保存 。
1
.
4 伴生细菌的分离计数
于采集后 2 4 h 内取 20 个子实体 ,用解 剖刀 去皮后取菌肉组织 10 9 , 于无菌研钵 内研磨成
浆 ,然后 10 倍 系列稀释至 10 一 “ 。 每稀 释度取 0 . 1 m l 涂布于 C E A 及 K B 平板 ( 90 m m )上 , 25
℃培养 4 8 h 后进行菌落计数 , ’并根据菌落形态和显微染色观察结果挑取不 同类型进行纯化培
养和保藏 。 子实体下土壤中细菌分离计数 : 取与 20 个子实体密切接触 的土壤 10 9 进行分离
计数 ,方法同上 。
1
.
5 鸡油菌菌丝体的脱菌处理和传代培养
将分离获得的菌丝体培养物转 人加双抗 的 FM 平板 , 以菌丝尖端切割法多次传代直 至脱
山 地 寒 典 生 物 李 银 1 998
菌 , 脱菌检验可用 K B 平板划线和液体培养 。 经脱菌得 的纯培养在 F M 斜面 中传代 和保存 ,每
月转 1 次 。
2 结果和讨论
2
.
1
2
。
1
。
1
菌丝体的组织分离
各种培养基 的分 离效果 对 已有文献报导成功的 FM 、 M S 、 综合培养基等三种 , 常用
真菌培养基 P D A 、麦芽汁 、查 氏及鸡油菌组织浸提液等 四种培养基 , 在 同样加人抗生素 、 活性
碳和相同的培养条件下 ,进行 了组织分离效果 比较 。 其结果是 ,除 M S 外其余培养基 中由于细
菌的迅速生长而导致所有组织块在较短时间 ( 30 d 以内 )严重腐败 , 最终未能有鸡油菌菌丝体
生长 。 而在 M S 培养基上没有被霉菌污染的组织块周 围虽有细菌生长 ,但其生长明显受到抑
制 , 只局 限于组织块周围狭小范围内 ,组织块在 30 d 后仍保持较好形态 ,其 中多数组 织块 的周
围在显微镜下可观察到有锁状联合的菌丝体 的产生 , 但只有少数形成较丰厚菌丝体 的能转接
成活 。
2
.
1
.
2 组织分 离结果 采用 M S 平板对 50 个来源于 12 个 自然菌落的子实体进行 组织分离 ,
在进行统计 的 10 个组织块 中 , 因组织块霉 菌污染 ,平板污染和严重细 菌污染 而遗 弃的有 84
块 , 余下 的 16 个组织块 中有 10 块在 25 一 50 d 内分别长 出带锁状联合 的菌丝体 ,另 6 块 50 d
后仍 未观察到菌丝体生长 。 经过在 F M 培养基上传代 , 获得了 4 株来源于不同子实体的菌丝
体分离物 : 7C 2 5 9 , 8C 1 0 3 , C 72 4 5 , 8C 1 0 2 。
2
.
2 伴 生细菌的分离计数
结果见表 l 。 菌 肉组织的含菌量为土壤 中的 10 倍 以上 ,但菌落类 型较单一 ,说 明这些细
菌与组织确实存在伴生关系 。 有关伴生细菌的种类鉴定和与寄生的关系有待有一步研究 。
表 1 菌肉组织和土坡中细菌的分离计数
每 g 样 品中的含菌量 x l o` 个 菌落类型 ( 10 “ 5平板 上 )
鸡油菌 菌肉组织
子 实 体 下 土 壤
5
.
1 士 0 . 6
0
.
3 8 土 0 . 7
1 ~ 2 种
< 6 种
2
.
3 菌丝体分离物的脱菌处理
所有菌丝体分离物最初都是带有细菌的 ,需要在加有抗生素的 FM 平板上连续传代 5 一 7
次才能达到完全脱菌 。
2
.
4 鸡油菌菌丝体的培养特征
C 7 2 5 9
,
C 8 10 2
,
7C 24 5
,
8C 10 3 等四株纯 培养分离 物在 F M 平板上 的生长情况和形态特 征
的观察结果如下 :
2
.
4
.
1 菌丝分隔处都具有明显的锁状联合 ,菌丝较细 ,分枝较少 。
2
.
4
.
2 培养物具有鸡油菌特有的杏仁香味和淡奶油味 。
2
.
4
.
3 菌丝体厚而紧密 ,往往成束状扇形排列 、气生菌丝体 白色略带黄色 ,基 内菌丝体黄色 。
2
.
4
.
4 有两种类型的菌丝体 。 I 型 : 只有基内菌丝 , 气生菌丝无或不易观察到 , 菌丝体与培养
基结合成平滑 的团块 , 分泌较多黄色色素 , 生长缓慢 , 延迟 期约 10 d , 生 长速率 为 0 . 1 一 0 . 2
m m d/
。 如 C 7 2 4 5 和 8C 10 3 属此类 。 n 型 : 既有厚而紧密的基内菌丝体 , 还有丰厚的气生菌丝
第 2 期 辛智海 :鸡油菌及其伴 生细菌的组织分离
体 ,生长速 度较 I 型 快 ( 0 . 4 一 0 . 6 m m d/ ) , 延迟期短 (约 s d) , 色素分 泌较少 。 如 7C 2 59 和
C S 1 0 2 菌株 。
2
.
4
.
5 所有菌株生长较慢 , 老化较快 , 斜面培养物超过 6O d 后很难转接成活 。
上述特征与 E r i。 D a n e ll , N i1S F r i es 及 S t r a a t s m a 等人所描述 的基本二致 ,而与文献 [ 3 ]中
所描述的菌丝形态和培养特征有很大差别 。 -
2
.
4 组织分离中存在的问题
鸡油菌组织分离中最大的困难是真菌和细菌的污染 , 尤其是伴生细菌 的污染 。 即使 在培
养基 中同时加人氨节青霉素 、 链霉素 、 抓霉素 、四环素等多种抗菌素的情况下 , 组织块周 围仍有
细菌生长繁殖 。 在 M S 培养基 中细菌生长被抑制的原因据 1 9 9 3 年 E ir c D an el 等人的分析 ,可
能是较低 的 p H 值和伴生细菌对蔗糖的利用较差 。 要解决这一难题需要对伴生细菌 的生理特
性及其与寄主的关系做进一步的研究 。
组织分离的另一困难是菌丝体的传代培养 ,许多分离物在传代 培养 中不 能存 活 。 获得的
纯培养菌株只能在 FM 和 M S 培养基 中生长 ,但在 M S 中生长非常缓慢 , 其余供试培养基 中即
使加人 FM 维生素复合液 , 在相 同的 p H 和琼脂 浓度 的情况下菌丝体仍不能生长 。 实验 中还
观察到培养基的配制方法及琼脂的质量对菌丝体生长有较大影响 。 在 F M 中菌丝生长较慢而
且迅速老化 。 在获得纯培养 的基础上 , 需要对鸡油菌的生理特性尤其是营养要求 和培养条件
做进一步的研究 , 目前这方面的工作还缺乏系统性和全面性 。
3 参考文献
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