全 文 ：第 33 卷 第 2 期
2012 年 2 月
纺 织 学 报
Journal of Textile Research
Vol． 33，No． 2
Feb．，2012
文章编号:0253-9721(2012)02-0063-05
黄多孔菌产漆酶最佳培养条件的优化
徐雪霏，毕云枫，蒋海芹，沈明浩
(吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)
摘 要 采用 Plackett-Burman 设计法，对影响黄多孔菌生产漆酶的 9 个因素进行了筛选。结果表明，影响该菌产
生漆酶的主要营养因素为碳氮比、铜离子浓度和 pH 值。在此基础上，采用响应面法对其中 3 个显著因子的最佳水
平范围进行研究，利用统计软件 Design-Expert 进行二次回归分析。当碳氮比、铜离子浓度和 pH 值分别为 4 ∶ 1、
0. 1 mmol /L和 5. 5 时，漆酶产量从178 U /mL提高到446 U /mL，是优化前的 2. 5 倍。
关键词 Plackett-Burman;漆酶;响应面;水平
中图分类号:TS 201. 25 文献标志码:A
Optimization of culture conditions for laccase production
from Polyporus elegans Fr．
XU Xuefei，BI Yunfeng，JIANG Haiqin，SHEN Minghao
(College of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun，Jilin 130118，China)
Abstract The 9 factors that influenced laccase production from Polyporus elegans Fr． were studied using
Plackett-Burman design，it was found that they were main nutrition factors such as C /N ratio， the
concentration of Cu2 + and pH． On that basis，response surface analysis was adopted to investigate the
optimal levels of the 3 main factors． The second regression analysis of the findings using Design-Expert
software showed that the laccase activity was 446 U /mL(178 U /mL before optimization)when the C /N
ratio，concentration of Cu2 + and pH were 4∶ 1，0. 1 mmol /L and 5. 5 respectively，which was 2. 5 folds
of that under the original culture conditions．
Key words Plackett-Burman;laccase;response surface;level
收稿日期:2011 － 04 － 26 修回日期:2011 － 08 － 21
基金项目:吉林省科技厅课题(20090553)
作者简介:徐雪霏(1986—) ，女，硕士生。主要研究方向为食品安全。沈明浩，通信作者，E-mail:shenmh2003@ yahoo． com． cn。
漆酶有广泛的底物专一性和显著的非特异
性［1］。漆酶可以催化多种耦合物质氧化还原成
水［2 － 3］。近年研究表明，漆酶还可用于生物传感器
的制造和生物修复［4 － 5］，如免疫探测器、药物等［6］，
所以漆酶从十九世纪末至今受到了极大的关注［7］。
响应面法是通过一系列确定性实验，用多项式
函数来近似隐式极限状态函数进行数据分析，得出
回归模型和最佳水平后，预测结果是否理想，它是生
产条件，降低成本，提高产量、质量的一种有效方
法［8］，该法已经广泛地应用于生物发酵条件的优化
研究中［9］。
本文采用响应面分析法对黄多孔菌产漆酶的培
养基进行了优化，优化后酶活提高达 2. 5 倍，为漆酶
的工业化生产提供了基础。
1 实验部分
1. 1 材 料
实验菌株:黄多孔菌(Polyporus elegans (Bull．)
Fr．) ，来源于中国林业科学研究院森林生态环境与
保护研究所。
斜面种子培养基:马铃薯 200 g /L，葡萄糖
20 g /L，KH2PO4 0. 3 g /L，MgSO4·7H2O 0. 15 g /L，
VB1 0. 01 g /L，琼脂 20 g /L，用蒸馏水配制，pH 值
DOI:10.13475/j.fzxb.2012.02.010
纺织学报 第 33 卷
自然。
液体种子培养基:葡萄糖 10 g /L，酵母粉1 g /L，
Mandels 营养盐浓缩液100 mL，Mandels 微量元素浓
缩液1 mL，CuSO4·5H2O 4 mg，1 mol /L柠檬酸缓冲
液50 mL(pH = 5. 0)。
液体发酵培养基:马铃薯 200 g /L，葡萄糖
20 g /L，KH2PO4 0. 3 g /L，MgSO4·7H2O 0. 15 g /L，
VB10. 01 g /L，用蒸馏水配制，pH 值自然。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 发酵培养
150 mL 三角瓶中装液体培养基 50 mL，接入
2 ～ 3日龄平板菌种 3 片(10 mm) ，130 r /min、32 ℃
条件下恒温振荡培养，然后取 8% 的种子液接入发
酵培养基，在相同条件下振荡培养。
1. 2. 2 粗酶液制备
取培养 7 ～ 10 d 的发酵液，1 000 r /min 离心
10 min，上清液即为粗酶液，冰箱4 ℃保存备用。
1. 2. 3 酶活测定
根据漆酶活力测定方法，取 0. 1 mol /L pH 值为
4. 6 的醋酸缓冲液 3. 5 mL，加入 3. 36 mmo1 /L 的邻
联甲 苯 胺 0. 5 mL，再 加 入 适 当 稀 释 的 粗 酶 液
0. 1 mL，25 ℃保温5 min，利用 722E 型紫外可见分
光光度计测595 nm处的光密度(OD 值) ，酶活力以
样品与底物反应5 min后光密度的改变值表示，以每
分 钟 光 密 度 增 加 0. 001 为 1 个 酶 活 力 单
位(U /mL)。
2 结果与分析
2. 1 Plackett-Burman 设计筛选影响因子
在前期实验的基础上，选取可能影响产酶的
7 个因素:pH 值(A)、碳氮比(B)、接种量(C)、装液
量(D)、铜离子(E)、镁离子(F)、诱导剂(G)进行
N = 12 的 Plackett-Burman 实验。7 个因素分别对应
于表中的 7 个列，每个因素取低水平“ － 1”和高水
平“1”。以漆酶活力为响应值对实验结果进行分
析，得出各因素的 t 值和可信度水平。实验设计及
结果见表 1，各因素主效应分析见表 2。
表 1 N = 12 的 Plackett-Burman 实验设计及响应值
Tab． 1 Plackett-Burman experimental design and response values of N = 12
实验点 pH 值 碳氮比 接种量 装液量 铜离子 镁离子 诱导剂
漆酶活力 /
(U·mL － 1)
1 1 1 － 1 1 － 1 － 1 － 1 102
2 1 － 1 1 － 1 － 1 － 1 1 168
3 1 － 1 1 1 － 1 1 － 1 171
4 － 1 1 1 － 1 1 － 1 － 1 105
5 1 － 1 － 1 － 1 1 1 1 114
6 － 1 － 1 1 1 1 － 1 1 138
7 1 1 1 － 1 1 1 － 1 75
8 1 1 － 1 1 1 － 1 1 84
9 － 1 － 1 － 1 1 1 1 － 1 132
10 － 1 1 － 1 － 1 － 1 1 1 138
11 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 － 1 189
12 － 1 1 1 1 － 1 1 1 138
表 2 Plackett-Burman 实验设计的因素水平及效应分析
Tab． 2 Plackett-Burman experimental design factor levels and effect analysis
因素
水平
－ 1 1
效应 系数 T 检验 P 值
重要性
排序
A pH 值 5 6 － 0． 700 0 － 7． 667 － 3． 34 0． 029 3
B 碳氮比 3∶ 1 5∶ 1 － 1． 500 0 － 1． 000 － 7． 61 0． 002 1
C 接种量 /% 6 10 0． 200 0 － 6． 667 0． 95 0． 394 4
D 装液量 /mL 70 90 － 0． 133 3 4． 667 － 0． 64 0． 559 5
E 铜离子 /(mmol·L － 1) 0． 075 0． 125 － 1． 433 3 3． 000 － 6． 84 0． 002 1
F 镁离子 /(g·L － 1) 1 2 － 0． 100 0 － 7． 000 － 0． 48 0． 658 6
G 诱导剂(1 mmol / L) 邻联甲苯胺 愈创木酚 － 4． 667 0 0． 033 0． 16 0． 881 7
·46·
第 2 期 徐雪霏 等:黄多孔菌产漆酶最佳培养条件的优化
由表 2 的主效应分析结果可知，在 Plackett-
Burman 设计的二水平范围内，影响黄多孔菌发酵产
漆酶的重要因素为碳氮比、铜离子和 pH 值这 3 个
因素。
2. 2 响应面设计确定显著因子的最佳值
2. 2. 1 Box-Behnken 设计
由单因素实验确定实验因素中心点，利用统计
软件 Design-Expert，对表中 3 因素的实验数据运行
15 次的响应面分析实验。自变量碳氮比、铜离
子(mmol /L)和 pH 值，分别以 X1、X2、X3 代表，x1 =
(X1 － 4)/1，x2 = (X2 － 0. 1)/0. 025，x3 = (X3 －
5. 5)/0. 5，各因素编码水平设计见表 3。
表 3 Box-Behnken 实验设计因素与水平
Tab． 3 Box-Behnken experimental design
factors and levels
项目
水平
－ 1 0 1
X1 碳氮比 3∶ 1 4∶ 1 5∶ 1
X2 铜离子 /(mmol·L
－ 1) 0. 075 0. 1 0. 125
X3 pH 值 5 5. 5 6
2. 2. 2 二次回归模型拟合及方差分析
通过 Design-Expert 统计软件对实验数据进行
二次响应面回归分析，建立二次回归方程，根据回归
模型寻求培养基因子水平的最优值，结果见表 4、5。
表 4 响应面 Box-Behnken 设计和实验结果
Tab． 4 Box-Behnken response surface
design and test results
实验号
X1
碳氮比
X2 铜离子 /
(mmol·L －1)
X3
pH 值
漆酶活力 /
(U·mL － 1)
1 0 － 1 1 302
2 0 1 － 1 332
3 － 1 0 1 333
4 1 － 1 0 358
5 0 0 0 448
6 0 － 1 － 1 321
7 1 0 1 373
8 0 0 0 446
9 0 0 0 446
10 1 1 0 365
11 0 1 1 335
12 1 0 － 1 349
13 － 1 1 0 362
14 － 1 0 － 1 392
15 － 1 － 1 0 348
由表 4、5 可知，X2、X1X3、X
2
1、X
2
2、X
2
3 对黄多孔菌
产酶量都有极显著的影响(p ＜ 0. 01) ，C 也有影响
(p ＜ 0. 05)。利用 Design-Expert 回归拟合实验数
据，得到酶活对碳氮比(X1)、铜离子浓度(X2)及 pH
值 (X3)的三元二次回归方程:
表 5 回归方程中回归系数的估计值
Tab． 5 Regression equation estimated value
of regression coefficient
模型项 参考估计 标准误差
常数项 447. 00 2. 31
X1 1. 25 1. 83
X2 8. 13 1. 83
X3 － 6. 38 1. 83
X21 － 1. 75 2. 59
X22 20. 75 2. 59
X23 5. 50 2. 59
X1 X2 － 24. 75 2. 52
X1 X3 － 64. 00 2. 52
X2 X3 － 60. 50 2. 52
酶活 = 447. 00 + 1. 25X1 + 8. 13X2 － 6. 38X1 －
1. 75X1X2 + 20. 75X1X3 + 5. 50X2X3 － 24. 75X
2
1 －
64. 00X22 － 60. 50X
2
3。
表 6 示出 Box-Behnken 实验分析结果。回归方
程方差分析表明 p = 0. 095 ＞ 0. 05，又有该模型决定
系数 R2 = 0. 9955 ＞ 0. 9，说明预测值与实测值之间
相关性较高，因此可用该回归方程代替实验真实点
对黄多孔菌发酵产漆酶进行分析和预测。
表 6 Box-Behnken 实验分析
Tab． 6 Box-Behnken experimental analysis
来源 平方和 自由度 df 均方 F P
模型 41 437. 81 9 4 604. 20 172. 12 ＜ 0. 000 1
X1 12. 50 1 12. 50 0. 47 0. 516 2
X2 528. 13 1 528. 13 19. 74 0. 003 0
X3 325. 13 1 325. 13 12. 15 0. 010 2
X1 X2 12. 25 1 12. 25 0. 46 0. 520 3
X1 X3 1 722. 25 1 1 722. 25 64. 38 ＜ 0. 000 1
X2 X3 121. 00 1 121. 00 4. 52 0. 071 0
X21 2 579. 21 1 2 579. 21 96. 42 ＜ 0. 000 1
X22 17 246. 32 1 17 246. 32 644. 72 ＜ 0. 000 1
X23 15 411. 58 1 15 411. 58 576. 13 ＜ 0. 000 1
误差 187. 25 7 26. 75
失拟 143. 25 3 47. 75 4. 34 0. 095 0
纯误差 44. 00 4 11. 00
合计 41 625. 06 16
对回归方程求一阶偏导数可得模型的极值点，
分别为 X1 = 0. 003 0，碳氮比为 4. 003 0∶ 1，X2 =
0. 061 0，铜 离 子 浓 度 为 0. 101 5 mmol /L，X3 =
－ 0. 049 0，pH 值为 5. 4755。其相对应的响应值为
447. 408 U /mL。考虑到实际操作的可行性，将黄多
孔菌发酵培养基的成分在理论值基础上修正为:碳
氮比为 4∶ 1，铜离子浓度为 0. 1 mmol /L，pH 值为
5. 5。在上述条件下对模型预测值进行实验验证，漆
酶活力为446 U /mL，实验值与理论值误差在 5% 之
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纺织学报 第 33 卷
内，属正常范围，可见模型可以较好地预测实际酶活
情况。
根据回归方程利用 Design-Expert 绘出响应面
分析图［10］，见图 1 ～ 3。可以看出，碳氮比、铜离子
浓度及 pH 值与漆酶活力存在显著相关性。其中
铜离子浓度对漆酶活力影响最为显著。由等高线
图可以看出，碳氮比与铜离子浓度、铜离子浓度与
pH 值的等值线图呈椭圆形，交互作用显著，而碳
氮比与铜离子浓度的等值线图接近圆形，交互作
用不显著。
图 1 碳氮比与铜离子对酶活的响应面分析图与等高线图
Fig． 1 Carbon / nitrogen ratio and copper ions on laccase activity of response surface analysis map (a)and contour map (b)
图 2 碳氮比与 pH 对酶活的响应面分析图与等高线图
Fig． 2 Carbon / nitrogen ratio and pH on laccase activity of response surface analysis map (a)and contour map (b)
图 3 铜离子与 pH 值对酶活的响应面分析图与等高线图
Fig． 3 Copper ions and pH on laccase activity of response surface analysis map(a)and contour map (b)
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第 2 期 徐雪霏 等:黄多孔菌产漆酶最佳培养条件的优化
3 结 论
通过 Plackett-Burman 实验设计筛选出影响黄
多孔菌产漆酶的重要因素有碳氮比、铜离子浓度和
pH 值。利用 Design-Expert 软件进行响应面回归分
析，确定黄多孔菌产漆酶的最佳培养基配方:碳氮
比、铜 离 子 浓 度 和 pH 值 分 别 为 4. 003 0∶ 1、
0. 101 5 mmol /L、5. 475 5时，可得到最大酶活预测
值为447. 408 U /mL，在此条件下对实验结果进行验
证，所得酶活 446 U /mL 与理论预测值基本吻合。
FZXB
参考文献:
［1］ KOROLIVA OV，STEPANOVA EV，GAVRILOVA VP，
et al． Laccase of Coriolus zonatus: isolation，
purification，and some physicochemical properties［J］．
Appl Biochem Biotechnol，1999，76(2) :115 － 127．
［2］ PPIONTEK K， ANTORINI M， CHOINOWSKI T．
Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes
versicolor at 1. 90  resolution containing a full
complement of coppers［J］． J Biol Chem，2002，277:
37663 － 37669．
［3］ RANSBARGER D， XU F． Activation of laccase by
penicillin and derivatives［J］． Process Biochem，2006，
41:2082 － 2086．
［4］ COUTO SR，TOCA-HERRERA JL． Laccase production
at reactor scale by filamentous fungi［J］． Biotechnol
Adv，2007，25:558 － 569．
［5］ SUSANA RC， JOS LTH． Industrial and
biotechnological applications of laccases:a review［J］．
Biotechnol Adv，2006，24:500 － 513．
［6］ GHINDILIS A． Direct electron transfer catalysed by
enzymes :application for biosensor development［J］．
Biochem Soc Trans，2000，28(2) :84 － 89．
［7］ GNANAMANI A， JAYAPRAKASHVEL M，
ARULMANI M，et al． Effect of inducers and culturing
processes on laccase synthesis in Phanerochaete chrysos
pori um NCIM 1197 and the constitutive expression of
laccase isozymes［J］． Enzyme Microbiol Tech，2006，
38:1017 － 1021．
［8］ 欧宏宇，贾士儒． SAS 软件在微生物培养条件优化中的
应用［J］．天津轻工业学院学报，2001(1) :14 － 27．
OU Hongyu，JIA Shiru． The application of SAS system
in optimization of microbial culture conditions［J］．
Journal of Tianjin University of Light Industry，
2001(1) :14 － 27．
［9］ 邓祖新 ． SAS 系统和数据分析［M］．北京:电子工业出
版社，2002．
DENG Zuxin． SAS system and Data Analysis［M］．
Beijing:Electronic Industry Press，2002．
［10］ 凌秀梅，邱树毅，胡鹏刚，等 ． 响应面法优化从啤酒废
酵母中提取谷胱甘肽工艺条件［J］．中国酿造，2007，
172(7) :35 － 38．
LING Xiumei，QIU Shuyi，HU Penggang， et al．
Optimization of extraction technique of GSH from waste
beer yeast via response［J］． Chinabrewing，2007，
172(7) :35 － 38．
·76·