全 文 ：Plackett-Burman实验设计联用星点设计(CCD)
效应面法优选长叶胡颓子总黄酮提取工艺研究
杨代竹1，李玉山2
(1．湖北民族学院附属民大医院，湖北 恩施 445000;2．湖北民族学院 湖北 恩施 445000)
摘 要:目的:运用 Plackett-Burman 实验设计联用星点设计(central composite design，CCD)效应面法，考
察各影响因素显著性，筛选长叶胡颓子黄酮提取的最佳工艺。方法:运用 Plackett-Burman 实验设计筛
选主要影响因素，采用星点设计-效应面法优选长叶胡颓子黄酮提取工艺。乙醇浓度、料液比、回流温
度作为自变量，黄酮含量作为因变量，通过对二者二次响应曲面的回归拟合，利用三维曲面图直观分析
长叶胡颓子黄酮提取最佳工艺，并进行预测分析。结果:黄酮的最佳提取工艺为:乙醇浓度 80% ～
85%，料液比为 1∶ 15 ～ 1∶ 20，回流温度 60 ～ 65℃，回流 2 次，30min /次。结论:利用 Plackett-Burman 实
验设计联用星点设计(CCD)确定了长叶胡颓子黄酮的提取工艺，该方法简便，精度更高、重现性好、预
测性强。
关键词:长叶胡颓子;总黄酮;Plackett-Burman;星点设计(CCD) ;提取工艺
中图分类号:Ｒ284 文献标识码:A 文章编号:1673-2197(2014)02-0021-04
收稿日期:2013-12-11
基金项目:湖北省卫生厅科研基金项目(JX2C42)
作者简介:杨代竹(1974 －)，湖北民族学院附属民大医院，研究方向为临床药学。
通讯作者:李玉山(1969 －)，男，湖北民族学院高级实验师，研究方向为基础医学。E-mail:1902097263@ qq． com
Optimization Extraction of Total Flavones from Elaeagnus Bockii Diels Based on
Plackett-Burman Combined with CCD Ｒesponse Surface Methodology
Yang Daizhu1，li Yushan2
(1． The Hospital Affiliated to Hubei University For Nationalities，Hubei 445000，China;
2． Hubei Institute For Nationalities，Hubei 445000，China)
Abstract:Objective:To optimize the process of extracting effective constituents from Elaeagnus bockii Diels by Plackett-Burman com-
bined with CCD response surface methodology． Methods:In Plackett-Burman combined with CCD response surface design，Independent
variables were concentration of ethanol，Liquid ratio，reflux temperature． Dependent variables were contents of total flavones． Ｒesults:
The Optimization extraction of total flavones was 80% -85% ethanol，15-20 fold of solvent and 2 times for refluxing extraction at the 60℃ ～
65℃，30 minutes each time． Conclusions:The optimum process is simple and more convenient for extracting the total flavones from Elae-
agnus bockii Diels with higher precision and predictability．
Key Words:Elaeagnus Bockii Diels Total Flavones;Plackett-Burman;CCD;Extraction Process
长叶胡颓子(Elaeagnus bockii Diels)是胡颓子科胡颓子
属的一种，其资源丰富，主要分布在长江流域及以南地
区［1］，其根茎或根、叶、果实均可供药用或食用，是极具开发
价值的中草药［2］，主要用于治疗支气管哮喘、感冒咳嗽、肠
炎、风湿性关节炎、腰腿痛、腹泻、痢疾、跌打、瘀积、肺病
等［1，3，4］。化学成分以黄酮类为最多，此外还有三萜类、甾体
类、蒽醌类等化合物［5］。黄酮类化合物具有抗炎、抗癌、抗
辐射、提高机体免疫力、解热镇痛以及保肝护肝等作用［6］。
目前尚未见有关长叶胡颓子果实总黄酮的提取工艺研究报
道，本研究利用 Plackett-Burman 实验设计单因素筛选主要
影响因素，星点设计-效应面法描绘效应对因素的效应面，
从效应面上选择较佳的效应区，从而确定最佳实验条件。
Plackett-Burman实验设计联用星点设计(CCD)效应面法采
用非线性数学模型拟合，较常用的正交设计实验精度高、预
—12—
测性好、可信度高［7］。
1 仪器与试药
粉碎机(郑州华通机械厂) ，UV1100 紫外分光光度计
(杭州科博仪器有限公司) ，BS124S 型电子天平(上海美谱
达仪器有限公司) ，旋转蒸发仪 Ｒ-201(瑞士布奇公司) ，循
环水式多用真空泵 SHB-III(郑州长城科技工贸有限公司) ，
电热鼓风干燥箱(南京沃环科技实业有限公司)。芦丁标准
品(中国药品生物制品检定所，批号:100079-201005) ，硝酸
铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、氢氧化钠、三氯化铝、95%的乙醇、
石油醚均为分析纯试剂，以上试剂均购自成都科龙试剂厂。
实验用长叶胡颓子药材采自湖北恩施州巴东县野三关，经
湖北民族学院李玉山鉴定为胡颓子科胡颓子属长叶胡颓子
(Elaeagnus bockii Diels)果实。
2 方法与结果
2． 1 长叶胡颓子果实脱脂处理
黄酮主要富集于植物组织细胞壁附近和蜡质中，石油
醚的浸提破坏了蜡质层，有利于黄酮的释放和提取［8］。石
油醚能除去长叶胡颓子大部分脂溶性杂质，降低其对黄酮
浸提的干扰。称取一定量的长叶胡颓子果实粉末，10 倍量
石油醚(60 ～ 90℃)浸渍一夜，回流脱脂 2 次，1h /次，滤过，
滤渣挥干溶剂即得供试药材粉末，晾干、备用。
2． 2 供试品制备
称取脱脂处理后的长叶胡颓子粗粉(过 20 目筛)10g，
精密称定，加入 95%乙醇 200mL，70℃加热回流 2h，放冷，
过滤，残渣中再加入 95%乙醇 200mL，回流提取 2h，放冷，
过滤，药渣用少量 95%乙醇冲洗，合并滤液，挥去溶剂定容
至 25mL量瓶中，加 95%乙醇定容，即得供试品溶液。
2． 3 测定波长的选择
分别精密量取芦丁对照品溶液与供试品溶液 1mL，加
入 10mL 1% A1Cl3甲醇液，加甲醇定容，于室温下显色
10min后，在 200 ～ 800nm 扫描。芦丁对照品溶液在 432nm
有最大吸收，供试品溶液在 417nm 有最大吸收，选择 417nm
作为测定波长。
2． 4 标准曲线的绘制
取芦 丁 对 照 品 适 量，用 甲 醇 溶 解 配 制 成 浓 度
0． 6mg·mL-1的标准贮备液，分别取黄酮标准贮备液 0． 5、1．
0、1． 5、2． 0 和 2． 5mL 置于 10mL 容量瓶中，加入 5mL1%
A1Cl3 甲醇液，加甲醇定容，于室温下显色 10min后，以相应
试剂为空白，在 417nm 测定吸光度。以对照品溶液浓度对
吸光度进行线性回归，回归方程为:Y = 0． 329X + 0． 189，Ｒ
= 0． 999 4，线性范围:0． 030 1 ～ 0． 150 4mg·mL-1。
2． 5 含量测定
称取 10g干燥长叶胡颓子粉末，按照供试品制备方法
提取。移取 lmL供试品溶液，加甲醇定容至 10mL，以甲醇
作空白，于 417nm处测吸光度。根据线性回归方程计算长
叶胡颓子总黄酮含量。
2． 6 提取工艺研究
选取乙醇浓度、浸泡时间、料液比、回流时间、回流温度及
回流次数 6个可能影响提取效果的因素做单因素试验。以总
黄酮得率为考察指标，确定各因素变化陡峭的趋势节点。
2． 6． 1 乙醇浓度考察 精密称取 5份粉末各 10g，料液比
为 1∶ 10 的不同浓度乙醇在回流温度 70℃时回流提取 1
次、60min /次，分别考察乙醇浓度 60%、70%、80%、90%、95%
对总黄酮含量影响，绘制黄酮得率与乙醇浓度关系曲线，结果
显示乙醇浓度在 70% ～95%范围时，曲线变化陡峭。
2． 6． 2 料液比考察 精密称取 5 份粉末各 10g，95%乙醇
浓度在回流温度 70℃时回流提取 1次、60min /次，分别考察
料液比为 1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30，对总黄酮得率
影响，绘制黄酮得率与料液比关系曲线，结果显示料液比为
1∶ 10 ～ 1∶ 20时，曲线变化陡峭。
2． 6． 3 回流时间考察 精密称取 5份粉末各 10g，料液比
为 1∶ 10 的 95%乙醇浓度在回流温度 70℃时提取 1 次，分
别考察回流时间 20、30、50、70、90min，对总黄酮含量影响，
绘制黄酮含量与回流时间关系曲线，结果显示回流时间为
30 ～ 70min时，曲线变化陡峭。
2． 6． 4 浸泡时间考察 精密称取 5份粉末各 10g，料液比
为 1∶ 10 的 95%乙醇在回流温度 70℃时回流 1 次，30min /
次，分别在提取之前浸泡 0、2、4、6、8h，考察其对总黄酮含量
影响，绘制黄酮含量与浸泡时间关系曲线，结果显示浸泡时
间为 2 ～ 6h时，曲线变化陡峭。
2． 6． 5 回流温度 精密称取 5 份粉末约 10g，料液比为 1
∶ 10的 95%乙醇浓度回流提取 1 次，30min /次，考察回流
温度分别为 50、60、70、80、90℃时，对总黄酮含量影响，绘制
黄酮含量与回流温度关系曲线，结果显示温度为 60 ～ 80℃
时，曲线变化陡峭。
2． 6． 6 回流次数考察 精密称取 5份粉末各 10g，料液比
为 1∶ 10 的 95%乙醇浓度为在温度为 70℃时，回流时间为
30min /次，考察次数分别为 1、2、3、4、5 次时黄酮含量与回
流次数关系曲线，结果显示回流次数为 1 ～ 3 次时，曲线变
化陡峭。
2． 6． 7 结论 通过单因素考察，确定各影响因素的实验
范围，乙醇浓度:80% ～ 95%，料液比:1∶ 10 ～ 1∶ 20，回流
时间:30 ～ 70min，浸泡时间:2 ～ 6h，回流温度:60 ～ 80℃，回
流次数:1 ～ 3 次。
2． 6． 8 Plackett-Burman 实验设计筛选主要影响因素
①因素及水平范围:根据 Plackett-Burman 实验设计，选取 6
个实验因素(A．乙醇浓度，B． 料液比，C． 回流时间，D． 浸泡
时间，E．回流温度，F． 回流次数)5 个空白因素(G、H、I、J、
K) ，合计 12次实验。根据单因素结果确定每个因素高、低
2个水平。用 Design expert 8． 0 软件设计实验并进行数据
处理。P-B实验设计因素及水平见表 1。②P-B试验设计与
结果 6个因素与 5 个空白因素合计 12 次实验，按照 P-B 设
计表进行试验设计，每个试验号重复 3 次，计算总黄酮含量
平均值。Plackett-Burman实验设计及响应值见表 2，运用 De-
sign expert 8． 0 软件对各因素进行显著性分析，结果显示 P ＜
0． 05的因素为主要影响因素。各因素显著性分析结果见表
2。结论:对各因素的显著性分析可以看出，各因素对响应值
—22—
(总黄酮含量)影响的显著性顺序为:A ＞ B ＞ E ＞ D ＞ C ＞ F。
表 1 Plackett-Burman设计因子的水平范围
Levels A B C D E F G H I J K
-1 70 10 30 2 60 1 - - - - -
1 95 20 70 6 80 3 - - - - -
表 2 各因素显著性检验
Factors P1(总黄酮 )
A 0． 00013
B 0． 00065
C 0． 0214
D 0． 01239
E 0． 00147
F 0． 04714
G 0． 09741
H 0． 07845
I 0． 08413
J 0． 07412
K 0． 05417
2． 6． 9 星点设计(CCD)优选工艺 ①星点设计(CCD)
因素、水平及结果:根据 Plackett-Burman 筛选结果，结合星
点设计(CCD)效应面法适用条件，选定三个主要因素即:A
(乙醇浓度) :70% ～ 95%，B(料液比) :1∶ 10 ～ 1∶ 20，E(回
流温度) :60 ～ 80℃，Y(总黄酮含量)为评价指标，优选最佳
工艺条件。星点设计因素与水平见表 3，星点实验设计与结
果见表 4。②回归分析及结论:通过对拟合模型的优化，剔
除不显著因素，对原方程二次回归拟合，经方差分析结果显
示 Pr ＞ F，此模型显著(P = 0． 0052 ＜ 0． 05) ，B(料液比)及
A2影响显著，其它因素影响不显著，其 Ｒ-Squared = 0． 9014
表明 90． 14%的实验数据的变异可以用此回归模型来解释，
实验过程中存在一定误差，大约有 9． 86%不能由此模型解
释。Lack of Fit F-value of 0． 47 表明模型失拟不显著。因
此回归方程:Y = 1． 52 － 0． 15A + 0． 40B － 0． 13C － 0． 17AC －
0． 37A2 － 0． 12B2。根据回归分析结果，图 1 －图 4 直观反映
了各因素对响应值总黄酮含量的影响，发现乙醇浓度和回
流温度交互影响对黄酮影响显著，曲面变化显著。运用 De-
sign expert 8． 0 软件响应面分析，优化最优值为:料液比为 1
∶ 18的 83%乙醇在 64℃回流 2 次，30min /次时，其总黄酮
含量预测值为 1． 93%。
表 3 星点设计因素与水平
Levels
Factors
A(%) B(倍) E(℃)
－ 1． 732 70 10 60
－ 1 75 12 64
0 83 15 70
1 90 18 76
1． 732 95 20 80
2． 6． 10 实验复证 称取 10g 药材，按照优选工艺参数并
结合生产实际对工艺参数进一步优化(乙醇浓度 80% ～
85%，料液比为 1∶ 15 ～ 1∶ 20，回流温度 60 ～ 65℃，回流 2
次，30min /次共进行 6次实验，取其平均值，计算偏差率，实
验结果见表 5。
表 4 星点试验设计与结果
run
actor1
A(%)
Factor2
B(倍)
Factor3
X3(℃)
Ｒesponse
Y(%)
1 0． 00 0． 00 0． 00 1． 52
2 － 1． 00 － 1． 00 1． 00 0． 51
3 0． 00 0． 00 0． 00 1． 87
4 1． 00 － 1． 00 － 1． 00 0． 54
5 1． 00 1． 00 － 1． 00 1． 35
6 1． 00 1． 00 1． 00 0． 54
7 － 1． 00 1． 00 1． 00 1． 98
8 0． 00 － 1． 73 0． 00 0． 65
9 0． 00 0． 00 1． 73 1． 25
10 1． 73 0． 00 0． 00 0． 64
11 0． 00 0． 00 0． 00 0． 89
12 1． 00 － 1． 00 1． 00 0． 12
13 － 1． 73 0． 00 0． 00 0． 51
14 0． 00 0． 00 0． 00 1． 21
15 0． 00 0． 00 － 1． 73 1． 64
16 0． 00 0． 00 0． 00 2． 21
17 － 1． 00 1． 00 － 1． 00 1． 51
18 0． 00 0． 00 0． 00 1． 91
19 － 1． 00 － 1． 00 － 1． 00 0． 84
20 0． 00 1． 73 0． 00 1． 97
图 1 AC对响应值 Y影响三维曲面
图 2 A对响应值 Y影响三维曲面
—32—
图 3 B对响应值 Y影响三维曲面
图 4 C对响应值 Y影响三维曲面
表 5 实验复证结果
类别 次数 A(%) B(倍) C(℃) 含量 ＲSD(%)
1 80 15 60 1． 86 2． 46
2 82 15 62 1． 97
总黄酮
3 82 16 62 1． 94
4 83 16 64 1． 93
5 83 18 64 1． 85
6 85 20 65 1． 91
3 结论
目前尚未见运用此法优选长叶胡颓子黄酮类成分的提
取工艺研究报道，效应面法是基于非线性模型设计的工艺
设计，实验精度高。此工艺设计是基于优选因素主效应而
进行的多因素、高低两个水平的实验设计，不仅可以提高实
验精度而且还可以提高实验的预测性［9］。本实验优选工艺
参数经过 6次重复试验，其工艺参数在合适范围内波动，其
总黄酮含量变化不大，提示此工艺条件可以作为工业生产
参考条件，具有可操作性。
根据目前有关长叶胡颓子黄酮类成分累计规律，本实
验药材采集于 2012 年 10 月，主要是考虑黄酮类成分此时
含量较多［10］。笔者考察了超声提取、回流提取两种提取方
法，结果显示后者提取效果好．由于黄酮在紫外有两个吸收
区，存在较多干扰，因此，为了提高实验精度，本实验考察了
A1Cl3 和 NaNO2-Al(NO3)3 比色法，结果显示前者芦丁对照
品溶液和供试品溶液的最大吸收波长相差在 5nm 以内，而
后者芦丁对照品在 450nm 左右有最大吸收，而供试品在此
波长范围为吸收很弱，因此确定显色方法为 A1Cl3。
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(责任编辑:姜付平)
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