全 文 ：酶法提取车前草中熊果酸的工艺研究
张 利 1 ,何林芯 1 ,冯喜文 2 ,龚间生1
(1.四川理工学院化学与制药工程学院 ,四川自贡 643000;2.四川理工学院材料与化学工程学院 ,四川自贡 643000)
摘要　[目的 ]改进车前草中熊果酸的提取技术。 [方法]采用纤维素酶法 ,通过单因素试验对车前草中熊果酸提取工艺进行探讨。 [结
果]酶法提取车前草中熊果酸的最佳条件为pH值 5.0,酶用量 5.0mg/g,酶解温度 60℃, 酶解时间 2.5h。在此条件下车前草中熊果酸
提取率达 0.54%。 [结论]该工艺路线较短 ,操作简单 ,提取率高 ,成本低 ,适合工业生产。
关键词　车前草;熊果酸;纤维素酶;提取工艺
中图分类号　R284.1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)11-05846-02
StudyonTechnologyofExtractingUrsolicAcidinHerbPlantaginbyCelulase
ZHANGLietal　(SchoolofChemistryandPharmaceuticalEngineering, SichuanUniversityofScience＆Engineering, Zigong, Sichuan
643000)
Abstract　[ Objective] ThepaperaimedtoimprovetheextractiontechnologyofursolicacidinPlantagoasiatica.[Method] Thetechnologyof
extractingursolicacidinplantagoasiaticabyCelulasethroughsingle-factorexperimentwasstudied.Theresultsshowedthatthebestexperimen-
talconditionsasfolows, pHvaluewas5.0, theamountsofcelulosewas5.0mg/g, theenzymolysistemperaturewas60℃andtheenzymolysis
timewas2.5h.Theextractionrateofursolicacidinplantagoasiaticareachedto0.54%atthiscondition.[Conclusion] Thetechnologywassuit-
ableforindustrialproductionwiththecharacteristicsofshorterroute, simpleoperation, lowcost.
Keywords　Plantagoasiatica;Ursolicacid;Celulase;Extractionprocess
作者简介　张利(1970-),男 ,回族 ,四川自贡人 ,硕士 ,副教授,从事天
然药物的提取分离及纯化研究。
收稿日期　 2009-12-31
　　车前草又名车前 、车轮菜 、猪耳草 、钱串草等 ,为车前科
植物 (PlantagoasiaticaL.)或平车前 (Plantagodepresa
Wild.)的干燥全草。车前草为传统草药 ,具有清热利尿 、祛
痰 、凉血 、解毒的功能 [ 1] ,并且有止泻 、护肝 、降压 、降低血清
转氨酶 、抗癌 、抑菌和降低血清胆固醇的作用 [ 2] 。熊果酸
(Ursulaacid, UA)又名乌索酸 、乌苏酸 ,属 a-香树脂醇(a-
amyrin)型五环三萜类化合物 ,在自然界分布广泛。熊果酸具
有广泛的生物学效应 , 1990年被日本列为最有希望的肿瘤预
防药物之一 [ 3] 。
提取车前草中的熊果酸 ,一般常采用冷浸法 、渗漉法 、索
氏提取法 、超声波法等 ,这些方法各有一定的优 、缺点。冷浸
法和渗漉法不需加热 ,热敏性成分不易受破坏 ,但存在提取
时间长 、溶剂用量大 、操作费时等缺点。索氏提取往往需要
数小时才能将有效成分提取完全 ,不仅提取时间较长 ,而且
药液长时间处于被加热状态 ,致使其中的有效成分部分受到
破坏 ,提取物测出的熊果酸含量偏低 ,且提出的药液色重 ,一
般不能直接进行含量测定 [ 3] 。超声法提取具有快速 、完全 、
溶剂用量小 、有效成分的提取率高 、无需加热 、能避免高温对
有效成分的破坏等优点 ,且提出的杂质较少 ,不用进行脱色
除杂即可直接进行含量测定。但目前超声提取技术主要用
在实验室 ,用于大规模的工业生产还需解决工业设备放大问
题 [ 3] 。纤维素酶辅助法已广泛应用在植物活性成分的提取
中 ,如纤维素酶法提取黄酮 、多糖 、色素 、生物碱等 ,具有操作
简单 、高效稳定等优点 [ 4-6] 。基于此 ,笔者设计用纤维素酶
辅助法提取车前草中熊果酸的试验 ,以期为从车前草中提取
熊果酸生产提供有益的科学依据。
1　材料与方法
1.1　主要原料 、试剂与仪器
1.1.1　主要原料。车前草 ,市售;经除杂 ,洗净 ,晒干备用。
1.1.2　试剂。熊果酸标准品;高氯酸 、香草醛 、纤维素酶 、
95%乙醇(市售 , AR)。
1.1.3　试验仪器。RE-3000A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化
仪器厂);DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有
限公司);SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸
有限公司);101A-1E型电热鼓风干燥箱(上海安亭科学仪器
有限公司)。
1.2　试验方法
1.2.1　车前草中熊果酸提取工艺 。车前草※烘干※粉碎※
过 8目筛※酶解※高温灭酶※抽滤※烘干滤渣※95%乙醇
浸提※过滤※浓缩滤液※测定得率。
1.2.2　标准曲线的绘制。用浓度 95%乙醇配制 100 μg/ml
的熊果酸标准品溶液 ,准确吸取上述溶液 0、0.10、0.20、
0.30、0.40、0.50、0.60 ml置于 10 ml容量瓶中 , 80 ℃水浴挥
干乙醇 ,加入 0.20ml5%香草醛 -冰醋酸溶液 、0.80ml高氯
酸 ,将容量瓶放入 60 ℃水浴中加热 15 min,放冷至室温 ,用
2%冰醋酸溶液定容 ,摇匀;用紫外分光光度计在 548 nm处
测其吸光度值 ,得到回归方程 y=0.006 9x-0.001 8(R=
0.997 9)。
1.2.3　熊果酸含量的测定。将提取液用浓度 95%的乙醇定
容 ,在波长 548 nm处按照 “1.2.2”方法测定其吸光度 ,代入
回归方程得出提取液中熊果酸的含量。
1.2.4　熊果酸得率计算 。熊果酸得率(%)=提取液中熊果
酸的浓度(含量)×提取液质量 /车前草干重 ×100。
1.2.5　单因素试验设计。选择体系 pH值(4.0 ～ 7.0)、酶用
量(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/g)、酶解温度(25、30、
40、50、60、70、80 ℃)和酶解时间(0.5 ～ 3.5h)4因素 ,在提取
溶剂用 95%乙醇 ,料液比为 1∶15(酶解后)的条件下 ,依次变
化某一因素 ,固定其他因素进行考察。参考一般性酶较佳性
能发挥条件 ,选定单因素试验的基本参数:酶解温度 50 ℃、
体系 pH值 5.0、酶解时间 2.0 h、酶用量 5.0mg/g。
责任编辑　夏静　责任校对　卢瑶安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(11):5846-5847
2　结果与分析
2.1　酶解温度对熊果酸得率的影响　固定其他因素不变 ,
按不同酶解温度进行试验(表 1)。由表 1可知 ,温度对酶活
性的发挥具有较大的影响。熊果酸得率随着酶解温度的增
加呈先缓慢增加后急剧减少的趋势 。这是因为每种酶最佳
活性的发挥都有其最适温度 ,在此温度下酶解反应的速率最
高 ,效果最好。在达到酶解最佳温度前 ,温度较低时 ,酶作用
体现不充分 ,与直接使用溶剂提取的效果相差不大。随着温
度升高 ,酶分子运动速度加快 ,增加了酶分子与纤维素作用
的机会 ,熊果酸得率呈上升趋势;当酶解温度达到 60 ℃时 ,
得率最高。在该试验条件下 60 ℃是酶解最佳温度。超过此
温度后 ,由于酶蛋白变性 ,失去酶解能力 ,熊果酸提取率不再
上升 ,反而急剧下降 ,与直接使用溶剂提取效果相差不大。
2.2　体系 pH值对熊果酸得率的影响 　固定其他因素不变
(温度 60℃),按不同 pH值进行试验(表 1)。由表 1可知 ,
体系 pH值对熊果酸得率也有较大的影响 。在体系 pH值为
5.0左右时 ,熊果酸得率基本稳定 ,当体系 pH值过小或过大
时 ,熊果酸得率都有所下降 ,但比无酶解直接使用溶剂提取
要高 。这是因为每种酶都有自己最适合的 pH值 ,在此 pH
值下 ,酶解反应的速率最高 ,活性最好;高于或低于此值 ,都
会使酶活性部位的基团离子化而降低酶的活性 。在该试验
条件范围内 ,体系 pH值为 5.0是酶解最佳 pH条件 。
表 1　酶解温度、体系 pH值对熊果酸得率的影响
Table1　Influenceoftheenzymolysistemperaturesontheyieldofur-
solicacid
酶解温度∥℃Enzymolysistemperatures
熊果酸得率∥%Yieldofursolicacid
体系 pH值SystempHvalues
熊果酸得率∥%Yieldofursolicacid
25 0.28 4.0 0.43
30 0.31 4.5 0.46
40 0.35 5.0 0.54
50 0.40 5.5 0.52
60 0.54 6.0 0.52
70 0.41 6.5 0.40
80 0.27 7.0 0.39
2.3　酶用量对熊果酸得率的影响 　固定其他因素不变(温
度 60℃, pH值 5.0),按不同酶用量进行试验(表 2)。由表 2
可知 ,不同纤维素酶量对熊果酸得率有较大影响。酶用量是
影响酶促反应的重要因素 ,当酶用量为 4.0 ～6.0 mg/g时 ,熊
果酸得率基本恒定 ,且较高。当酶用量较小时 ,由于固定了
酶解时间 ,酶解进行不完全 ,虽然比直接使用溶剂提取时得
率要高 ,但效果不理想。当在 5.0 mg/g用量基础上继续增
加酶量 ,熊果酸得率并没有上升 ,趋于恒定。这是因为当酶
用量足够 ,底物被酶分子所饱和 ,纤维素被水解的速度趋于
稳定 ,在一定时间内 ,酶解完全 ,加大酶用量 ,对提高得率不
再有贡献。在该试验条件范围内 ,最佳酶用量为 5.0mg/g。
2.4　酶解时间对熊果酸得率的影响 　固定其他因素不变
(温度 60 ℃、pH值 5.0、酶用量 5.0 mg/g),按不同酶解时间
进行试验(表 2)。由表 2可知 ,不同的酶解时间对熊果酸得
率的影响也较大。随着酶解时间的延长 ,熊果酸得率呈上升
趋势 ,当时间达到 2.5h后 ,得率趋于恒定。可能是酶解反应
时间影响酶解完全程度 ,即破壁的效果 ,时间太短破壁不完
全 ,影响溶剂提取熊果酸的效果。时间延长有助于破壁 ,但
当破壁完成后 ,延长时间对得率的提高不再有贡献。同时有
效成分的结构还可能会被破坏 ,不利于得率的提高 ,故最佳
的酶解时间为 2.5 h。
表 2　酶用量、酶解时间对熊果酸得率的影响
Table2　Effectsofenzymedosageandenzymolysistimeonyieldofur-
solicacid
酶用量mg/gEnzymedosage
熊果酸得率∥%Yieldofursolicacid
酶解时间∥hEnzymolysistime
熊果酸得率∥%Yieldofursolicacid
2.0 0.35 0.5 0.33
3.0 0.40 1.0 0.36
4.0 0.49 1.5 0.38
5.0 0.55 2.0 0.45
6.0 0.54 2.5 0.54
7.0 0.57 3.0 0.57
8.0 0.53 3.5 0.55
3　结论
用纤维素酶法通过单因素试验对车前草中熊果酸提取
工艺进行了有益探讨。试验结果表明 ,酶法提取车前草中熊
果酸的最佳酶解条件为:pH值 5.0,酶用量 5.0 mg/g,酶解温
度 60℃, 酶解时间 2.5h。该工艺路线较短 ,操作简单 ,提取
率高 ,成本较低 ,适合工业化生产。
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(上接第 5833页)
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