全 文 ：收稿日期:2014 － 08 － 26 修回日期:2014 － 11 － 04
基金项目:国家自然科学基金项目(31400333，31400257);四川省应用基础研究基金资助项目(2013JY0182);四川省生物质资源利用与改性
工程技术研究中心基金项目(13zxsk01)。
作者简介:周振华(1989 －)，男，硕士研究生，从事植物遗传与品种改良研究。E-mail:zzh1128@ 163． com。通讯作者胡尚连(1966 －) ，女，教
授，博士，从事植物生理与生物技术研究。E-mail:hushanglian@ 126． com。
DOI:10． 13324 / j． cnki． jfcf． 2015． 01． 011
梁山慈竹体细胞突变体特性及分子水平变化
周振华，胡尚连，徐 刚，曹 颖，卢学琴，龙治坚
(1．西南科技大学植物细胞工程实验室，四川 绵阳 621010;
2．四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川 绵阳 621010)
摘要:以同期生长的梁山慈竹体细胞突变体 No．29 植株和实生植株(对照)为材料，对其茎秆化学成分和光合生理相关指
标进行测定，并基于 ＲNA高通量转录组测序结果，对 No．29 植株的纤维素、木质素等合成有关的基因差异表达进行分析。
结果表明，与实生植株相比，No．29 植株具有较高的株高、胸径、茎秆的鲜重和干重以及纤维素含量、纤维长度和宽度;纤维
素含量比实生植株高 12．89%;外方和内方纤维股明显增大;灰分含量、卷曲指数和扭结指数明显降低;但发笋量、木质素含
量和细小纤维含量没有明显差异。No．29 植株中的 CesA、SuSy、UDPase基因分别比实生植株上调了 117%、205%、115%，转
录因子 MYB基因表达上调了 214%，驱动蛋白基因表达上调了 10 倍，动力蛋白基因表达上调了 760%。No．29 植株纤维素
含量与纤维形态上明显的改变有其遗传基础，为 No．29 的进一步研究与利用奠定了基础。
关键词:梁山慈竹;体细胞突变体;木质素;纤维素;基因表达分析
中图分类号:S718．46 文献标识码:A 文章编号:2096 － 0018(2015)01 － 0067 － 07
Some extraordinary characteristics and the molecular basis of
somaclonal variant of Dendrocalamus farinosusy
ZHOU Zhen-hua，HU Shang-lian，XU Gang，CAO Ying，LU Xue-qin，LONG Zhi-jian
(1． Lab of Plant Cell Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang，Sichuan 621010，China;
2． Engineering Ｒesearch Center for Biomass Ｒesource Utilization and Modification of Sichuan Province，
Mianyang，Sichuan 621010，China)
Abstract:The chemical components of stem and photosynthetic physiological indexes in the somatic mutant No．29 and the plant of
seeds (CK)were determined． The different expressed genes involved in the biosynthesis of cellulose and lignin from No． 29 were
analyzed based on ＲNA high-throughput sequencing，compared with those of CK． The results showed that，compared with the plant
of seeds，the significant plant height，diameter at breast height，fresh weight and dry weight of stem，cellulose content，length and
width of fiber were found in the mutant No．29． The cellulose content in the mutant No．29 increased 12．89%，compared with CK．
The fibre strand outside the central strand and fibre strand inside the central strand and in the mutant No．29 were obviously higher
than those of CK． The ash content，curl index and kink index were significantly lower than those of CK． The shooting number，
lignin content and fiber fines content were insignificant，compared with CK． The expression of gene of CesA，SuSy，UDPase，
transcriptional factor MYB in the mutant No．29 was up regulated by 117%，205%，115%，214%，respectively． The kinesin was
up regulated by 10 fold while the dynein was up regulated by 760% ． The results indicated that the significant changes of cellulose
content and fiber morphology have the genetic bases in the mutant No．29． It laid a foundation for further research and utilization of No．29．
Key words:Dendrocalamus farinosusy;somaclonal variant;lignin;cellulose;gene expression analysis
梁山慈竹［Dendrocalamus farinosus (Keng et Keng f．)Chia et H． L． Fung］是四川南部、贵州、云南北部
和西北部的主要竹种之一［1］，是从生竹中耐瘠薄、耐寒性较强的竹种。梁山慈竹是优良的笋材两用竹，其
干形通直，是建筑的优良用材，纤维含量高、材性好，是制浆造纸和中密度纤维、编制、竹胶合板的优良原
料［2］。但由于竹难开花的生物学特性，很难通过传统育种方法对其进行遗传改良［3］。通过现代育种手段
寻找到高纤维素含量、高纤维质量和低木质素含量的优质竹种是现代竹子育种的一个主要方向。本课题
组采用离体诱导体细胞突变体的方法创造了一批突变体，为梁山慈竹遗传改良提供了可行途径［4 － 5］。有
森林与环境学报 2015，35(1) :67 － 73 第 35 卷 第 1 期
Journal of Forest and Environment 2015 年 1 月
研究表明，离体诱导植物体细胞突变体育种可引起株高、净光合速率、可溶性糖含量、叶绿素含量［6］以及
纤维素形态［7］和纤维素含量、木质素含量［5］等多方面的变化，并具有相应的遗传基础。
纤维素的合成是以尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose，UDPG)为底物，在纤维素合酶
(cellulose synthase，CesA)的催化下形成纤维素，并在纤维素酶(KOＲＲIGAN endoglucanases，KOＲ)、蔗糖
合酶(sucrose synthase，SuSy)、细胞骨架蛋白酶、Ｒac13 蛋白酶的作用下，有规律地沉积到植物体特定位
置［8］。有研究表明，CesA［9］、SuSy［10］、UDPase［11］的上调表达会引起植物中纤维素含量增加。苯丙氨酸裂
解酶 (phenylalanine ammonia lyase， PAL)、肉 桂 酸-3-羟 基 化 酶 (cinnamate-3-hydroxylase， C3H)、
肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸辅酶 A 连接酶(4-coumarate:coenzyme A
ligase，4CL)、咖啡酰辅酶 A 3-O-甲基转移酶(caffeoyl-coenzyme A 3-O-methyltransferase，CCoAMOT)、咖啡
酸-3-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶(caffeic acid-O-methyltransferase，COMT)、肉桂酰辅酶 A 还原酶
(cinnamoyl-CoA reductase，CCＲ)、肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)、阿魏酸-5-羟基化
酶(ferulate 5-hydroxylase，F5H)是木质素合成途径中关键酶［12］。木质素和纤维素的合成也受到转录因
子［13 － 14］、驱动蛋白(kinesin family，KIF)、动力蛋白(dynein，DYN)、钙调蛋白结合蛋白(caldesmon，
CBP)［15］以及泛素(ubiquitin，Ub)［16］等调控因子的间接调控。Ｒ2Ｒ3 亚家族的 MYB转录因子负调控木质
素的合成［13］，在拟南芥(Arabidopsis thaliana L．)和苜蓿(Medicago sativa L．)中，突变 WＲKY基因会提高突
变体中木质素、木糖、纤维素的过量沉积［14］。这些研究表明，高等植物纤维素和木质素的形成受基因水平
的综合调控。鉴于此，本课题组以梁山慈竹体细胞突变体 No．29 植株和实生植株为材料，对其茎秆化学成
分和光合生理相关指标进行测定，并基于 ＲNA高通量转录组测序结果，对 No．29 植株的纤维素、木质素等
合成有关的基因差异表达进行分析，探讨 No．29 植株的纤维素和木质素变化及其与分子表达的关系，为其
进一步研究与利用提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
梁山慈竹体细胞突变体 No．29 植株(2009 年 8 月通过梁山慈竹种子成熟胚离体诱导的愈伤组织获得
的一个突变的体细胞无性系)［4］，同期生长的梁山慈竹实生植株(CK)，由西南科技大学生命科学与工程
学院植物细胞工程实验室提供。No．29 植株和实生植株扩繁的后代于 2012 年 4 月移栽大田。
1．2 方法
1．2．1 发笋量调查和生物量的测定 2013 年 6 月 1 日至 2013 年 9 月 30 日对扩繁的 No．29 植株和 CK的
发笋量进行调查。2013 年 9 月 30 日按照周益权等［17］的方法对同期生长 1 a 的竹株高和胸径进行测量，
并分别取有代表性的茎秆各 3 根，105 ℃杀青 30 min后，置于 60 ℃烘干至恒重后称重，分别将茎秆中部样
品切碎并混匀，经粉碎机粉碎过 60 目筛的竹粉，供纤维素、木质素和灰分含量分析用。
1．2．2 纤维素、木质素和灰分含量的测定 纤维素和木质素含量的测定参照 FOSS 公司 FibertecTM M6
1020 /1021 型纤维素测定仪的操作手册进行。通过酸性洗涤纤维法和酸性洗涤木素法，得到纤维素含量
和木质素含量，每个样品重复测定 3 次，每组样品一个空白对照;灰分含量的测定参照 GB /T 2677． 3 －
1993［18］方法进行。
1．2．3 纤维形态的测定 取同期生长 1 a的 No．29 植株和 CK的茎秆各 3 根，取中部，置于烘箱 60 ℃烘干
至恒重，切成火柴杆大小于 10 mL试管中，每个试管中放入 4 － 6 根，用体积分数 10%的铬酸和 10%的硝
酸等比例混合的离析液浸没样品，室温放置 2 － 3 d，期间更换 2 次离析液以加快离析过程。将样品离析至
黄褐色的絮状，用纯水于平皿中冲洗至无色，然后用 Fiber Quality Analyzer (code LDA02)进行分析，统计
纤维的长度(gLswg，长度加权平均长度)、宽度、扭结指数、细小纤维含量和卷曲指数。
1．2．4 组织形态解剖 取同期生长 10 d的 No．29 植株和 CK 的茎秆，去掉笋箨，按其高度划分为 3 个部
位，即上部、中部和下部，在每个部位节间的中部组织取材，洗净擦干切成 0．5 cm2 大小，放于福尔马林—
醋酸—酒精混合液(Formalin-Aceto-Alcohol，FAA)固定液保存，用于组织解剖学观察，每份样品生物学和
技术各重复 3 次，对每份样品采用常规石蜡切片法对其进行横切，并在 Leica DMI-3000 倒置荧光显微镜进
·86· 森 林 与 环 境 学 报 第 35 卷
行显微照相。统计每个样本的 50 个切片中部有代表性的中心维管束高、中心维管束宽、外方纤维股厚度、
内方纤维股厚度及导管直径，并取其平均值。
1．2．5 光合速率、气孔导度的测定 采用 Li-6400 便携式光合仪对 No．29 植株和同期生长 2 a 的 CK植株
完全展开的成熟叶片的光合速率(net photosynthetic rate，Pn)和气孔导度(stomatal conductance，Cond)进
行测定，测定时间于 2014 年 4 月 2 日上午 9:00 － 11:00 进行。叶室温度控制在 11 － 12 ℃，叶室内的光合
有效辐射强度为饱和光强 1 500 μmol·m －2·s － 1，CO2 浓度为 400 μmol·mol
－1，每株取 5 － 6 片叶片。
1．2．6 叶绿素含量和可溶性糖含量的测定 取同期生长 1 a 的 No．29 植株和 CK 的新鲜完全成熟展开
叶，擦净叶片表面污物，去中脉，剪碎后混匀用于叶绿素含量和可溶性糖含量的测定。叶绿素 a 和叶绿素
b含量的测定采用王学奎［19］的方法;可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法，在 625 nm 波长下测定样品吸
光值。以 葡 萄 糖 为 标 准 品 绘 制 的 标 准 曲 线 在 200 － 1 000 μg· L －1 具 有 良 好 的 线 性:
y = 0．003 7x + 0．030 2(r2 = 0．998 0)。
1．2．7 基于转录组测序分析相关基因差异表达 分别取 No．29 植株和 CK同期出笋且生长 30 d 的竹秆，
分上、中、下 3 个部位，每个部位分别剪碎并充分混合，然后分别等量取 3 个部位的样品充分混匀，采用
OMEGA BIO-TEK公司 Plant ＲNA Kit试剂盒中的试剂及方法提取总 ＲNA。将提取的总 ＲNA 送交北京百
迈客生物科技有限公司进行转录组测序。基于转录组测序结果，统计考察基因的相对表达丰度(reads per
kilo bases per million mapped reads，ＲPKM)并进行差异表达分析。
1．3 数据分析
数据用 Excel 2010 和 SPSS 18．0 软件进行统计和方差分析，石蜡切片的结果统计用 Image-Pro Plus 6．0
软件，用 Excel 2010 软件绘图。
2 结果与分析
2．1 生物量、纤维素含量、木质素含量及纤维形态
由表 1 可知，No． 29 植株的株高，胸径，茎秆鲜重、干重显著高于 CK，No． 29 和 CK的干重占鲜重的比
例分别是 21．43%和 21．83%;No．29 的发笋量，细小纤维含量和木质素含量均与 CK无差异;No．29 植株的
灰分显著低于 CK;No．29 植株的纤维素含量比 CK显著高 12．89%，纤维长度和宽度也均显著高于 CK，长
宽比、卷曲指数和扭节指数均显著低于 CK。
表 1 No．29 和实生植株的生物量、纤维素和木质素含量、纤维形态指标1)
Table 1 Biomass，cellulose and lignin content，fiber morphology characteristics of No．29 and CK
样本 株高 /m 胸径 /mm
发笋量
枚·月 － 1
茎秆鲜重 / g 茎秆干重 / g 纤维素含量 /% 木质素含量 /%
CK 5．040 ± 0．250 20．664 ± 2．238 11．000 ± 4．500 170．000 ± 0．026 36．430 ± 0．023 46．827 ± 0．003 15．306 ± 0．002
No．29 5．400 ± 0．120* 29．608 ± 3．293＊＊ 13．000 ± 5．000 375．000 ± 0．028＊＊ 81．870 ± 0．026＊＊ 52．873 ± 0．033* 18．626 ± 0．017
样本 灰分 /% 纤维长度 /mm 纤维宽度 /μm 纤维长宽比 卷曲指数
扭结指数
mm －1
细小纤维含量
%
CK 1．293 ± 0．002 1．829 ± 0．062 14．500 ± 0．200 126．136 ± 3．773 0．044 ± 0．002 0．440 ± 0．000 17．407 ± 2．387
No．29 0．833 ± 0．002* 1．941 ± 0．015* 16．367 ± 0．289＊＊ 118．632 ± 1．600* 0．034 ± 0．002＊＊ 0．360 ± 0．017＊＊ 19．080 ± 2．210
1)* 表示差异达 0．05 显著水平;＊＊表示差异达 0．01 极显著水平。
2．2 组织形态解剖
梁山慈竹的纤维束为双断腰型，即维管束被导管分成不连续的上下 2 部分，呈梭型或菱形，由外至内
分别是外方纤维股、中心维管束(导管部分)、内方纤维股。维管束之间有 3 － 4 层薄壁细胞。No．29 植株
茎秆上中下 3 部分的中心维管束宽、外方纤维股厚度、内方纤维股厚度、导管直径均极显著大于 CK，上部
分别比 CK高出 78%、380%、107%、13%;中部分别比 CK高出 56%、336%、74%、11%;下部分别比 CK高
出 47%、1 042%、67%、11%;中心维管束高与 CK比无明显差异(图 1、表 2)。
·96·第 1 期 周振华等:梁山慈竹体细胞突变体特性及分子水平变化
A、C、E分别是 CK笋上、中、下横切;B、D、E分别是 No．29 植株 笋上、中、下横切;a、b、c、d、e、f分别是 A、B、C、D、E、F图中黑圈部分
放大的图像;b图:F为纤维细胞;LF为木质化纤维细胞;MX为后生木质部;P为薄壁组织;PP为原生韧皮部，PX为原生木质部。
图 1 No．29 和 CK茎秆横切片
Figure 1 Culm transverse sections of No．29 and CK
表 2 No．29 和 CK的维管束特征1)
Table 2 Vascular bundle characteristics of No．29 and CK
样本
中心维管束高 /μm
上部 中部 下部
中心维管束宽 /μm
上部 中部 下部
外方纤维股厚度 /μm
上部 中部 下部
CK 92．8 ± 13．1 94．5 ± 18．5 104．8 ± 13．4 119．9 ± 17．2 132．1 ± 16．6 138．6 ± 22．7 11．2 ± 24．2 22．9 ± 29．4 11．6 ± 31．0
No．29 96．8 ± 12．9 98．0 ± 17．0 102．0 ± 19．7 213．6 ± 25．6＊＊ 206．1 ± 35．5＊＊ 204．1 ± 30．0＊＊ 53．7 ± 36．7＊＊ 99．9 ± 38．6＊＊ 132．0 ± 40．0＊＊
样本
内方纤维股厚度 /μm
上部 中部 下部
导管直径 /μm
上部 中部 下部
CK 64．4 ± 12．6 92．1 ± 24．4 99．4 ± 18．7 42．0 ± 6．5 42．5 ± 7．6 44．2 ± 6．5
No．29 133．9 ± 24．5＊＊ 159．9 ± 26．2＊＊ 165．6 ± 25．5＊＊ 47．7 ± 9．6＊＊ 47．2 ± 8．3＊＊ 49．1 ± 10．0＊＊
1)* 表示差异达 0．05 显著水平;＊＊表示差异达 0．01 极显著水平。
2．3 光合指标、叶绿素及可溶性多糖含量
光合速率和气孔导度的分析结果表明，No．29 植株的净光合速率和气孔导度与 CK 无明显差异;叶绿
素 a、叶绿素 b和叶绿素总量都极显著高于 CK，分别比 CK 高出 22%、34%和 24%;可溶性多糖含量极显
著高于 CK，约高出 31%(表 3)。
·07· 森 林 与 环 境 学 报 第 35 卷
表 3 No．29 和 CK的净光合速率、气孔导度和叶绿素含量及可溶性多糖含量1)
Table 3 Net photosynthetic rate，stomatal conductance，chlorophyll content and soluble polysaccharide content of No．29 and CK
样本
净光合速率
μmol·m －2·s － 1
气孔导度
mmol·m －2·s － 1
叶绿素 a
mg·g － 1
叶绿素 b
mg·g － 1
叶绿素总量
mg·g － 1
叶片可溶性多糖
mg·g － 1
CK 7．770 ± 0．400 0．304 ± 0．054 4．403 ± 0．230 1．843 ± 0．262 6．246 ± 0．487 17．000 ± 0．541
No．29 7．720 ± 0．680 0．310 ± 0．020 5．346 ± 0．117＊＊ 2．418 ± 0．154＊＊ 7．764 ± 0．176＊＊ 22．315 ± 0．546＊＊
1)* 表示差异达 0．05 显著水平;＊＊表示差异达 0．01 极显著水平。
2．4 差异表达基因分析
木质素合成途径中的相关基因中，4CL、PAL、C3H、CAD、漆酶(laccase，LAC)表达下调幅度很大，与 CK
相比分别下调 78．6%、66．8%、74．0%、65．0%、54．1%;过氧化物酶(peroxidase，POX)上调了 1 067%［图 2
(a) ］，是 CK的 11．6 倍。与纤维素合成过程有关的关键酶基因 CesA、SuSy、尿苷二磷酸酶(UDP-glucose
pyrophosphorylase，UDPase)的表达分别比 CK 上调 117%、205%、115%［图 2(b) ］。转录因子 MYB 上调
214%;NAC、WＲKY和甲基化酶基因没有差异表达;酰基转移酶(acyltransferase，Acylase)上调 123%;伴随
钙调蛋白结合蛋白(CBP)的下调;钙调蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase，CAMK)上调，并只
在 No．29 植株中表达。泛素(Ub)也表现出上调，驱动蛋白(KIF)上调 1 000%，是 CK 的 11 倍，动力蛋白
(DYN)上调 760%［图 2(c)］。
图 2 No．29 和 CK基因的差异表达
Figure 2 Different expression of gene in No．29 and CK
·17·第 1 期 周振华等:梁山慈竹体细胞突变体特性及分子水平变化
3 结论与讨论
本课题组以梁山慈竹突变体 No．29 及其同期实生植株为研究对象，从生物量，纤维素和木质素含量及
纤维形态入手，并测定二者净光合速率、叶绿素含量以及可溶性糖含量等生理指标，发现 No．29 植株具有
生物量大、高纤维、可溶性糖含量高等优良的特性，并基于转录组测序初步探讨了 No．29 植株产生这些变
异的分子机制。
生物量是衡量某个竹种优劣的主要指标之一，No．29 植株的发笋量与 CK持平，但其株高、胸径以及干
重都显著高于 CK。No．29 植株不仅具有较高的生物量，其纤维素含量和质量也优于 CK。纤维素含量与
制浆有着密切关系，较高的纤维长度、较低的卷曲指数和扭结指数更适于抄造高档的文化用纸［20］，No．29
植株中的木质素含量和 CK 之间无显著差异，但 No．29 植株中的纤维细胞分布较密集，上中下部的内、外
方纤维股均明显高于 CK，这与其高纤维素含量一致。试验结果表明 No．29 植株具有速生、高产的特性，可
用于生产优质竹浆。
与 CK相比，No．29 植株在净光合速率和气孔导度上没有表现出差异，但其叶绿素 a和 b的含量、可溶
性多糖含量均极显著高于 CK。叶绿素含量与植物产量呈正相关的关系［21］;可溶性多糖含量的增加会形
成更多的结构型多糖［22］，从而影响纤维素和木质素的形成。因此可以推测，No．29 植株可能是通过提高
叶绿素含量提高光合效率，进而提高生物产量，其突变有其生理基础。
CesA、SuSy、UDPase基因在纤维素合成过程中都是关键的正调控基因，它们上调表达会直接使植物的
纤维素含量增加［12］。本课题组研究发现，No．29 植株中 CesA、SuSy、UDPase 分别上调 117%、205%、115%
［图 2(b) ］，可能是 No．29 植株中的纤维素含量显著增加的主要原因。漆酶和过氧化物酶在拟南芥导管发
生过程中的木质素单体聚合时是非冗余的两种重要的酶，在 lac4、lac17、lac11 三突变体拟南芥中，有着较
高的过氧化物酶基因表达量并且其木质素含量显著降低，但在 lac4、lac17 双突变体中并没有木质素含量
显著的降低［23］，No．29 植株差异表达的 LAC 基因为 LAC5、LAC10，并没有 LAC4、17、11 的差异表达。试验
结果还显示，木质素合成相关基因 4CL、PAL、C3H、CAD、LAC基因表达显著下调的同时过氧化物酶基因的
上调［图 2(a)］，这可能是 No．29 植株实际产生的木质素含量并未降低的一个原因。因此可以推测，是漆
酶和过氧化物酶的动态调整，使 No．29 植株中整个木质素合成过程保持了一种平衡。
钙调蛋白激酶基因上调和钙调蛋白结合蛋白基因的下调说明钙调蛋白激酶被大量活化，这会使其下
游的响应因子差异表达，MYB转录因子就是钙调蛋白激酶信号通路中的响应因子之一［15］，有研究发现，
MYB46 功能域抑制表达会导致拟南芥次生细胞壁增厚过程中的纤维素和木质素含量的降低，进而降低细
胞壁的厚度［24］，这与本课题组的测定结果基本一致，从石蜡切片结果中也可以发现，同期生长的 CK 与
No．29 植株相比，中心维管束宽度较短，中心维管束的高度没有显著差异，内外方纤维股的长度较短，导致
形成的细胞壁的厚度要远小于 No．29 植株。MYB也调控芥子油苷的生物合成，这一过程通过苯丙烷途径
与木质素合成联系起来［25］，使得 MYB也可以从这个侧面对木质素的合成造成间接的影响。No．29 植株中
驱动蛋白的及动力蛋白基因大幅度上调说明微管蛋白等细胞骨架组分的活跃，微管参与纤维素合成酶复
合体在质膜上的组装定位［26］，进而可能使纤维素的含量增加，具体过程仍有待于深入研究。No．29 植株
的高纤维素含量，较多的生物量特性可以用于造纸，而其高糖含量也可以应用于生物能源的开发。No．29
植株的突变机制应进行更深入的研究，其木质素未能降低的原因尚不清楚。另外，应针对其优良特性，对
No．29 植株进行扩大培养，观测其遗传稳定性和安全性，进一步把这个优良种质加以推广。
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(责任编辑:温凤英)
·37·第 1 期 周振华等:梁山慈竹体细胞突变体特性及分子水平变化