全 文 ：本研究受四川省科委应用基础项目资助
四川农大植保系 93级李斯勇、 刘元伟参加部份工作
作者单位　四川农业大学水稻研究所　中国　温江　 611130
收稿日期: 1997— 11— 03
稻粒黑粉菌侵染水稻不育系的细胞学研究
朱建清　周开达　陶家凤
摘　要　在水稻不育系开花期接种 Neovossia horrida的细胞学研究表明 , 病菌对
“珍汕 97A” 比 “ D90A” “ G46A” 及 “ K17A” 有较高的侵染率。病菌不进入水稻的
细胞 , 也不侵入胚囊 , 在菌丝周围的花柱及子房细胞无可见的变化 , 也都具有正常
的质壁分离能力。接种后 12小时 ,水稻子房细胞膜透性高于不接种的对照 , 但在 24
小时以后 , 除 “珍汕 97A” 的细胞膜透性显著上升之外 , 其余 3个不育系接近或低
于不接种的水平。
关键词　稻粒黑粉菌　细胞学　质壁分离　透性
由 Neovossia horrida ( Yakabashi ) padw ick引起的水稻粒黑粉病 ,是杂交水稻制种和不育
系繁殖中的严重病害。据报道 , 一般减产 20%左右 , 重者 50% 〔1〕 , 甚至 80%以上〔2〕 , 已成为
杂交水稻种子生产中的严重障碍。近年为了提高杂交稻的制繁产量 , 新育成不育系的柱头外
露率越来越高 ,稻粒黑粉病也有越来越重之势。一些科学工作者曾致力于抗病不育系的选育 ,
但至今尚无突破性的进展。
从田间发病的情况看 , 当前四川生产上使用最广的水稻不育系 , 对粒黑粉菌的感染有一
些差异 , 考虑到不育系的花粉败育 , 与正常水稻花器的结构有一些差异 , 因此本试验试图对
四川常用的不同类型的不育系 , 用人工接种病菌的方法 , 比较研究病菌侵染的早期阶段细胞
生理方面的变化及其差异 , 本文报道有关的试验结果。
1　材料与方法
1. 1　接种体的制备及接种
取 1995年从 “珍汕 97A” 病粒上收获的冬孢子 , 基本按原田幸雄报道的步骤分离和纯化
病菌〔3〕 , 在 PDA表面形成的次生小孢子菌落 , 移植于 PDA斜面保存备用。田间接种体在马
铃薯、蔗糖液中培养 7～ 9天 ,使用时用血球计数板计数后稀释至 2～ 3× 105个 /ml。在水稻杨
花期 18. 00～ 19. 00时 ,对剪颖或不剪颖的不育系喷雾接种 ,每穗接种量控制在菌悬液 3ml左
右 , 接种的第二天中午授粉 , 并继续套上硫酸纸袋直至取样。
1. 2　供试水稻材料
共 4个不育系: “珍汕 97A” , “ D90A” , “ G46A” 和 “ K17A” 均由四川农业大学水稻研
究所提供。于 1996年 5月 20日及 22日分两批播种 , 田间管理按常规 , 于孕穗末期逐稻挂牌
套袋。 此外还分期播种了一批保持系 , 以保证足量的花粉。
67
1998年 11卷 1期
Vol. 11　　No. 1　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
Southw es t China Jou rnal of Ag ricul tu ral Sciences
DOI : 10. 16213 /j . cnki . scjas . 1998. 01. 012
1. 3　取样及测试
测试样品于接种后 8, 12, 24, 48, 72小时采取 , 质壁分离试验每次每材料取 4穗 , 按
薛应龙 ( 1985) 及朱广文 ( 1990) 的方法 , 用 1M的蔗糖溶液 , 在显微镜下进行〔4～ 5〕。细胞透
性 , 以电解质外渗率表达 , 每次每材料 5～ 6穗 , 剪上中部小穗 , 混匀后每重复取 50粒 , 加
蒸馏水 13ml,至少重复 4次 ,用 DD86200数字电导率仪测定外渗液的电导率 ,并按下式计算:
R1=
r1- r0
r1′- r0′× 100%
　 R1= 接种材料的电解质外渗率
　 r1= 接种材料在 28℃恒温箱加蒸馏水中浸渍 12小时后浸出液的电导率 , r0= 蒸馏水的
初始电导率。 r1′= 测量 r1电导率之后 , 于沸水浴上 10分钟后浸出液的电导率。 r0′= 沸后蒸馏
水的电导率。
R2=
r2- r0
r2′- r0′× 100%
　 R2= 不接种对照组材料的电解质外渗率 , r2 , r2′分别代表不接种材料浸渍及沸水浴后的
电导率。 r0 , r0′分别代表初始及沸后的蒸馏水电导率。
R1- R2= 差值 , ( R1 - R2 ) /R2× 100% = 比值
2　结果及分析
2. 1　接种效果
扬花期对 4个不育系剪颖的和不剪颖的材料接种病菌后 , 第 15天调查接种效果。
表 1　不育系接种稻粒黑粉菌的发病情况
Table 1. Incidence of M SR* inoculated wi th Neovossia horr ida
处理
Treatm ent
不育系
M SR*
接种株数
Inoculated
plants
发病株
Diseas ed
plants
发病%
Diseased
rate (% )
差异性* *
Dif ferenc
sig ni ficance
总粒数
Total
grains
病粒数
Diseas ed
grains
病粒%
Diseas ed grain
rate (% )
差异性* *
Dif ference
sig ni ficance
剪颖
接种
Inoculation
珍汕 97A
Zh en shan
97A
25 24 96 a 816 225 28 A
on clipped D90A 34 27 79 a 691 77 11 B
glum rices G46A 22 18 82 ab 1303 150 12 B
K17A 15 14 93 ab 482 68 14 B
不剪颖接种
Inoculation
on nonclipped
珍汕 97A
Zh en shan
97A
15 13 87 a 226 86 38 a
glum rices D90A 19 14 74 ab 256 57 21 ab
G46A 28 16 57 b 409 113 28 ab
K17A 27 21 78 ab 720 81 11 b
　　* M SR代表水稻不育系 M SR= male s teril e rice
* * 差异性经 u检验 Dif ference sig ni ficance f rom u- tes t
从表 1接种的效果经统计分析后 , “珍汕 97A”无论剪颖接种或不剪颖接种 , 病株率及病
粒率均显著高于其余 3个不育系 ,特别是剪颖接种的病粒率已达极显著的差异水平。其余 3个
不育系的病株率与病粒率的差异性较为接近。
68 西　南　农　业　学　报 11卷
必须提到的是当统计接种株病粒率的时候 , 是统计已有明显的黑粉的病粒 , 未计算不实
的秕粒 , 根据另一个试验的显微镜观察 , 稻粒黑粉病菌能正常地侵入不授粉的水稻柱头 , 菌
丝也能在子房中定殖扩展 , 只是较为稀疏 , 始终不形成繁殖结构——冬孢子 , 冬孢子的形成
与成熟 , 与胚乳细胞中淀粉粒的形成 , 似乎有同步的紧密关系。 由于水稻开花较为分散 , 花
粉离开花药后生活力会很快丧失〔6〕 ,采用一次性授粉的情况下 ,有的小穗未来得及接受有生活
力的花粉 , 即使病菌已侵入 , 也没有形成有黑粉的病粒而只是秕粒。
根据表 1中剪颖处理的病株率和病粒率的总体比较分析 ,经 F测验及 t测验 ,其差异性不
显著 , 为避免增加剪颖的人为误差 , 本试验的测试资料 , 均采用了剪颖的处理。
图 1　稻粒黑粉菌对不育系颖花组织透性的影响
Fig 1　 Ef fect of infection of N eovossion horrida on the p ermeabi li t y of ovary cel l membrane of M SR.
2. 2　病菌侵入后花柱及子房细胞的反应
取接种后 8～ 12小时授粉及 24、 48、 72小时授粉的样品 , 在等量的冰醋酸、 酒精 ( 95% )
溶液中固定透明 , 徒手切片或压片 , 在 0. 1%苯胺兰乳酚油中染色安置 ,显微观察病菌侵入后
691期 朱建清等: 稻粒黑粉菌侵染水稻不育系的细胞学研究
的细胞反应。接种后 8小时 , 在花柱及子房中可以发现菌丝体 , 24小时后 , 子房中菌丝增多 ,
这些菌丝较侵入前在水稻体外的粗大。在花柱中的菌丝常不分枝 ,其位置大多靠近维管束 ,沿
维管束平行的方向向子房伸展 , 不进入花柱细胞 , 在花柱的薄壁组织中穿过 (图版 1)。子房
中的菌丝 , 在子房壁与胚囊之间蔓延与增殖 , 不进入子房壁细胞 , 也不进入胚囊中去。与菌
丝相邻的花柱及子房壁的周边细胞 , 原生质均匀 , 颜色正常 , 与远离菌丝体或不接菌的对照
组的花柱和子房壁细胞是完全相同的。
取新鲜的接种材料 , 切片 , 以蒸馏水作浮载剂 , 在显微镜下从玻片的一侧缓慢地加入蔗
糖液 , 观察菌丝周围的花柱及子房壁细胞 , 这些细胞的细胞质与细胞壁迅速分离 , 细胞质收
缩 , 最后缩成一团 (图版 2)。这种质壁分离现象 , 与不接种的对照组的细胞质壁分离完全相
似。
以上证明 , 稻粒黑粉菌侵入水稻花器的早期阶段 , 水稻的细胞仍是完整的。 这可能与病
菌并不侵入稻的细胞直接取得营养 , 而是吸收细胞外的一些物质 , 也没有分泌伤害细胞的有
毒物质有关。
2. 3　细胞透性的测定
在试验要求的时间取样 , 测定电解质外渗率 , 在接种后 12小时后 (未授粉 ) , 4个不育系
的外渗率均一致地高于不接种的对照。并在 24小时普遍有些降低。此后 , 在 24～ 48小时
“珍汕 97A” 上升极显著 , 与对照相比达最大差值 , “ D90A” , “ G46A” , “ K17A” 在 24小时
下降之后 , 48。 72小时的电解质外渗率或与不接种的对照组的外渗率接近 , 或低于对照的水
平 (图 1)〔1～ 4〕。
从差值和比值的计算结果 , “珍汕 97A” 显著高于其余 3个不育系 (图 1)。
图版 1　花柱中的菌丝 , 花柱细胞正常
Plate 1. The h yph ae of N eovossia horrida in s tyle
and no rm al s tyle cells.
　　　　图版 2　子房壁的菌丝 , 子房壁细胞正常质壁分离Plate 2. Th e hyphae of Neovossia horr ida in rice ovary
and plasmolysi s of ov ary w al l cells.
3　讨　　论
供试的 4个不育系 , 根据不育胞质的来源 , 分属不同的类型。“珍汕 97A” 是由野生稻细
胞质与禾山稻细胞核结合形成的野败型不育系 , “ D90A” , “ G46A”是由地理远距离的圭亚拉和
非洲西部栽培的晚禾山品种提供细胞质与我国早禾山细胞核结合形成的 G、 D型系列 , “ K17A”
70 西　南　农　业　学　报 11卷
是由粳稻细胞质与早禾山细胞核结合育成的不育系 , 其不育基因来源虽不相同 , 但同属于质核
互作型孢子体雄性不育。
在本试验的接种条件下 , 根据对稻粒黑粉菌的感染表现 , “珍汕 97A”的病穗与病粒率感
染较高 , 其余 3个的感病情况大体相似。
在对被染侵颖花细胞的显微检查 , 4个不育系的细胞 , 外观没有异样 ,当被侵染的寄主组
织接触浓度较高的蔗糖溶液时 , 细胞中水份迅速渗出 , 细胞质收缩而发生质壁分离。 细胞质
壁分离现象的发生 , 证明细胞的结构是完整的 , 是具有正常的功能 , 它们能有选择性地让物
质通过。在显微观察中也看出有菌丝段从实心的稻花柱细胞间隙向子房延伸 , 最后定殖在子
房壁与胚囊壁之间 , 不进入寄主细胞 , 因而在侵入的早期阶段 , 水稻细胞没有明显地受到病
菌的直接伤害。
寄主植物外渗液中电解质增加 ,意味着细胞质膜透性变大 ,是细胞质膜受到伤害的表现 ,
因此质膜的透性 , 常用作测定植物抗性的一个生理指标。本试验的 4个不育系 , 在接种病菌
后的第 12小时 , 外渗液中的电解质都高于不接种的对照组 , 可能是由于病菌从柱头侵入时 ,
柱头细胞受到伤害 , 以致电解质外渗较多 , 在接种后 24小时 , 受精后水稻柱头活力减退 , 或
病菌入侵的伤口逐渐愈合而使外渗液中的电解质有所下降。 与水稻接种稻瘟病菌的非亲和性
组合 ,在接种后 24、 48小时细胞质膜的透性比接种后 18小时的下降的结果有些相似〔 7〕。根据
Luke ( 1969)的解释 ,病组织透性由高到低。是由于细胞释出的磷酸化糖类和其它化合物 , 通
过螯合作用掩盖了电解质的存在〔2〕。要获得这些现象的满意的解释 , 还有待进一步深入研究。
在本试验 , 接种后 24～ 48小时 , 感病较高的 “珍汕 97A” 的电解质外渗率 , 不但有较大
的差值 , 也有较大的比值 , 这也许与它的感病性有一定的联系。
水稻粒黑粉病是典型的由花器侵染的局部病害〔8〕。 病菌的侵入显然还与水稻开花习性有
密切的关系 , 例如花器张颖的时间、 角度、 柱头外露等。因此在研究水稻不育系对稻粒黑粉
病的抗性 , 除了生理方面的因素之外、 还应包括开花习性方面的内容。
参　考　文　献
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711期 朱建清等: 稻粒黑粉菌侵染水稻不育系的细胞学研究
Cytological Study on Neovossia horrida Infection in
Male Sterile Lines of Rice
Zhu Jianqing　 Zh ou Kaida　 Tao Jiafeng
( Rice Research Ins ti tute, Sichuan Agricu ltural Universi ty Wen Jiang 611130 China)
Abstract
Fou r male steril e lines of rice w ere inoculated w ith Neovossia horr ida in field du ring anth esi s s tage of rice g row th. As a
resul t, th e infection rate of Zh en Shan 97A w as high er th an th at of D90A, G46A and K17A. Around h yphae, s tyle and ovary
cells show ed no visible ch anges and plasmolysis abili t y was similar to the uninoculated cont rol. Fo r all of th es e four lines , th e
permeabili ty of ov ary cell m emb rane increas ed in 12 h rs af ter inoculation, but d ecreased to th e same level as o r low er level
th an the cont rol in 24 h rs except Zhen Shan 97A.
Key Words　Neovossia horr ida　 Cytology　 Plasm olysis Permeabili ty
(责任编辑　杨　群 )
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